體細(xì)胞胚發(fā)生與遺傳變異的研究進(jìn)展

陳菲

（河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院 河南，鄭州 450002）

1 引言

植物細(xì)胞經(jīng)過離體培養(yǎng)可引起體細(xì)胞胚胎發(fā)生，也被認(rèn)為是植物再生的普遍現(xiàn)象。體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)已經(jīng)在大豆、苜蓿、玉米等一些草本植物上應(yīng)用，在云杉和落葉松等一些針葉樹也達(dá)到接近規(guī)模化應(yīng)用的水平。隨著對基礎(chǔ)生物學(xué)知識了解的深入，人們對體細(xì)胞胚胎發(fā)生研究越來越深入，體細(xì)胞胚胎發(fā)生不僅會在植物生物學(xué)和遺傳轉(zhuǎn)化方面有著廣泛的應(yīng)用，在優(yōu)良種質(zhì)資源商業(yè)化繁殖方面也有著廣泛的應(yīng)用[1-3]。

2 體細(xì)胞胚發(fā)生的研究

2.1 植物體胚發(fā)生過程中的生理生化變化

2.1.1 多糖 糖類是誘導(dǎo)植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生不可缺少的重要成分。在植物體胚發(fā)生過程中，糖類不僅提供碳源、維持滲透壓，而且可能還起信號分子的作用。有研究表明胡蘿卜的外植體和非胚性愈傷組織，在所有體細(xì)胞胚發(fā)生過程中會產(chǎn)生2次多糖累積高峰，分別在胚性愈傷組織形成初期和球形胚后期，這2個(gè)過程均是高能耗過程，為胚體的進(jìn)一步發(fā)育和成熟胚萌發(fā)以及植株再生儲備能量[4]。

2.1.2 蛋白質(zhì) 植物體胚發(fā)生過程中既有特異的胚性蛋白質(zhì)的形成或消失也有蛋白質(zhì)含量上的變化[5]。有研究表明西洋參、香雪蘭、光棘豆以及草木犀的胚性愈傷組織中存在非胚性愈傷組織中沒有的特異蛋白質(zhì)[6]；而體胚發(fā)生過程中非胚性愈傷組織的蛋白質(zhì)含量和合成速率都低于胚性愈傷組織。如在石刁柏的體胚發(fā)生過程中，球形胚蛋白質(zhì)含量最低，成熟胚最高，說明胚胎發(fā)生到球形胚期，可溶性蛋白質(zhì)積累有高峰期，也是為胚胎下一步生長發(fā)育提供能能量保證[7]；另發(fā)現(xiàn)水稻胚性愈傷組織與非胚性愈傷組織相比，水溶性和鹽溶性蛋白質(zhì)含量都較高，醇溶性和堿溶性蛋白質(zhì)含量較低于非胚性愈傷組織并且在繼代中表現(xiàn)穩(wěn)定[8]。另外在植物體細(xì)胞胚的發(fā)生、發(fā)育中，一種阿拉伯半乳聚糖蛋白會起到重要作用，它與植物細(xì)胞的生長、發(fā)育密切相關(guān)[9]。

2.1.3 核酸 細(xì)胞分化與發(fā)育的本質(zhì)是基因表達(dá)調(diào)控的結(jié)果，DNA是遺傳信息傳遞者，在體細(xì)胞胚胎發(fā)生的過程中也會有一系列動態(tài)變化。崔凱榮等對小麥體細(xì)胞胚發(fā)生過程中DNA代謝動態(tài)的研究結(jié)果表明，當(dāng)從愈傷組織轉(zhuǎn)入體胚發(fā)生培養(yǎng)后，胚性細(xì)胞處于活躍的DNA復(fù)制中，DNA的合成速率在不斷升高，到球形胚時(shí)DNA的合成速率達(dá)到最大值[10]。此外，研究中還發(fā)現(xiàn)，加入核酸合成抑制劑，可以抑制DNA的合成速率和胚性愈傷組織的增殖，在越早時(shí)期加入抑制效果就越明顯。而在小麥體細(xì)胞胚發(fā)生過程中，體細(xì)胞向胚性細(xì)胞轉(zhuǎn)化時(shí)表現(xiàn)有原體細(xì)胞中的大液泡變?yōu)榇罅啃∫号荩⑶液舜?、多核仁，還具有核仁液泡，變化十分活躍[11]。

2.2 影響植物體細(xì)胞胚發(fā)生的因素

體細(xì)胞胚胎的發(fā)生發(fā)育需要外植體、激素和培養(yǎng)基等多種內(nèi)外因素綜合作用影響[12]。植物體全株的細(xì)胞、組織和器官，都可以通過人工培養(yǎng)，恢復(fù)到胚胎性的細(xì)胞階段。胚型細(xì)胞在起始分化時(shí)期就已經(jīng)有表達(dá)全株植物的基因信號，因此也可通過改造胚胎發(fā)生時(shí)期的基因來調(diào)控植株不同器官和組織的特異性表達(dá)[13]。但全能性的表達(dá)還需要一定的條件和信號，如對外界刺激信號的感應(yīng)程度表現(xiàn)，相同植物或同一種植物的不同部位其反應(yīng)都不同，對體細(xì)胞胚誘導(dǎo)就會產(chǎn)生不同的難易程度。其次體細(xì)胞胚的發(fā)生，可以通過多個(gè)途徑誘導(dǎo)，如單倍性的小孢子、多倍性體細(xì)胞等。再次誘導(dǎo)體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為胚性細(xì)胞的關(guān)鍵是植物激素。針對不同植物不同部位的體細(xì)胞胚發(fā)生和發(fā)育所需的培養(yǎng)條件，外源生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類和濃度要有區(qū)別的進(jìn)行調(diào)節(jié)[14]。然后培養(yǎng)基中所含各種元素和物質(zhì)狀態(tài)也會對體細(xì)胞胚胎的發(fā)生產(chǎn)生重要影響。體細(xì)胞胚的發(fā)生發(fā)育在低濃度的White培養(yǎng)基到高濃度的B5、SH等培養(yǎng)基上都可以適應(yīng)良好。其原因是培養(yǎng)基中所含的營養(yǎng)元素對體細(xì)胞胚的的誘導(dǎo)產(chǎn)生了作用。其中對體細(xì)胞胚胎發(fā)生起到重要作用的是氮素的形態(tài)，最適氮素供應(yīng)的形式可能與生長素濃度有相關(guān)聯(lián)系。而碳水化合物對體細(xì)胞胚的發(fā)生發(fā)育也有重要影響，其既是能源，又是滲透調(diào)節(jié)劑?？赏ㄟ^種類和濃度的不同影響體細(xì)胞胚的生長發(fā)育，蔗糖是最有佳的還原碳源?；蚺囵B(yǎng)基中添加活性炭也有利于體細(xì)胞胚的發(fā)育，這在許多培養(yǎng)中得到證實(shí)。最后培養(yǎng)條件對體胚發(fā)生也有一定影響。

3 體細(xì)胞胚遺傳變異的研究

體細(xì)胞無性系變異是其中重要的遺傳變異來源，運(yùn)用植物體細(xì)胞經(jīng)過在離體培養(yǎng)，通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生發(fā)育形成再生植株已是常見手段，是作物種質(zhì)資源貧乏時(shí)期常用技術(shù)，因此，對體細(xì)胞胚胎發(fā)生中的遺傳變異研究也變得非常有意義[15]。

3.1 體細(xì)胞胚胎發(fā)生變異的機(jī)理

3.1.1 變異的類型包括染色體數(shù)目和染色體結(jié)構(gòu)變異 體細(xì)胞胚組織培養(yǎng)中染色體數(shù)目變異是常見現(xiàn)象。如四倍體馬鈴薯葉片、莖段和塊莖的再生植株中，大約有10%的非整倍體；對枸杞[16]、玉米[17]、伊貝母[18]、荔枝[19]的胚性愈傷組織、胚狀體和再生植株的染色體數(shù)目研究發(fā)現(xiàn)，不僅有染色體數(shù)目的減少或增加，還出現(xiàn)了混倍體。這些在愈傷組織胚狀體及再生植株中出現(xiàn)的染色體數(shù)目的變異，其原因可能與繼代培養(yǎng)中形成大量多倍體及非整倍體細(xì)胞有關(guān)。

而在一種二倍體馬鈴薯中，除了觀察到染色體數(shù)目變異外，還發(fā)現(xiàn)了缺失和互換等染色體結(jié)構(gòu)的變異。有研究表明在5種不同基因型的玉米胚性愈傷組織繼代過程中出現(xiàn)有染色體粘連、缺失、凝聚、易位、隨體斷裂、環(huán)狀染色體以及同源染色體聯(lián)會，部分細(xì)胞有微核現(xiàn)象出現(xiàn)。分析染色體結(jié)構(gòu)變異是影響非整倍體細(xì)胞的形成的重要原因[17]。

3.2.2 體胚發(fā)生過程中變異主要影響因素 外植體誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生的途徑不同，變異頻率也不同。由外植體誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生的途徑有兩種，一個(gè)是直接途徑，另一個(gè)是間接途徑，而兩種途徑所產(chǎn)生的植株在遺傳變異方面也有不同的表現(xiàn)。如香蕉花序由外植體培養(yǎng)形成的再生植株，經(jīng)過田間試驗(yàn)調(diào)查，植株性狀表現(xiàn)良好，遺傳穩(wěn)定，變異率低，可實(shí)現(xiàn)大面積的生產(chǎn)應(yīng)用[20]。對菠蘿和花葉芋的根、莖、葉培養(yǎng)產(chǎn)生的再生植株進(jìn)行田間試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菠蘿出現(xiàn)葉片差異，花葉芋出現(xiàn)葉片、株高、植株顏色等方面的差異[21]。這些都表明在體胚發(fā)生途徑中，直接途徑比間接途徑在遺產(chǎn)穩(wěn)定性方面表現(xiàn)更好，間接途徑的遺產(chǎn)變異頻率較高，其中的原因可能是因?yàn)殚g接途徑是經(jīng)過分化產(chǎn)生愈傷組織和愈傷組織繼代，形成體細(xì)胞胚胎，所以導(dǎo)致了明顯變異。

體細(xì)胞無性系變異具有對物種和基因型的依賴性，物種和基因型是影響體細(xì)胞無性系變異發(fā)生的重要因素，無關(guān)何種再生模式。即使經(jīng)過長期繼代后，植株的胚胎發(fā)生能力依然保持良好，如伊貝母[18]、青桿[22]、柳橙[23]、玉米[24]、龍眼[25]。但同一植物品種不同，其基因型就會存在差異，進(jìn)而導(dǎo)致體細(xì)胞無性系變異的差異。

植物生長中生長調(diào)節(jié)劑是極其重要的，其在植株生長過程中可能是起一種誘變劑的作用。2,4一D是植物體胚誘導(dǎo)中使用最廣泛的生長素。培養(yǎng)基中加入2,4一D，對體細(xì)胞分化、誘導(dǎo)等一系列體細(xì)胞胚發(fā)生過程產(chǎn)生重要的影響，但2,4一D的不良反應(yīng)是易導(dǎo)致染色體變異[26]。如繼代十七年玉米“八趟白”的胚性細(xì)胞不易多倍化以及寬皮柑橘品種的胚性愈傷組織未發(fā)生染色體數(shù)目變異都與2,4一D有關(guān)[24][27]。

長時(shí)間的繼代培養(yǎng)會產(chǎn)生一些列不良影響，如增加愈傷組織和細(xì)胞的變異頻率，再生能力降低或者完全喪失。草莓葉片的愈傷組織經(jīng)過24周培養(yǎng)，就完全喪失再生能力；源于煙草髓外植體的由四倍體細(xì)胞和八倍體細(xì)胞組成的胚性愈傷組織，在培養(yǎng)6年后即喪失再生能力；對玉米、伊貝母、陸地棉以及荔枝胚性愈傷組織進(jìn)行長時(shí)間繼代，越容易出現(xiàn)染色體數(shù)目異常的細(xì)胞。同時(shí)隨著胚性愈傷組織繼代次數(shù)的增加，染色體變異頻率也會明顯提高，分化頻率逐漸下降[26]。

4 結(jié)語

目前，國內(nèi)外關(guān)于植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生研究的關(guān)注點(diǎn)都在于不同植物體細(xì)胞胚發(fā)生技術(shù)體系的建立，由于植物品種類繁多，體細(xì)胞胚發(fā)生情況復(fù)雜，有針對性的開展植物體細(xì)胞胚發(fā)生技術(shù)有利用與植物保護(hù)與種質(zhì)開發(fā)。國內(nèi)外都為此付出了大量的精力[28,29]。

但是關(guān)于植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生發(fā)育的基因表達(dá)與調(diào)控等方面我們還是了解的不夠透徹，這在一段時(shí)期內(nèi)將成為我們的研究重點(diǎn)。