成 璐，歐陽(yáng)壽強(qiáng)

（揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

番茄是全球最主要的蔬菜作物之一，其營(yíng)養(yǎng)豐富，栽培技術(shù)成熟，在我國(guó)被廣泛種植。番茄枯萎病是由土傳真菌病原物尖孢鐮刀菌番茄專(zhuān)化型（Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici，F(xiàn)ol）通過(guò)侵染番茄根系引起的番茄病害。Fol病原菌致病力強(qiáng)且發(fā)病范圍廣泛，被研究者列為世界上第3大土傳病原真菌，所導(dǎo)致的番茄枯萎病給番茄生產(chǎn)造成了巨大損失[1-2]。尖孢鐮刀菌的寄主范圍非常廣泛，可引起茄科、瓜類(lèi)、豆科及花卉等100多種植物枯萎病的發(fā)生。在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，設(shè)施蔬菜瓜果類(lèi)作物由于在相對(duì)封閉的環(huán)境下生長(zhǎng)，特殊的小氣候雖有利于農(nóng)作物生長(zhǎng)，但也促進(jìn)了各種病蟲(chóng)害的滋生，加之長(zhǎng)年連作，土壤中病原菌的數(shù)量不斷增加，導(dǎo)致設(shè)施栽培蔬菜的枯萎病發(fā)生越來(lái)越嚴(yán)重。由尖孢鐮刀菌番茄專(zhuān)化型病原菌引起的枯萎病是番茄生產(chǎn)上最嚴(yán)重的真菌病害之一，研究番茄—尖孢鐮刀菌互作的分子機(jī)制對(duì)番茄農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要的理論意義。本文根據(jù)國(guó)內(nèi)外番茄抗枯萎病的病原及其致病機(jī)制、寄主抗病機(jī)制進(jìn)行了總結(jié)概述，以期為番茄抗枯萎病分子育種及綠色防控提供參考和借鑒。

1 番茄枯萎病病原研究進(jìn)展

枯萎病病原菌有細(xì)菌性病原菌和真菌性病原菌2種，本文主要闡述的番茄枯萎病病原菌為真菌性病原菌[3]。尖孢鐮刀菌為真菌性病原，屬半知菌類(lèi)（Fungi Imperfecti）、梗孢目（Moniliales）、痤孢科（Tuberculariaceae）、鐮刀菌屬（Fusarium）[4]。早在1940年，研究人員就發(fā)現(xiàn)并提出番茄枯萎病真菌病原菌存在生理小種的理論[5]，番茄枯萎病病原菌主要包括2個(gè)生理小種：1號(hào)生理小種和2號(hào)生理小種，屬近等位基因系品種，廣泛分布于美國(guó)大部分地區(qū)以及以色列、日本、加拿大、澳大利亞等地，而我國(guó)主要以1號(hào)生理小種為主[6-8]。番茄枯萎病主要是由尖孢鐮刀菌番茄專(zhuān)化型病原菌引起的，通常尖孢鐮刀菌只能在一種植物宿主上引起枯萎病[9]，其孢子形態(tài)主要有3種：小型分生孢子、大型分生孢子和厚垣分生孢子[10]?？菸〔≡饕跃z體、分生孢子、厚垣孢子的形式在農(nóng)具、種子及土壤中傳播。侵染時(shí)，孢子萌發(fā)管或菌絲體通過(guò)根部進(jìn)入植物體內(nèi)，在根皮層細(xì)胞間侵染至木質(zhì)部，再通過(guò)木質(zhì)部導(dǎo)管蔓延至莖稈及頂部，最終導(dǎo)致植株維管堵塞、葉片氣孔關(guān)閉、葉片萎蔫，甚至整株死亡[11]。

2 尖孢鐮刀菌致病機(jī)制

尖孢鐮刀菌成功侵入寄主植物需要經(jīng)過(guò)一系列過(guò)程：首先通過(guò)根部侵入寄主植物，在此過(guò)程中會(huì)分泌毒素、細(xì)胞壁降解酶等物質(zhì)，降低寄主防御機(jī)制并在寄主體內(nèi)定植，寄主植物感知信號(hào)，葉片由下而上變黃，最后致使植株萎蔫死亡[12]。

2.1 尖孢鐮刀菌定植機(jī)制

2.1.1 尖孢鐮刀菌分泌致病毒素

毒素是植物病原真菌重要的致病因子，尖孢鐮刀菌侵入寄主后會(huì)分泌相關(guān)毒素物質(zhì)，如鐮刀菌屬真菌（Fusarium）分泌的非專(zhuān)化型毒素鐮刀菌酸（5-丁基-2-吡啶甲酸，F(xiàn)usaric acid，F(xiàn)A）能增加寄主細(xì)胞膜透性，降低粒體活性氧含量，阻止ATP合成，損傷植物根系，影響種子萌發(fā)，最終導(dǎo)致寄主植物死亡[13-14]，但低含量毒素能誘導(dǎo)植物合成植保素[15]。在尖孢鐮刀菌番茄專(zhuān)化型中發(fā)現(xiàn)了編碼F-box毒素蛋白基因FRP1，它的缺失使Fol的毒力下降，侵入能力也受到一定影響[16]。

2.1.2 細(xì)胞壁降解酶破壞植物細(xì)胞壁

在病原菌侵染寄主植物致病的過(guò)程中，病原菌可通過(guò)分泌一系列細(xì)胞壁降解酶，侵入寄主植物的細(xì)胞壁，侵染植物使其發(fā)病。鐮刀菌分泌的細(xì)胞壁降解酶主要包括果膠酶（Pectic enzyme）、纖維素酶（Cellulase）、半纖維素酶（Hemi cellulase）、角質(zhì)酶（Cutinase）和其他酶類(lèi)，如蛋白酶（Protease）等[17]。一般情況下，植物鐮刀菌的單個(gè)細(xì)胞壁降解酶基因缺失對(duì)鐮刀菌毒力沒(méi)有太大影響[18-19]，其原因在于鐮刀菌可能通過(guò)調(diào)節(jié)其他細(xì)胞壁降解酶的表達(dá)來(lái)彌補(bǔ)這個(gè)基因功能；若同時(shí)敲除2個(gè)或多個(gè)編碼細(xì)胞壁降解酶的基因，突變株的致病力則會(huì)顯著降低[20-21]。引起小麥赤霉病的禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）的PG1和Xyl基因分別編碼Pg（內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶）和調(diào)節(jié)因子用于調(diào)控木聚糖酶的產(chǎn)生，單基因敲除Pg1或xyr1，其酶活性均明顯降低，但敲除菌株致病力卻未減弱，若將2個(gè)基因同時(shí)敲除，則發(fā)現(xiàn)其毒力明顯降低[22]；此外，敲除調(diào)控細(xì)胞壁降解酶功能的上游基因也能導(dǎo)致突變株的致病力變?nèi)?，如SNF1（sucrose non-fermenting 1）基因編碼的SNF1蛋白激酶可以解除碳分解代謝阻遏現(xiàn)象，當(dāng)敲除SNF1后，相關(guān)細(xì)胞壁降解酶的表達(dá)水平降低，從而鐮刀菌對(duì)甘藍(lán)及擬南芥的致病力變?nèi)鮗23-24]。將番茄枯萎病菌中編碼F-box蛋白的基因Frpl敲除后，突變體中編碼果膠酶的PL1、PG1、PG2基因和編碼木聚糖酶的XYL2、XYL5基因的表達(dá)降低，CWDES基因的表達(dá)下降，侵染能力減弱，影響病菌在植物根部的定植和萌發(fā)[25-26]。

2.1.3 尖孢鐮刀菌定植

尖孢鐮刀菌侵入寄主植物后，需要在寄主體內(nèi)定植才能進(jìn)行下一步的浸染。真菌細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（YERK1）亞家族成員促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）Fmk1被敲除后，其突變體菌株在番茄果實(shí)組織上的侵入性生長(zhǎng)減少，且果膠酸裂解酶編碼基因Pl1轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，其分生孢子不能分化為穿透菌絲，導(dǎo)致番茄根附著定植能力嚴(yán)重受損[27]。Fow1是第1個(gè)被鑒定對(duì)植物真菌病原毒力起決定性作用的線粒體蛋白基因，其所編碼的蛋白是尖孢鐮刀菌定植番茄組織所必需的[28]。Fow2所編碼的鋅指蛋白家族中的真菌轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控尖孢鐮刀菌病原體侵染宿主的過(guò)程，還影響了病原菌侵入和定植植物組織的能力[29]。

2.2 信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制

病原菌在侵染植物時(shí)，會(huì)根據(jù)寄主植物的特點(diǎn)來(lái)調(diào)整自身的代謝過(guò)程，以達(dá)到成功侵染寄主的目的，而這些調(diào)控都是在信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的指令下完成的。病原菌信號(hào)傳導(dǎo)途徑主要有2個(gè)：環(huán)腺苷酸單磷酸-蛋白激酶A（cAMP-PKA）和促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)途徑，前者主要調(diào)控病原菌孢子的形成，而后者主要調(diào)控細(xì)胞延伸，兩者均參與病原菌的侵染過(guò)程[30]。真菌具有羥基化類(lèi)固醇的能力，在尖孢鐮刀菌等一些絲狀真菌中，黃體酮誘導(dǎo)一種酶系統(tǒng)，將化合物轉(zhuǎn)化為毒性較低的羥基化產(chǎn)物。如Δfgb1突變體菌株中未誘導(dǎo)類(lèi)固醇羥基化，暗示G蛋白β亞基在黃體酮信號(hào)傳導(dǎo)中起著重要功能，而外源cAMP能恢復(fù)Δfgb1菌株中黃體酮轉(zhuǎn)化活性的誘導(dǎo)，表明cAMP-PKA途徑介導(dǎo)了尖孢鐮刀菌中的類(lèi)固醇信號(hào)傳導(dǎo)[31]。此外，絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路可調(diào)控氨基糖和核苷酸糖代謝、糖胺聚糖降解、碳源和磷酸肌醇代謝通路及戊糖和葡糖醛酸鹽轉(zhuǎn)換，繼而影響尖孢鐮刀菌香蕉專(zhuān)化型（Fusarium oxysp orum f. sp. cubense，F(xiàn)oc）病原菌的生長(zhǎng)發(fā)育和致病性[32]。

3 番茄抗枯萎病機(jī)制

番茄寄主對(duì)枯萎病菌侵染后的反應(yīng)是全方位、多方面的，表現(xiàn)為初級(jí)代謝的改變，啟動(dòng)和增強(qiáng)抗性相關(guān)基因的表達(dá)，從而獲得不同程度的免疫性。

3.1 寄主分泌抗真菌化合物

番茄在被病原菌侵染時(shí)分泌的抗真菌化合物（即α-番茄堿）能夠與真菌細(xì)胞膜形成固醇復(fù)合物，導(dǎo)致真菌毛孔和細(xì)胞內(nèi)容物泄漏，從而抵御Fol的入侵[33]；此外，番茄體內(nèi)的細(xì)胞壁結(jié)合態(tài)酚在受病原物入侵時(shí)，通過(guò)合成植保素、木質(zhì)素、類(lèi)黃酮等物質(zhì)提高番茄抗病性[34]。另外，番茄毛狀根中的酚類(lèi)代謝物對(duì)于抗枯萎病也至關(guān)重要，其可增強(qiáng)番茄植株和根毛部木質(zhì)素的細(xì)胞壁沉積，如4-羥基苯甲酸、香草酸、4-羥基苯甲醛、香草醛和4-香豆酸等[35]。

3.2 激發(fā)寄主信號(hào)傳導(dǎo)途徑及保衛(wèi)反應(yīng)

植物免疫力通常由被認(rèn)為是免疫激素的物質(zhì)來(lái)定義，如水楊酸（SA）、茉莉酸（JA）、乙烯（ET）等對(duì)病原體的防御反應(yīng)有不同的調(diào)節(jié)作用。植物激素在番茄與尖孢鐮刀菌的互作中也起著重要的作用[36]。不能產(chǎn)生ET（ACD過(guò)表達(dá)）或感知不到這類(lèi)激素（Nr突變體）的番茄植株，接種Fol后比野生型植株發(fā)病癥狀顯著減輕，相反，番茄植株若在積累SA（NahG）的能力上受到損害，則對(duì)Fol高度敏感[36]。Fol侵染番茄后，番茄體內(nèi)水楊酸含量增多，維管褐變和葉片黃化萎蔫的現(xiàn)象顯著減少[37]。JA生物合成中受損的def1突變體番茄植株接種Fol后與對(duì)照處理相比，在疾病發(fā)展方面沒(méi)有差異，暗示JA似乎不參與這種相互作用；此外，F(xiàn)ol對(duì)ACD和Nr番茄植株莖的定植程度較低，而對(duì)NahG植物的定植范圍比野生型植物更廣[36]。通常，抗病品種形成保衛(wèi)反應(yīng)較早且速度較快，在感病品種中只出現(xiàn)部分保衛(wèi)反應(yīng)且速度較慢；此外，最新的研究報(bào)道番茄內(nèi)生真菌（Endophyte-Mediated Resistance，EMR）對(duì)尖孢鐮刀菌的抗性不依賴(lài)于ET、JA和SA，表明這種對(duì)枯萎病的誘導(dǎo)抗性反應(yīng)不同于經(jīng)典的誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性（Induced Systemic Resistance，ISR）反應(yīng)，為控制番茄枯萎病提供了不依賴(lài)于常規(guī)防御途徑的可能性[36]。

3.3 寄主抗性基因誘導(dǎo)表達(dá)

早在1929年，研究人員從番茄野生型Lycopersicon esculentum Mill.的一個(gè)突變體PI79522中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)顯性抗病基因I（Immunity），且抗性是由單個(gè)顯性基因決定的，雜交后代的抗性無(wú)法降低[37-39]。隨后又發(fā)現(xiàn)番茄枯萎病病原真菌分泌的效應(yīng)子可以觸發(fā)寄主ETI（Effector-Triggered Immunity）免疫反應(yīng)，或抑制寄主抗性基因（Resistant gene, R）的表達(dá)。目前，番茄基因組中已有多個(gè)R基因被鑒定，應(yīng)答不同F(xiàn)ol生理小種，分別為I 、I-1、I-2、I-3[38]。Fol侵入番茄后，在番茄木質(zhì)部中分泌蛋白效應(yīng)子Avr3 蛋白，誘導(dǎo)宿主的I-3抗性基因大量表達(dá)，從而誘導(dǎo)番茄啟動(dòng)防御機(jī)制；同時(shí)，AVR1基因編碼的蛋白效應(yīng)子不僅與I-1基因相對(duì)抗，同時(shí)也會(huì)抑制I-2和I-3介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[40]。Fol侵染番茄時(shí)，番茄內(nèi)源miRNA（如Sly-miR5300和Sly-miR482e-3p）的表達(dá)被抑制，其靶向的編碼NBS-LRR類(lèi)抗病蛋白的R基因表達(dá)水平上調(diào)，通過(guò)負(fù)調(diào)控的方式參與了番茄抗枯萎病的過(guò)程[41-42]；此外，Sly-miR482e-3p還能調(diào)控其靶基因SlSGT1 的表達(dá)，通過(guò)介導(dǎo)乙烯信號(hào)傳遞通路以應(yīng)答病原菌入侵[43]。

4 展望

目前，關(guān)于農(nóng)作物枯萎病的防治方法主要有生物防治、物理防治和化學(xué)防治，但這些防治效果較緩慢，易對(duì)環(huán)境造成污染，且在番茄果實(shí)上有殘留，影響人體健康?；赗NA的研究進(jìn)展發(fā)現(xiàn)，RNAi（RNA Interference）是基因轉(zhuǎn)錄后沉默作用（Post-Transcription Gene Silence, PTGS）的重要機(jī)制之一，是近年來(lái)重要的生物學(xué)發(fā)現(xiàn)之一。RNAi主要通過(guò)dsRNA特異阻斷體內(nèi)特定基因表達(dá)，由mRNA降解誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型[44]。在真菌中參與RNAi作用機(jī)制的蛋白主要有AGO、DCL和RDR[45]。真菌病害如灰霉菌（B. cinerea）能主動(dòng)吸收環(huán)境中外源sRNA，并靶向調(diào)控Bc-DCL1 和Bc-DCL2表達(dá)，從而影響病原菌對(duì)番茄的侵染過(guò)程[46]。由此，科學(xué)家提出了噴霧誘導(dǎo)的基因沉默（Spray-Induced Gene Silencing，SIGS）概念，為未來(lái)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)病蟲(chóng)害防治提出了全新的方向[47]；此外，研究表明，尖孢鐮刀菌FolRDR1與病原菌致病力密切相關(guān)，且FolRDR1與其他尖孢鐮刀菌生理小種，如尖孢鐮刀菌香蕉專(zhuān)化型、尖孢鐮刀菌黃瓜專(zhuān)化型、尖孢鐮刀菌蘿卜專(zhuān)化型等高度保守，可作為開(kāi)發(fā)基于RNAi的新型環(huán)境友好型廣譜生物制劑的理想靶標(biāo)[48-52]。

隨著時(shí)代發(fā)展，我國(guó)農(nóng)業(yè)和生態(tài)環(huán)保產(chǎn)業(yè)逐步實(shí)現(xiàn)了協(xié)同發(fā)展，農(nóng)作物病蟲(chóng)害綠色防控理念和技術(shù)被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)植保建設(shè)之中，推動(dòng)了我國(guó)社會(huì)各產(chǎn)業(yè)均衡發(fā)展。實(shí)施綠色防控是貫徹“公共植?！焙汀熬G色植保”理念的重大舉措，是發(fā)展現(xiàn)代農(nóng)業(yè)、建設(shè)“資源節(jié)約、環(huán)境友好”兩型農(nóng)業(yè)的有效途徑。隨著對(duì)番茄抗枯萎病研究的不斷深入，借助于現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)與手段，致力于科學(xué)地運(yùn)用RNAi技術(shù)生產(chǎn)生物制劑的開(kāi)發(fā)并投入實(shí)際應(yīng)用中，還需要科研人員進(jìn)一步潛心研究。