白內(nèi)障的分子病理改變

季敏 綜述 管懷進(jìn) 審校

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院眼科，江蘇 南通 226001)

白內(nèi)障是全球首位致盲性眼病，但是目前臨床眼科醫(yī)生對(duì)白內(nèi)障的診斷與治療多還在宏觀水平。眼科醫(yī)生臨床中常常是通過裂隙燈檢查發(fā)現(xiàn)晶狀體混濁以及手術(shù)摘除混濁的晶狀體治療白內(nèi)障，對(duì)其分子病理機(jī)制的認(rèn)識(shí)不夠。近年來隨著各種技術(shù)的發(fā)展，國內(nèi)外研究者對(duì)白內(nèi)障分子病理機(jī)制做了很多研究，有許多新的進(jìn)展和發(fā)現(xiàn)。

正常的晶狀體是雙凸圓盤狀透明體，由晶狀體囊膜、囊膜下晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cells，LECs)、晶狀體纖維和懸韌帶組成。白內(nèi)障是指晶狀體透明度下降，由透明變混濁。病理切片表現(xiàn)有3種[1]，一是晶狀體囊膜下上皮增生，二是晶狀體囊膜厚度改變，三是晶狀體纖維變性，纖維變短，有的呈梭形，有的呈棒狀，有的變?yōu)閳A形，即馬氏小球(Morgagnian globules，指白內(nèi)障晶狀體蛋白凝固、壞死，病理切片上表現(xiàn)為無結(jié)構(gòu)的均勻一致的小圓球[1])，而馬氏小球是診斷白內(nèi)障的重要病理依據(jù)。而在分子水平，晶狀體囊膜、上皮細(xì)胞和晶狀體纖維也都有各自的改變，不同類型的白內(nèi)障分子病理機(jī)制也不盡相同，這些改變可通過免疫組織化學(xué)、熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)以及電子顯微鏡等技術(shù)檢測(cè)，輔助臨床診斷。

1 晶狀體囊膜的分子病理改變

晶狀體囊膜，也稱為晶狀體基底膜，是透明而富有彈性的薄膜，是一種特殊的細(xì)胞外基質(zhì)，由晶狀體上皮細(xì)胞分泌產(chǎn)生，后由新分化的纖維細(xì)胞產(chǎn)生[2]。用阿尼藍(lán)染色后可見囊膜分為2層，內(nèi)層較厚，外表層較薄，懸韌帶附著于外層，病理情況出現(xiàn)表層分離、剝落，即囊膜剝脫。后囊膜的厚度(2～3 μm)比前囊膜薄3～5倍。赤道部周圍的囊膜表面有懸韌帶連接點(diǎn)[3]。晶狀體囊膜的分子構(gòu)成與其他基底膜類似，主要成分是IV型膠原蛋白(最多占晶狀體囊膜干重的40%)，其交聯(lián)集成在層粘連蛋白支架上，保持囊膜的強(qiáng)度和彈性。層粘連蛋白在晶狀體囊膜呈極性分布，在晶狀體上皮細(xì)胞側(cè)分布較多。其他還包括巢蛋白、凝集素和一些硫酸肝素蛋白聚糖等[2]。白內(nèi)障晶狀體囊膜分子構(gòu)成發(fā)生改變：利用免疫組織化學(xué)的方法可見IV型膠原蛋白表達(dá)減少、I型膠原蛋白表達(dá)增加，層粘連蛋白表達(dá)極性消失、在基底膜異常沉積、層粘連蛋白α4表達(dá)異常增加，衰老相關(guān)蛋白、P53、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β，TGFβ1)表達(dá)增加，并表達(dá)特異性波形蛋白、纖維連接蛋白[4]。白內(nèi)障晶狀體囊膜屏障作用降低，晶狀體內(nèi)鈉、鈣、鉀、氯、銅、鋅等離子濃度增加[5]。衰老的晶狀體囊膜中晚期糖基化終末產(chǎn)物表達(dá)增加，可能與年齡相關(guān)性白內(nèi)障以及后發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)生有關(guān)[6]。

2 晶狀體上皮細(xì)胞分子病理改變

晶狀體前囊膜下有一層上皮細(xì)胞，分布在從中央?yún)^(qū)到赤道部的整個(gè)范圍，而后囊膜下沒有上皮細(xì)胞。根據(jù)形態(tài)不同，LECs分為3個(gè)區(qū)，中央?yún)^(qū)細(xì)胞為立方形，排列整齊，體積較大；中周部細(xì)胞欠規(guī)則，細(xì)胞核靠近基底部；赤道部細(xì)胞變長(zhǎng)，核呈圓形，可有分裂象。晶狀體上皮細(xì)胞微環(huán)境改變，如角膜潰瘍穿孔后晶狀體囊膜與潰瘍接觸、外傷性后晶狀體囊膜破裂、青光眼急性發(fā)作等，LECs可發(fā)生增生、化生，甚至萎縮變性，形成白內(nèi)障[7]。

2.1 LECs 細(xì)胞膜蛋白表達(dá)改變

正常LECs膜表面表達(dá)多種分子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)體，包括縫隙連接蛋白43(connexin 43，Cx43)和Cx50[8]。Cx43和Cx50形成具有不同性質(zhì)的縫隙連接和半通道，在細(xì)胞發(fā)育中起重要作用。年齡相關(guān)性白內(nèi)障LECs細(xì)胞膜Cx50表達(dá)降低，而Cx43表達(dá)改變不明顯[9]。

水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是一種重要的膜蛋白，根據(jù)滲透梯度轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞內(nèi)外的水分子。LECs細(xì)胞膜上主要表達(dá)AQP1和AQP5兩種水通道蛋白。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示白內(nèi)障LECs的2種水通道蛋白表達(dá)均顯著增加，提示水通透性增加。

晶狀體組織中鈣離子濃度增加激活蛋白水解酶，介導(dǎo)晶狀體蛋白的水解，是白內(nèi)障發(fā)生重要的分子機(jī)制[10]。研究表明白內(nèi)障LECs細(xì)胞膜上鈣通道蛋白表達(dá)增加，鈣離子通透性增強(qiáng)。細(xì)胞膜ATP依賴的鈣泵(plasma membrane Ca2+-ATPase，PMCA)是晶狀體鈣離子去除的主要機(jī)制，在遺傳性白內(nèi)障模型中熒光免疫組織化學(xué)發(fā)現(xiàn)LECs細(xì)胞膜PMCA代償性表達(dá)增加[11]。

綜上，白內(nèi)障LECs細(xì)胞間連接蛋白、水通道蛋白和鈣通道蛋白等表達(dá)改變，細(xì)胞間連接穩(wěn)定性下降，細(xì)胞膜水、鈣離子等通透性增加。

2.2 LECs 細(xì)胞膜脂質(zhì)改變

隨著質(zhì)譜等技術(shù)的日益發(fā)展，內(nèi)障患者晶狀體脂質(zhì)組成被發(fā)現(xiàn)發(fā)生了明顯變化。而膜脂質(zhì)發(fā)生細(xì)微的、甚至目前手段無法檢測(cè)到的變化都可能導(dǎo)致晶狀體透明性下降。幾乎所有類型的白內(nèi)障在晶狀體的各個(gè)區(qū)域均發(fā)生了膜結(jié)構(gòu)的重組[12]。白內(nèi)障LECs細(xì)胞膜發(fā)生曲折、液泡以及層狀小體(lamellar bodies)。晶狀體上皮細(xì)胞特有的層狀小體是附著在細(xì)胞膜上的晶狀體蛋白外面包繞一層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)。白內(nèi)障LECs細(xì)胞膜層狀小體明顯增加。早在1881年，學(xué)者[13]發(fā)現(xiàn)白內(nèi)障患者晶狀體的膽固醇水平升高。隨后，有研究[14]發(fā)現(xiàn)人晶狀體中的脂質(zhì)氧化的主要產(chǎn)物丙二醛濃度隨著年齡的增加和白內(nèi)障的發(fā)生而增加。人類晶狀體中的主要磷脂為髓磷脂，但是甘油磷脂的氧化、含量降低在白內(nèi)障中更為顯著。與年齡相近的正常晶狀體相比，白內(nèi)障晶狀體中甘油磷脂的總量要少得多。

2.3 LECs 胞內(nèi)蛋白表達(dá)改變

晶狀體蛋白通過短程相互作用保持晶狀體透明。衰老或者疾病損傷導(dǎo)致晶體蛋白錯(cuò)誤折疊、聚集成不溶性淀粉樣物質(zhì)，形成白內(nèi)障。人晶狀體有3個(gè)主要蛋白質(zhì)家族：α、β和γ晶狀體蛋白[15]。α晶狀體蛋白分為α晶狀體蛋白A(αA晶狀體蛋白)和α晶狀體蛋白B(αB晶狀體蛋白)，屬于分子伴侶小熱休克蛋白家族，是脊椎動(dòng)物晶狀體的主要蛋白質(zhì)成分，在維持γ-晶狀體蛋白等其他晶狀體蛋白的水溶性中起重要作用[16]。年齡相關(guān)性和先天性白內(nèi)障LECs中的可溶性αA和αB晶狀體蛋白表達(dá)均較正常對(duì)照組減少?？扇苄驭辆铙w蛋白與γ晶狀體蛋白等其他蛋白質(zhì)結(jié)合形成不可溶蛋白是晶狀體蛋白變性的重要機(jī)制[17]。

在機(jī)體衰老過程中，β-晶狀體蛋白被高度修飾，白內(nèi)障β-晶狀體蛋白亞基數(shù)量改變并組成不同的寡聚體，推測(cè)其可能在衰老和白內(nèi)障形成中起重要作用[18-19]，但是目前對(duì)β-晶狀體蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究仍然較少，其在白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展中的作用仍需進(jìn)一步研究。

白內(nèi)障γ晶狀體蛋白出現(xiàn)聚集、變性，是白內(nèi)障重要的分子改變。未聚集的γ晶狀體蛋白作為單體存在于晶狀體中[20]。人類γ晶狀體蛋白家族由5個(gè)成員組成：γA、γB、γC、γD和γS晶狀體蛋白。它們?cè)谛蛄泻头肿淤|(zhì)量上高度相似，但表達(dá)有一定的時(shí)序性。γA和γD在晶狀體發(fā)育早期表達(dá)，因此主要存在于晶狀體核；γS在晶狀體發(fā)育后期產(chǎn)生，在晶狀體皮質(zhì)更為多見[21-22]。

晶狀體中高濃度還原型谷胱甘肽是維持組織透明度重要的分子基礎(chǔ)。氧化損傷是白內(nèi)障形成的重要機(jī)制之一。一方面，白內(nèi)障LECs細(xì)胞內(nèi)活性氧ROS、H2O2、NO等增加[23]，另一方面，清除氧化損傷的能力下降，如還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)、超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶等含量降低[24]。白內(nèi)障LECs細(xì)胞質(zhì)和胞核中的GSH濃度均降低，并且在細(xì)胞核中下降比例更高，提示細(xì)胞核更易受氧化應(yīng)激的影響[25]。

此外，LECs發(fā)生凋亡、焦亡等程序性死亡也參與白內(nèi)障的發(fā)病過程，細(xì)胞呈現(xiàn)相關(guān)的分子病理改變。細(xì)胞凋亡是一種程序性死亡，白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞凋亡增加。凋亡分子表達(dá)譜具有特征性，如Bcl2等抑制凋亡基因和蛋白表達(dá)減少、Bax等促凋亡基因和蛋白表達(dá)增加[26]。細(xì)胞焦亡是繼細(xì)胞凋亡和壞死之后發(fā)現(xiàn)的一種新的細(xì)胞程序性、伴有炎性因子參與的死亡方式。新近研究[27]表明白內(nèi)障LECs焦亡分子標(biāo)志物Caspase-1和Gasdermin蛋白GSDMD表達(dá)上調(diào)，提示LECs焦亡參與了白內(nèi)障的發(fā)生。

近來有研究[28]發(fā)現(xiàn)：晶狀體混濁部位的LECs自噬相關(guān)蛋白LC3-II和自噬相關(guān)基因ATG7、ATG5、Beclin-1表達(dá)增加，提示自噬參與白內(nèi)障發(fā)病過程。自噬是真核細(xì)胞清除細(xì)胞內(nèi)聚集、變性蛋白及受損細(xì)胞器，進(jìn)而維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的一種自我保護(hù)機(jī)制。

2.4 LECs 核酸改變

白內(nèi)障早期LECs即出現(xiàn)DNA損傷。在白內(nèi)障LECs中，幾乎檢測(cè)不到DNA鏈斷裂，但核苷酸組成改變：氧化嘧啶和嘧啶二聚體含量降低，氧化嘌呤的含量增高。白內(nèi)障LECs中，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)的方法可檢測(cè)到編碼α、β和γ晶狀體蛋白基因CRYA、CRYB和CRYG[29]、編碼連接蛋白基因GJA3和GJA8[30]、編碼內(nèi)源性膜蛋白基因MIP和LIM2[31-32]，以及代謝相關(guān)基因包括葡萄糖代謝相關(guān)基因GALK1等多種基因突變[33]。另外，我們?cè)谀挲g相關(guān)性白內(nèi)障中發(fā)現(xiàn)氧化損傷修復(fù)基因OGG1、WRN等基因突變[34]。氧化損傷修復(fù)基因OGG1、WRN、ERCC6等也呈現(xiàn)表觀遺傳學(xué)改變(如甲基化等)。部分研究也發(fā)現(xiàn)一些轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合區(qū)發(fā)生突變是繞核性等白內(nèi)障致病因素[35]。

近年來，非編碼RNA如微小RNA(microRNA，miRNA)、長(zhǎng)鏈非編碼RNA(longnon-coding RNA，lncRNA)以及環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)等在白內(nèi)障研究領(lǐng)域被廣泛報(bào)道。微小RNA(miRNA)是長(zhǎng)約22 nt的非編碼RNA，廣泛存在于從病毒到人類的各種生物中，通過與mRNA結(jié)合，阻斷蛋白編碼基因的表達(dá)，抑制蛋白翻譯，與多種疾病的發(fā)病相關(guān)[36]。白內(nèi)障LECs內(nèi)miR-34a miR-15a5p、miR-15a-3p和miR-161-5p等miRNA表達(dá)明顯增[37-38]，miR-125b和miR-16-1-3p則表達(dá)降低。在糖尿病白內(nèi)障LECs中miR-30a表達(dá)降低[39-40]。另外，miR-138、miRNA-4328在白內(nèi)障患者前囊膜和房水中高表達(dá)[41]。

LncRNA是長(zhǎng)度大于200 nt的非編碼RNA，在表觀遺傳調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞分化調(diào)控等眾多生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。白內(nèi)障LECs中l(wèi)ncRNA TUG1和lncRNA KCNQ1OT1表達(dá)增加[42-43]，lncRNA PLCD3-OT1表達(dá)降低[44]。LncRNA MIAT在年齡相關(guān)性白內(nèi)障(age-related cataract，ARC)患者血漿和房水中顯著升高，被認(rèn)為是ARC特異性生物標(biāo)志物[45]。

CircRNA分子呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不受RNA外切酶影響，富含miRNA結(jié)合位點(diǎn)，在細(xì)胞中起到miRNA海綿的作用，進(jìn)而解除miRNA對(duì)其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表達(dá)水平，發(fā)揮調(diào)控作用[46]。白內(nèi)障LECs中circHIPK3表達(dá)顯著下調(diào)，認(rèn)為與白內(nèi)障的發(fā)生相關(guān)[47]。

3 晶狀體纖維分子病理改變

晶狀體纖維主要由晶狀體蛋白組成，成熟晶狀體纖維中的蛋白質(zhì)合成和周轉(zhuǎn)停止，使晶狀體纖維蛋白長(zhǎng)期保持可溶性和透明。蛋白質(zhì)翻譯后修飾，包括磷酸化、脫酰胺基化、N、C截?cái)?、乙酰化和甲基化，?dǎo)致晶狀體蛋白質(zhì)相互作用被破壞，形成高分子聚合物并與細(xì)胞膜結(jié)合，晶狀體蛋白分子3級(jí)、4級(jí)結(jié)構(gòu)均發(fā)生改變，發(fā)生白內(nèi)障[48-52]。其中N、C端截?cái)啾徽J(rèn)為是白內(nèi)障晶狀體蛋白的標(biāo)志性翻譯后修飾。α晶狀體蛋白的N123殘基在維持其伴侶功能方面起著至關(guān)重要的作用。當(dāng)發(fā)生N端截?cái)?，晶狀體蛋白分子伴侶功能減弱，導(dǎo)致白內(nèi)障的發(fā)生[50]。蛋白糖基化，如γB晶狀體蛋白糖基化，是糖尿病性白內(nèi)障發(fā)生的重要分子改變。因此，晶狀體蛋白質(zhì)組學(xué)變化被認(rèn)為是白內(nèi)障發(fā)生主要的分子病理變化。

晶狀體蛋白聚集有2種結(jié)果，形成高度有序的淀粉樣物質(zhì)或者形成高度無序的無定形聚集物[17]。無定形聚集物一般不會(huì)導(dǎo)致顯著的蛋白質(zhì)折疊疾病[53]。淀粉樣物質(zhì)是一類高度有序和穩(wěn)定的蛋白質(zhì)聚集體，組織中淀粉樣物質(zhì)沉積是多種疾病的病理改變，如阿爾茨海默氏癥和帕金森病[53]。利用透射電鏡和二維紅外光譜法可檢測(cè)到衰老和白內(nèi)障晶狀體組織中微量淀粉樣物質(zhì)存在，未成年人透明晶狀體中未發(fā)現(xiàn)淀粉樣改變[54]。

隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時(shí)代的到來，白內(nèi)障的診斷與治療必然朝著早發(fā)現(xiàn)、早治療、基因/藥物治療替代手術(shù)治療等方向發(fā)展。掌握白內(nèi)障的分子病理機(jī)制是早期精準(zhǔn)診斷白內(nèi)障的前提，也是未來基因/藥物治療白內(nèi)障的理論基礎(chǔ)。目前對(duì)白內(nèi)障的分子病理的研究仍在不斷的探索中。相信隨著生物化學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科不斷發(fā)展、研究方法不斷改進(jìn)，白內(nèi)障的分子病理機(jī)制會(huì)進(jìn)一步被闡明，白內(nèi)障的診斷和治療也將進(jìn)入精準(zhǔn)的分子診斷和治療水平。