黃慶華 謝浩東 孫世平 孫守禮 崔寧 許傳田 成炳才 李文峰 李建和 李超

摘 要：禽流感（avian influenza， AI）是由禽流感病毒（avian influenza virus， AIV）引起的一種以侵害呼吸系統(tǒng)為主的疾病，是集約化養(yǎng)雞場的重要疫病之一。本研究分別建立H9N2亞型AIV感染MDCK細(xì)胞和雞胚模型，探討研發(fā)的中獸藥復(fù)方制劑對H9N2 AIV的抑制作用。結(jié)果顯示，中獸藥復(fù)方制劑具有良好的安全性，制劑原液和各個稀釋度對雞胚基本沒有毒性，制劑原液（200 mg/mL）稀釋102倍至2 mg/mL以下對體外培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞基本無毒性;制劑原液（200 mg/mL）稀釋104倍至0.02 mg/mL均能有效抑制H9N2 AIV在雞胚中的增殖，稀釋105倍至0.002 mg/mL仍然對H9N2 AIV在MDCK細(xì)胞上的復(fù)制具有良好的預(yù)防和治療效果，且預(yù)防效果優(yōu)于治療效果。結(jié)果表明本研究制備的中獸藥復(fù)方具有良好的抗H9N2 AIV效果。

關(guān)鍵詞：中獸藥復(fù)方;H9N2 AIV;MDCK;雞胚

中圖分類號：S853.9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B文章編號：1673-1085（2021）9-0005-07

流感病毒（influenza virus， IV）為RNA病毒，基因組由8條單股負(fù)鏈RNA構(gòu)成，每個片段編碼一種或兩種蛋白質(zhì)。表面糖蛋白血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）是將甲型流感病毒分為亞型的基礎(chǔ)[1]。根據(jù)病毒HA和NA的抗原性差異，AIV可劃分為18個HA亞型和11個NA亞型。H9N2亞型禽流感（avian influenza， AI）是由H9N2亞型禽流感病毒（avian influenza virus， AIV）引起的一種禽類病毒性傳染病，被認(rèn)為是集約化養(yǎng)雞場的重要疫病之一，該病廣泛分布于世界各地，威脅著養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展，常常造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2， 3]。據(jù)統(tǒng)計，1996～2000年間，H9N2 AIV感染的雞群占93.89%，這表明從19世紀(jì)末到20世紀(jì)初，H9N2是影響家禽養(yǎng)殖的主要亞型。直到今天，除了臭名昭著的H5N1和新興的H7N9新秀之外，H9N2仍然是破壞家禽業(yè)的三種主要AI亞型之一?？梢哉f，H9N2 AIV是全球家禽群體中檢測到的最常見的流感病毒亞型[4]。

單純H9N2 AIV疫苗不能100%控制發(fā)病，養(yǎng)殖場生物安全不到位，或者飼養(yǎng)管理操作不當(dāng)，都會給雞群造成一定的應(yīng)激，就有可能導(dǎo)致禽流感爆發(fā)。同時由于病原不斷產(chǎn)生變異，流感疫苗研發(fā)的速度往往跟不上病原變異速度，導(dǎo)致許多養(yǎng)殖場雖然免疫了疫苗，偶爾還會爆發(fā)禽流感[5]。近期，臨床上出現(xiàn)許多呼吸道癥狀的家禽病例，剖檢可見雞喉頭栓塞和氣管環(huán)出血，通過實驗室病毒分離和分子生物學(xué)檢測鑒定為H9N2 AIV和其他病原如傳染性支氣管炎、支原體等的混合感染導(dǎo)致，進(jìn)一步加重流感病情[6]。家禽病毒病在臨床中發(fā)生后，沒有特效的藥物療法，發(fā)病后及時采用對癥進(jìn)行治療可顯著減低動物死亡率。雖然在生產(chǎn)過程中適當(dāng)添加抗生素可以在一定程度上降低該病病癥，但應(yīng)用抗生素主要是針對病毒感染引起的并發(fā)癥，而且隨著大量抗菌藥特別是廣譜抗菌藥在養(yǎng)殖業(yè)中的廣泛應(yīng)用，抗菌藥物的耐藥性問題日趨突出[7]。我國自然資源十分豐富，中草藥的使用歷史可以追溯到人類文明的起源，中獸藥及其副產(chǎn)品無疑將成為我國抗生素替代品開發(fā)得天獨厚的資源。中藥具有靶點多、種類多、成本低、耐藥性低、副作用小等獨特優(yōu)勢，有望在對抗AIV的過程中發(fā)揮重要作用[8]。

針對以上情況，山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽健康養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院研發(fā)了一種針對家禽病毒病尤其是對呼吸系統(tǒng)疾病有抑制作用的中獸藥復(fù)方制劑。本研究在MDCK細(xì)胞和雞胚中評價該中獸藥組方抗H9N2 AIV的作用，旨在為新藥研發(fā)和臨床應(yīng)用提供試驗依據(jù)。

1 材料

1.1 測試藥物

山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽健康養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院研發(fā)中獸藥復(fù)方，主要由板藍(lán)根、金銀花、魚腥草、甘草等9種中藥組成，由銀翹散、麻杏石甘湯、二陳湯加減，根據(jù)家禽生理特點，氣管長痰液不易咳出，加強了化痰、平喘、控制炎性滲出藥物;易出現(xiàn)肺炎、肺壞死、黑肺、肺纖維化、支氣管栓塞等肺部病變，加強潤肺瀉肺藥物;腎為生痰之根，脾為生痰之源，培土生金，補水潤金，添加健脾補腎利濕藥物。用傳統(tǒng)水提法將中藥復(fù)方熬制成1 mL含200 mg生藥的藥液（即200 mg/mL），用0.22 μm濾膜過濾除菌，以此為待測藥物初始濃度。

1.2 細(xì)胞株

MDCK細(xì)胞由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所畜禽疫病防控團(tuán)隊病原生態(tài)學(xué)方向保存，生長液為含有5% FBS的DMEM，培養(yǎng)條件37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱。

1.3 病毒株

H9N2 AIV流行株A/Chicken/Shandong/903（CK/SD/903）由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所畜禽疫病防控團(tuán)隊病原生態(tài)學(xué)方向分離純化和保存。

1.4 雞胚

SPF雞胚購自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所SPF雞場，在本研究室孵化至10日齡。

1.5 雞紅細(xì)胞懸液

1%雞紅血球由本研究室采集成年公雞血液制備，用于收獲的病毒液HA測定。

1.6 主要試劑、耗材和儀器

試劑包括DMEM培養(yǎng)基、小牛血清、青霉素（80 IU）、鏈霉素（100 IU）、無菌PBS等。耗材和儀器包括吸管、小試管、微量移液器、細(xì)胞培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀等。

2 方法

2.1藥物對細(xì)胞毒性的測定

將MDCK細(xì)胞接種于96孔板中，過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞剛鋪滿單層，將藥物用DMEM進(jìn)行10倍倍比稀釋，從10-1稀釋到10-5共5個稀釋梯度;用PBS（含雙抗）溶液輕輕洗滌96孔板中的MDCK細(xì)胞3次，每孔100 μL;將不同稀釋度藥物加入細(xì)胞，每孔100 μL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中維持培養(yǎng)3～5 d，利用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖，評價藥物對MDCK細(xì)胞的毒性。

2.2藥物對雞胚的安全性評價

將藥物用PBS（含雙抗）進(jìn)行10倍倍比稀釋，從原液稀釋到10-2共3個稀釋梯度;按照100 μL/胚的劑量接種10日齡SPF雞胚，去掉24 h以內(nèi)死亡的雞胚，記錄雞胚死亡情況，并在5 d后觀察雞胚發(fā)育情況，評價藥物對雞胚的安全性。

2.3 H9N2 AIV組織半數(shù)感染量（TCID50）測定

將MDCK細(xì)胞接種于96孔板中，過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞剛鋪滿單層，將H9N2 AIV用PBS（含雙抗）進(jìn)行10倍倍比稀釋，從10-1稀釋到10-11共11個稀釋梯度;用PBS（含雙抗）溶液輕輕洗滌96孔板中的MDCK細(xì)胞3次，每孔100 μL;將稀釋完的病毒依次接種到鋪滿單層MDCK細(xì)胞的96孔板中，每孔100 μL，每個病毒稀釋梯度4個重復(fù)，96孔板第12排孔作為陰性對照，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h;吸棄96孔板中的病毒液，加100 μL PBS（含雙抗）洗滌一次，棄掉洗液后每孔加入200 μL含2 μg/ml TPCK-treated 胰酶的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h;用1%紅細(xì)胞測檢測細(xì)胞上清血凝效價，按Reed-Muench法計算TCID50。

2.4H9N2 AIV雞胚半數(shù)感染量（EID50）測定

將H9N2 AIV用PBS（含雙抗）進(jìn)行10倍倍比稀釋，從10-5稀釋到10-10共6個稀釋梯度，接種10日齡SPF雞胚，每個稀釋度接5枚雞胚，每胚100 μL，去掉24 h以內(nèi)死亡的雞胚，在5 d后收集尿囊液測定病毒效價，按Reed-Muench法計算EID50。

2.5 藥物在MDCK細(xì)胞上抗H9N2 AIV效果評價

根據(jù)測定的TCID50建立H9N2 AIV感染MDCK細(xì)胞模型，進(jìn)行抗病毒效果評價。鋪板MDCK細(xì)胞，待細(xì)胞長至80%，分為預(yù)防和治療2個組：預(yù)防組為先在細(xì)胞中加入不同濃度中藥，12～24 h接種病毒;治療組為先接種病毒，吸附2 h后加入不同濃度中藥。培養(yǎng)3～5 d后測定細(xì)胞上清中的血凝效價。

2.6藥物在雞胚內(nèi)抗H9N2 AIV效果評價

根據(jù)測定的EID50建立H9N2 AIV感染雞胚模型，進(jìn)行抗病毒效果評價。將藥物分別進(jìn)行10倍倍比稀釋后，與H9N2 AIV進(jìn)行等量混合，按照200 μL/胚的劑量接種10日齡SPF雞胚。去掉24 h以內(nèi)死亡的雞胚，記錄雞胚死亡情況，在5 d后收集尿囊液測定病毒血凝效價，并觀察雞胚發(fā)育情況。

3 結(jié)果與分析

3.1 藥物對MDCK細(xì)胞毒性測定結(jié)果

測定結(jié)果見圖1。藥物對MDCK細(xì)胞毒性作用表現(xiàn)為細(xì)胞折光性增加，細(xì)胞變圓、粘連、脫落、破碎，吸光值明顯下降。由圖1可知，該中藥液進(jìn)行10倍稀釋對細(xì)胞毒性很大，存活細(xì)胞很少，進(jìn)行102倍以上稀釋未見明顯的細(xì)胞毒性，進(jìn)行104和105倍稀釋對細(xì)胞增殖有一定的促進(jìn)作用。即該中獸藥復(fù)方制劑對MDCK細(xì)胞的最大安全濃度為2 mg/mL。

3.2 藥物對雞胚安全性評價

安全性試驗結(jié)果見圖2。與空白對照組雞胚

（圖2 D）相比，制備的中獸藥制劑原液（圖2 A）以及經(jīng)過10倍（圖2 B）和102倍（圖2 C）稀釋后使用，均不影響雞胚發(fā)育，雞胚均無死亡。由此可見，該中獸藥復(fù)方制劑在200 mg/mL的劑量范圍內(nèi)均具有很好的安全性，對雞胚基本沒有毒性。

3.3 藥物抑制H9N2 AIV在MDCK細(xì)胞上增殖

按照藥物對MDCK細(xì)胞毒性測定結(jié)果，該中獸藥制劑進(jìn)行102倍以上稀釋無細(xì)胞毒性。因此在MDCK細(xì)胞上進(jìn)行藥物抗H9N2 AIV作用評價研究需要將藥物稀釋102倍至2 mg/mL以上，結(jié)果見圖3。在預(yù)防組中，即先加入藥物后接種病毒，藥物稀釋104倍和105倍對病毒的預(yù)防效果分別為100%和66.7%，差異均顯著（圖3-Prevention）。在治療組中，即先接種病毒后加入藥物，在病毒吸附2 h后，藥物稀釋104倍接種MDCK細(xì)胞，藥物對病毒增值的抑制率為66.7%，差異顯著;病毒吸附2 h后，藥物稀釋105倍，接種MDCK細(xì)胞，仍然能夠在一定程度上抑制病毒增值，抑制率為31.25%（圖3-Treat）。結(jié)果表明該中獸藥復(fù)方對H9N2 AIV的預(yù)防和治療效果均良好。

3.4 藥物抑制H9N2 AIV在雞胚內(nèi)增殖

結(jié)果如圖4和表1所示，該中獸藥制劑原液200 mg/mL進(jìn)行101、102、103、104倍稀釋后均能夠有效控制H9N2 AIV在雞胚中的復(fù)制，對雞胚的保護(hù)率為100%，同時雞胚發(fā)育良好，進(jìn)一步說明該中獸藥復(fù)方制劑具有良好的抗H9N2 AIV效果和安全性。

4 討論與結(jié)論

本研究發(fā)明的中獸藥復(fù)方組方科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)，在古人傳統(tǒng)方劑基礎(chǔ)上根據(jù)家禽生理特點和發(fā)病規(guī)律做適當(dāng)加減或藥效加強，理論上可以治療多數(shù)由病毒性疾病和病原菌引起的呼吸系統(tǒng)疾病，H9N2 AIV引起的禽流感是造成家禽呼吸系統(tǒng)疾病的主要病原，它可以在MDCK細(xì)胞系和雞胚中進(jìn)行有效增殖[1]，所以本研究建立H9N2 AIV感染MDCK細(xì)胞和雞胚模型，并進(jìn)一步評價了該中獸藥復(fù)方對H9N2 AIV的抑制作用，旨在為呼吸系統(tǒng)新藥研發(fā)和臨床應(yīng)用提供試驗依據(jù)。

本研究首先評價該中獸藥復(fù)方制劑對MDCK細(xì)胞的毒性作用和對雞胚的安全性，結(jié)果表明，制備的中獸藥制劑原液（200 mg/mL）進(jìn)行102倍以上稀釋后對細(xì)胞基本無毒性，103倍以上稀釋后對細(xì)胞無毒性，中藥液原液、10倍和102倍稀釋后使用均不影響雞胚發(fā)育，雞胚均無死亡。由此可見，該中藥復(fù)方具有很好的安全性，對雞胚基本沒有毒性，但進(jìn)行細(xì)胞水平研究時需要進(jìn)行至少102倍以上稀釋。綜合細(xì)胞和雞胚的數(shù)據(jù)，該中藥復(fù)方藥物毒性很低，在臨床應(yīng)用時進(jìn)行102倍以上稀釋達(dá)到2 mg/mL的劑量可保證雞群的安全性。細(xì)胞試驗同時表明本研究實驗方法制備的提取液對細(xì)胞有一定的毒性，這是中藥普遍面臨的問題[9， 10]，如何去除中藥中有細(xì)胞毒性的成分以獲得理想的有效抗病毒成分仍有待于深入研究。

本中獸藥復(fù)方是由板藍(lán)根、金銀花、魚腥草、甘草等多種中藥組方提取而成，里面的抗病毒藥如板藍(lán)根，在臨床上應(yīng)用廣泛，具有抗菌、抗病毒的作用，可直接與流感病毒表面的血凝素結(jié)合，抑制流感病毒的活性[11]，板藍(lán)根含板藍(lán)根總生物堿、靛玉紅、落葉松樹脂醇B、葡萄糖苷等活性成分，直接抑制流感病毒的核輸出，通過抑制病毒介導(dǎo)的 NF-κB 通路的活化，抑制流感病毒誘導(dǎo)的炎癥因子達(dá)IL-6、TNF-α、IL-8、MCP-1， IP-10等的釋放[12， 13]，其中的α-葡聚糖還能通過提高體液免疫和細(xì)胞免疫功能增強機(jī)體抗病毒能力[14]。金銀花含木犀草苷、木犀草素等活性成分，對活化的NF-κB信號通路進(jìn)行正負(fù)反饋調(diào)節(jié)，減輕炎性損傷作用，同時影響TLR信號通路及凋亡相關(guān)因子表達(dá)[15， 16]。魚腥草和甘草含槲皮素等活性成分，通過與流感血凝素蛋白相互作用，抑制病毒與細(xì)胞融合[17]。本研究中制備的中藥液原液（200 mg/mL）稀釋104倍至0.02 mg/mL仍能對H9N2 AIV感染的雞胚提供100%的保護(hù)，稀釋105倍到0.002 mg/mL仍對H9N2 AIV在MDCK細(xì)胞上的復(fù)制具有良好的預(yù)防和治療效果，且預(yù)防效果優(yōu)于治療效果。結(jié)果證實本研究制備的中獸藥復(fù)方具有良好的抗H9N2 AIV效果。另外本復(fù)方根據(jù)家禽生理特點，加強了化痰、平喘、控制炎性滲出、潤肺瀉肺和健脾補腎利濕藥物，在直接抗病毒的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提升機(jī)體免疫力，若應(yīng)用到臨床應(yīng)該可以收到更加顯著的效果，在后續(xù)的研究中我們將通過動物實驗進(jìn)一步證實，并深入探討該中獸藥復(fù)方的作用機(jī)理。

綜上所述，本研究制備的中獸藥復(fù)方提取液對雞胚基本無毒副作用，并能明顯抑制H9N2 AIV在細(xì)胞和雞胚中的增殖，為臨床防治家禽呼吸系統(tǒng)疾病提供理想的抗病毒藥物。

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