線粒體自噬在蛛網(wǎng)膜下腔出血中的研究進(jìn)展

張永智，劉彬冰，田楊，史懷璋

線粒體自噬為一種保守的、線粒體特異性的自噬清除過程[1]。作為一種選擇性的受損線粒體清除過程，其對(duì)于線粒體穩(wěn)態(tài)及細(xì)胞存活的維持至關(guān)重要[2]。蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）后72 h內(nèi)的早期腦損傷（early brain injury，EBI）階段，包括顱內(nèi)壓增高、灌注壓減低、血腦屏障破壞、腦水腫及氧化應(yīng)激等病變，以及遲發(fā)性腦血管痙攣階段導(dǎo)致的腦缺血等病變均可以導(dǎo)致神經(jīng)元能量供應(yīng)異常、線粒體腫脹，繼而釋放活性氧（reactive oxygen species，ROS）及細(xì)胞色素C（cytochrome C，CytC）等物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，引起神經(jīng)元的凋亡及壞死[3-5]。因此，作為維持線粒體穩(wěn)態(tài)及清除受損線粒體的手段，線粒體自噬功能對(duì)于健康的維持及疾病的治療至關(guān)重要。且腦神經(jīng)元復(fù)雜的功能決定其需要更多的線粒體來提供能量，同時(shí)由于神經(jīng)元為高度分化細(xì)胞，不能通過細(xì)胞分裂的方式清除細(xì)胞內(nèi)的異常蛋白及受損細(xì)胞器，更增加了其對(duì)于線粒體活性及功能穩(wěn)態(tài)的依賴[2，6]。所以在發(fā)生SAH的早期，如果適當(dāng)誘導(dǎo)啟動(dòng)線粒體自噬、避免神經(jīng)元死亡，將可能改善SAH患者的預(yù)后[1]。因此本文對(duì)線粒體自噬機(jī)制，SAH后線粒體形態(tài)變化對(duì)預(yù)后的影響，以及線粒體自噬在SAH中作用機(jī)制的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1 線粒體自噬

目前經(jīng)典的線粒體自噬通路主要分為：①PINK1-Parkin介導(dǎo)的泛素依賴途徑；②不依賴泛素的線粒體受體蛋白介導(dǎo)的線粒體自噬。

1.1 PINK1-Parkin介導(dǎo)的泛素依賴途徑的線粒體自噬 在外界應(yīng)激刺激下，線粒體膜電位減低，PINK1蛋白被持續(xù)轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體內(nèi)膜的過程受阻，使得PINK1停留在線粒體外膜[7]。隨后PINK1通過自身磷酸化的方式激活[8]，使得Parkin蛋白轉(zhuǎn)位至線粒體外膜表面。Parkin為E3泛素連接酶，被PINK1磷酸化激活后可發(fā)揮正反饋機(jī)制，泛素化多種線粒體外膜蛋白，產(chǎn)生PINK1的底物——多聚泛素蛋白鏈。隨著視神經(jīng)誘變蛋白（optineurin，OPTN）和核點(diǎn)蛋白52（nuclear dot protein 52，NDP52）等多種蛋白聚集至受損線粒體外膜。OPTN、NDP52等誘導(dǎo)受損線粒體與自噬體膜蛋白-微管相關(guān)蛋白輕鏈3（microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3，LC3）結(jié)合，激活了線粒體自噬[9]。在SAH大鼠模型中已證實(shí)了PINK1/Parkin的參與[10-11]，且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明PINK1/Parkin途徑在腦組織中最活躍，內(nèi)源性Parkin可減少中腦多巴胺能神經(jīng)元的丟失[12]。研究表明在神經(jīng)元中，去泛素化酶USP30具有對(duì)抗線粒體自噬的作用[13]，其通過抑制Parkin底物活性發(fā)揮作用，同時(shí)研究者還發(fā)現(xiàn)USP30缺乏可以減輕多巴胺神經(jīng)元的氧化應(yīng)激損傷。更值得注意的是，Wauer等[14]發(fā)現(xiàn)PINK1介導(dǎo)的泛素鏈磷酸化可以保護(hù)已被磷酸化的泛素鏈不受去泛素化酶的降解，從而放大線粒體自噬信號(hào)通路。

1.2 不依賴泛素的線粒體受體蛋白介導(dǎo)的線粒體自噬 線粒體受體蛋白參與線粒體自噬的一般特性為不依賴泛素化[1，15]，其與自噬體結(jié)合，靶向清除受損的線粒體。受體蛋白主要與LC3及A型γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）受體相關(guān)蛋白（GABA type A receptor-associated protein，GABARAP）的LC3相互作用區(qū)（LC3-interacting region，LIR）模體（motif）相結(jié)合，介導(dǎo)受損線粒體的清除[16]。參與線粒體自噬的線粒體受體蛋白主要包括NIP3樣蛋白X（NIP3-liked protein X，NIX）、BCL-2相互作用蛋白3（BCL-2 interacting protein 3，BNIP3）及FUN14家族蛋白1（FUN14 domain-containing protein 1，F(xiàn)UNDC1）。NIX和BNIP3都擁有高度保守的LIR模體，在不同的應(yīng)激刺激下，通過與LC3及GABARAP蛋白結(jié)合，參與線粒體自噬[17]。LIR模體的磷酸化，促進(jìn)了NIX與LC3結(jié)合，介導(dǎo)線粒體清除。而BNIP3則通過釋放視神經(jīng)萎縮蛋白1（optic atrophy 1，OPA1），招募線粒體動(dòng)力相關(guān)蛋白1（dynamin-related protein 1，Drp1），干擾線粒體動(dòng)力，促進(jìn)受損線粒體的分裂，進(jìn)而加速了線粒體的清除[18-19]。

少數(shù)線粒體受體蛋白也同時(shí)參與了Parkin途徑的線粒體自噬，如分布于線粒體內(nèi)膜的抗增殖蛋白（prohibitins，PHBs）及心磷脂，在能量供應(yīng)障礙引起的應(yīng)激狀態(tài)下，PHB2參與了Parkin途徑的線粒體清除[20]。線粒體膜電位去極化、蛋白酶活性增加，使得線粒體外膜受損破裂，PHB2暴露于細(xì)胞質(zhì)中，隨后與LC3及自噬標(biāo)志蛋白p62結(jié)合形成復(fù)合體。該復(fù)合體在受損線粒體處調(diào)節(jié)自噬體的產(chǎn)生，從而促進(jìn)受損線粒體的清除[21]。但是在SAH后早期PHB2下降，說明SAH誘導(dǎo)線粒體自噬啟動(dòng)不夠充分，當(dāng)神經(jīng)元遭受如氧化應(yīng)激等嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)，線粒體自噬作用不足以對(duì)抗損傷，最終神經(jīng)元將不可避免地進(jìn)入細(xì)胞死亡過程[10]。

2 線粒體形態(tài)與蛛網(wǎng)膜下腔出血

作為細(xì)胞內(nèi)的高度動(dòng)態(tài)化細(xì)胞器，線粒體通過融合（fusion）和分裂（fission）過程調(diào)節(jié)自身形態(tài)及能量產(chǎn)生，以適應(yīng)細(xì)胞內(nèi)外各種應(yīng)激及能量供應(yīng)異常等刺激。其中高度極化的神經(jīng)元長(zhǎng)樹突和軸突的延伸特征對(duì)線粒體動(dòng)力學(xué)更是提出了挑戰(zhàn)：如何在一個(gè)神經(jīng)元內(nèi)有效地傳輸線粒體以能為遠(yuǎn)近端提供能量并調(diào)節(jié)其Ca2+水平[22]。線粒體在融合過程中，主要由線粒體融合蛋白1（mitofusion 1，MFN1）及2（MFN2）介導(dǎo)線粒體外膜的融合，而OPA1介導(dǎo)線粒體內(nèi)膜的融合[22]。而線粒體分裂，作為線粒體自我更新及清除的手段，同時(shí)也是線粒體自噬中不可缺少的一步，主要由Drp1介導(dǎo)線粒體內(nèi)膜和外膜的分裂[2，22]。Wu等[23]在SAH大鼠中應(yīng)用Drp1蛋白的選擇性抑制劑Mdivi-1，發(fā)現(xiàn)其可以減輕線粒體的過度分裂和線粒體嵴斷裂，繼而減輕細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等損傷，改善SAH大鼠預(yù)后。

線粒體形態(tài)和線粒體自噬之間的關(guān)系體現(xiàn)在，如同線粒體膜電位減低一樣，線粒體形態(tài)學(xué)改變將成為線粒體自噬的激活/抑制信號(hào)，將細(xì)胞狀態(tài)與線粒體功能連接起來[22]。而線粒體融合與分裂二者之間并非是割裂對(duì)立的，目前研究發(fā)現(xiàn)，腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）對(duì)Drp1及MFN2均有磷酸化激活作用[24-25]。作為細(xì)胞內(nèi)能量感受器，AMPK被激活后，可以直接磷酸化激活unc-51樣自噬活化激酶1（unc-51 like autophagy activating kinase 1，ULK1），或抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的活性間接激活ULK1參與線粒體自噬[26-28]。Li等[29]在SAH大鼠及細(xì)胞內(nèi)應(yīng)用mTOR的抑制劑雷帕霉素，發(fā)現(xiàn)其可以減少Drp1活性形式的過度表達(dá)，減少線粒體的過度分裂，從而改善預(yù)后。Wu等[30]也發(fā)現(xiàn)Honokiol（和厚樸酚，一種去乙酰化酶Sirtuin-3的激動(dòng)劑）可以通過AMPK依賴的方式，促進(jìn)MFN1和MFN2的表達(dá)，促進(jìn)線粒體融合，減輕SAH后早期腦損傷。

3 激活/抑制線粒體自噬對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血的影響

在SAH后的早期，線粒體自噬通過清除受損線粒體而避免神經(jīng)元的進(jìn)一步死亡。但是當(dāng)受損線粒體的數(shù)量過多、程度過重時(shí)，將超過線粒體自噬清除受損線粒體的能力，此時(shí)細(xì)胞凋亡及壞死將占據(jù)主導(dǎo)，同時(shí)伴隨著自噬途徑的關(guān)鍵蛋白失活，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[31]。Zhang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠發(fā)生SAH后的早期，線粒體自噬及凋亡水平都出現(xiàn)了增高。根據(jù)線粒體產(chǎn)生ATP及ROS的多少，細(xì)胞內(nèi)的變化可能不同：當(dāng)ATP數(shù)量較多時(shí)，以線粒體自噬為主；當(dāng)ATP缺乏、Ca2+增多及ROS產(chǎn)生時(shí)，將主要導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡及壞死[32]。在SAH大鼠中應(yīng)用線粒體靶向抗氧化劑MitoQ或褪黑素后，線粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)明顯增多、凋亡減低，減少了退化神經(jīng)元產(chǎn)生的同時(shí)，還改善了SAH大鼠短期及長(zhǎng)期的神經(jīng)功能預(yù)后[10-11]。反之，將參與線粒體自噬蛋白的抑制劑應(yīng)用于SAH大鼠，將降低線粒體自噬通路相關(guān)基因的表達(dá)，導(dǎo)致線粒體自噬水平減低，神經(jīng)元凋亡及壞死水平升高，血腦屏障通透性增加，SAH大鼠的腦水腫程度及神經(jīng)功能障礙加重[10，33]。

在缺血性腦疾病研究中，認(rèn)為在腦缺血的初始階段以及在永久性腦缺血模型中，過度的自噬可誘導(dǎo)細(xì)胞死亡加重?fù)p傷，此時(shí)的自噬抑制劑具有神經(jīng)保護(hù)作用[34-36]。而在目前的SAH研究中尚無此發(fā)現(xiàn)，一些學(xué)者認(rèn)為與缺血性卒中的缺血再灌注損傷階段一致，提高線粒體自噬水平將對(duì)神經(jīng)元提供保護(hù)作用[37-38]。Palikaras等[1]認(rèn)為最理想的治療策略是同時(shí)激活線粒體自噬和生物合成，以減少線粒體數(shù)量的丟失及細(xì)胞死亡。

電壓依賴陰離子通道蛋白1（voltagedependent anion channel 1，VDAC1）為線粒體外膜通道蛋白，介導(dǎo)Ca2+進(jìn)出線粒體[39]。Li等[33]在SAH大鼠中發(fā)現(xiàn)VDAC1參與了線粒體自噬，VDAC1的表達(dá)在SAH后24～48 h到達(dá)頂峰，并誘導(dǎo)LC3 Ⅱ（LC3的活性形式）增多。與LC3的共定位、TUNEL染色、PI染色均證實(shí)VDAC1誘導(dǎo)的線粒體自噬在抑制細(xì)胞凋亡及壞死中發(fā)揮了作用。

總之，線粒體自噬作為神經(jīng)元應(yīng)對(duì)外界各種應(yīng)激刺激下自我存活的一種應(yīng)激保護(hù)性反應(yīng)，在SAH發(fā)生后具有神經(jīng)元保護(hù)作用。本文主要介紹了線粒體自噬的經(jīng)典通路、在SAH中的作用機(jī)制及其對(duì)預(yù)后的影響。雖然目前仍未出現(xiàn)可以轉(zhuǎn)化應(yīng)用于臨床SAH的線粒體自噬激活藥物，但目前已經(jīng)在臨床上應(yīng)用的部分藥物（如二甲雙胍等）已被證明對(duì)線粒體自噬具有調(diào)節(jié)作用。因此，在未來的SAH研究中，除了繼續(xù)探索SAH中的線粒體自噬，更要嘗試將其向臨床轉(zhuǎn)化，探尋促進(jìn)線粒體自噬的藥物，進(jìn)而改善SAH患者的預(yù)后。

【點(diǎn)睛】本文介紹了線粒體自噬依賴/不依賴泛素的兩種經(jīng)典通路；線粒體形態(tài)改變（通過融合/分裂）可激活/抑制線粒體自噬從而調(diào)控細(xì)胞的存活或死亡；在SAH中通過促進(jìn)線粒體自噬可改善患者預(yù)后。