超聲波靶向微泡擊碎技術(shù)在心臟病基因治療中的現(xiàn)狀與前景

黃葉，陳巍綜述 田海審校

近年來(lái)，心臟病在全球疾病死亡原因構(gòu)成比中一直居高不下。隨著基因工程和分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，研究者發(fā)現(xiàn)基因治療可以通過(guò)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，針對(duì)疾病特異性靶點(diǎn)，選擇性地延緩或阻斷疾病的發(fā)展過(guò)程。在心臟病中，基因治療通過(guò)抗氧化應(yīng)激、抗間質(zhì)重構(gòu)和增加局部組織血運(yùn)等多種機(jī)制顯著改善心功能。但基因轉(zhuǎn)染的方式尚需不斷開拓。超聲波靶向微泡擊碎技術(shù)(ultrasound targeted microbubble destruction，UTMD)憑借其無(wú)創(chuàng)、靶向性強(qiáng)、免疫原性低、毒性低和可重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)，成為臨床前基因轉(zhuǎn)染的重要方式，有著巨大的發(fā)展?jié)摿团R床轉(zhuǎn)化的可能性，在心臟病基因治療中的應(yīng)用值得深入探討。

1 心血管疾病與基因治療

在20世紀(jì)60年代，基因治療的概念被最先提出，隨著重組DNA技術(shù)與基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的突破，基因治療從概念走向技術(shù)實(shí)施。2017年美國(guó)政府批準(zhǔn)CAR-T療法及yescarta基因療法治療淋巴瘤患者，標(biāo)志著基因治療在倫理與法治上得到允許，正式成為可應(yīng)用于臨床的治療方式?；蛑委熢诙囝I(lǐng)域難治疾病方面擁有巨大潛力，在心血管疾病中，基因治療可通過(guò)抗氧化應(yīng)激、抗間質(zhì)重構(gòu)和增加局部組織血運(yùn)等多種機(jī)制顯著改善心功能。目前，基因治療在體外研究中取得了較明顯的成效，但由于轉(zhuǎn)染方式的局限，體內(nèi)研究往往達(dá)不到預(yù)期的效果[1-2]。目前常用的質(zhì)粒和病毒載體均存在明顯不足，如轉(zhuǎn)染效率低和免疫原性等，使其難以在體內(nèi)應(yīng)用。因此，設(shè)計(jì)一種安全、高效的基因轉(zhuǎn)染方式成為心血管疾病基因治療研究中需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題[1]。高效、安全、靶向、可重復(fù)的UTMD應(yīng)運(yùn)而生，為介導(dǎo)體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染提供了新的方法。

2 UTMD的主要作用機(jī)制

UTMD是在特定組織以一定頻率和機(jī)械指數(shù)的超聲使載有目的基因的微泡破碎以增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)染效率的技術(shù)，具有高效、安全、靶向的特點(diǎn)。超聲微泡是由蛋白質(zhì)、脂類或高分子聚合物等制成的外殼包裹惰性氣體空化核構(gòu)成，最早作為造影劑用于聲學(xué)診斷，具有比普通超聲更高的分辨率和對(duì)比度，尤其在心肌活性造影方面有著突出貢獻(xiàn)。隨基因轉(zhuǎn)染方式的不斷開拓，研究者發(fā)現(xiàn)超聲微泡具有不易透過(guò)組織間隙、無(wú)肝腎毒性、在血液中穩(wěn)定存在的優(yōu)勢(shì)，具有良好的生物安全性，將其與低壓爆破模式的超聲相結(jié)合，可以產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)以增強(qiáng)基因或藥物的遞送效率，UTMD技術(shù)由此產(chǎn)生[2]。其作用機(jī)制主要有：(1)空化效應(yīng)，指液體中的微小空化核在超聲波作用下被激發(fā)，經(jīng)歷振蕩、塌陷、膨脹和收縮的一系列動(dòng)態(tài)過(guò)程，分為慣性空化和穩(wěn)定空化。其中慣性空化對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)烈的沖擊和熱效應(yīng)，破壞血管內(nèi)皮的完整性，使大分子通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞間隙轉(zhuǎn)移。穩(wěn)定空化可刺激細(xì)胞的內(nèi)吞作用，以增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)的傳遞。注射微泡后血液中空化核濃度增加，可能降低空化閾值，最終增強(qiáng)超聲空化效應(yīng)[2-3]。(2)聲孔效應(yīng)，指細(xì)胞膜在超聲作用下形成暫時(shí)性小孔的現(xiàn)象，大約持續(xù)24 h，可促進(jìn)細(xì)胞對(duì)物質(zhì)的攝取，與慣性空化有關(guān)，被認(rèn)為是提高基因轉(zhuǎn)染效率的主要機(jī)制。(3)微聲流，是微泡劇烈破裂時(shí)產(chǎn)生的沖擊波，作為驅(qū)動(dòng)力量，促使基因通過(guò)破裂的微血管和內(nèi)皮細(xì)胞間隙進(jìn)入靶細(xì)胞[4-5]。此外，有研究提出了微泡破裂導(dǎo)致過(guò)氧化氫生成，引起細(xì)胞膜Ca2+內(nèi)流和Ca2+依賴性K+通道開放，激發(fā)局部膜電位超極化，促進(jìn)外源基因通過(guò)胞吞和胞飲作用進(jìn)入細(xì)胞[6]。以上機(jī)制通過(guò)使血管內(nèi)皮細(xì)胞連接疏松，細(xì)胞膜通透性增高和促進(jìn)胞吞胞飲等促進(jìn)外源基因進(jìn)入靶組織，相互協(xié)同地提高基因轉(zhuǎn)染的效率。

3 UTMD研究新進(jìn)展

UTMD技術(shù)近年有顯著的發(fā)展，不斷更新?lián)Q代。在微泡的基礎(chǔ)上，有研究證實(shí)[7-8]，陽(yáng)離子微泡可通過(guò)靜電作用增強(qiáng)其基因攜帶能力，細(xì)胞膜和DNA同樣帶有負(fù)電荷，產(chǎn)生相互排斥的力量削減了DNA轉(zhuǎn)染的效率,而攜帶陽(yáng)離子的微泡可以更多結(jié)合帶負(fù)電荷的DNA，一定程度上克服了兩者間的斥力，更大程度增加了基因轉(zhuǎn)染效率。張東旸等[8]運(yùn)用UTMD技術(shù)通過(guò)陽(yáng)離子微泡實(shí)現(xiàn)向大鼠缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞靶向轉(zhuǎn)染AKT基因，在短時(shí)間內(nèi)基因在體內(nèi)復(fù)制，并證實(shí)與傳統(tǒng)微泡(DMB)相比，將AKT與陽(yáng)離子微泡一起投遞可以獲得更高的轉(zhuǎn)染效率和更優(yōu)的心臟功能改善。Du[9]等利用UTMD和陽(yáng)離子微泡將GDF11基因分別靶向轉(zhuǎn)染到衰老小鼠、I/R小鼠和心肌梗死小鼠的心臟，使GDF11有效且選擇性在心肌組織中過(guò)表達(dá)，降低了衰老標(biāo)志物p16和p53，以及衰老小鼠心臟中p16+細(xì)胞的數(shù)量，使 Sca-1+細(xì)胞的增殖增加，證實(shí)通過(guò)UTMD重復(fù)靶向傳遞GDF11基因可促進(jìn)衰老心臟的修復(fù)和損傷后組織再生，驗(yàn)證了UTMD結(jié)合陽(yáng)離子微泡作為基因轉(zhuǎn)染方式是安全有效的。

近年來(lái)隨著UTMD的應(yīng)用范圍日益廣泛，有研究發(fā)現(xiàn)，UTMD與其他技術(shù)結(jié)合可以發(fā)揮更大的基因轉(zhuǎn)染作用。(1)UTMD與脂質(zhì)體的結(jié)合發(fā)揮更強(qiáng)大的基因轉(zhuǎn)染作用[10]。張明等[11]發(fā)現(xiàn)，納米脂質(zhì)體包載生物大分子藥物FGF1結(jié)合UTMD技術(shù)可實(shí)現(xiàn) FGF1的心肌靶向遞送，通過(guò)抑制心肌氧化應(yīng)激損傷的途徑，改善糖尿病引起的心肌病理改變及心功能。主要原因與空化作用促進(jìn)外源DNA從包涵體中釋放，空化作用抑制胞吐作用有關(guān)[12]。(2)與外泌體聯(lián)用減輕心肌細(xì)胞對(duì)外泌體的耐藥性，增強(qiáng)外泌體在心肌組織中浸潤(rùn)，提高基因轉(zhuǎn)染效率[13]。(3)MBs與單克隆抗體耦聯(lián)提高其對(duì)組織器官的靶向性[14]。(4)結(jié)合核定位信號(hào)肽、AVV病毒載體提高轉(zhuǎn)染效率， 延長(zhǎng)外源基因表達(dá)時(shí)間，加強(qiáng)表達(dá)的穩(wěn)定性[15-17]。

4 UTMD在心臟病中的實(shí)驗(yàn)研究

4.1 UTMD在細(xì)胞中的應(yīng)用 UTMD介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染治療心臟病的靶組織主要是心肌和血管內(nèi)皮。有研究通過(guò)UTMD向缺氧的大鼠心肌細(xì)胞(H9C2)轉(zhuǎn)染shPHD2基因，結(jié)果表明UTMD能明顯增強(qiáng)外源基因在心肌細(xì)胞中的表達(dá)水平，而對(duì)細(xì)胞活性并無(wú)明顯影響[18]。Cao等[19]用UTMD方法向人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)轉(zhuǎn)染miR-126-3p基因，結(jié)果證實(shí)UTMD能明顯增強(qiáng)外源基因在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)，促進(jìn)了血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的合成和分泌，增強(qiáng)了內(nèi)皮細(xì)胞生成血管的潛能。

4.2 UTMD在小動(dòng)物模型中的應(yīng)用 UTMD技術(shù)的安全性和有效性在小動(dòng)物體內(nèi)得到反復(fù)驗(yàn)證，已被證明在臨床前評(píng)估中是可行的，以心肌梗死大鼠為動(dòng)物模型的基因轉(zhuǎn)染已經(jīng)相當(dāng)成熟。在大鼠體內(nèi)，先前的研究通過(guò)UTMD實(shí)現(xiàn)了shRNA介導(dǎo)PHD2、S100A6、MMP2、TATp、SDF-10a等基因的轉(zhuǎn)染，保護(hù)心臟免受急性心肌梗死的損傷[18，20-24]。Zhang等[18]應(yīng)用UTMD轉(zhuǎn)染shPHD2質(zhì)粒抑制HIF-1α的降解并增加了其下游血管生成因子VEGF和bFGF的水平，使心肌梗死大鼠心臟血管生成和收縮能力得到顯著改善。此外，缺血再灌注損傷是心力衰竭主要危險(xiǎn)因素之一，有研究[22]利用UTMD向缺血再灌注損傷的大鼠心臟轉(zhuǎn)染MMP2和Akt1，緩解心肌損傷和心室不良重塑，在基因治療的角度為解決臨床上心肌梗死患者遠(yuǎn)期預(yù)后不良提供了策略。也有研究向心肌梗死的兔心臟轉(zhuǎn)染CD151和Ang-1促進(jìn)梗死區(qū)域新生血管生成，達(dá)到治療目的[25-26]。

UTMD在其他心血管疾病方面也有著突出貢獻(xiàn)。Kopechek等[27]發(fā)現(xiàn)，UTMD介導(dǎo)antimiR-23a傳遞可抑制小鼠高血壓性心肌肥厚，保護(hù)心肌收縮功能，這提示可有針對(duì)性的制定臨床策略來(lái)調(diào)節(jié)人類心臟中的miRNA活性從而達(dá)到治療的目的，為將來(lái)的臨床轉(zhuǎn)化研究奠定了基礎(chǔ)。Huang等[28]發(fā)現(xiàn)通過(guò)UTMD向自發(fā)性高血壓大鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)染siGRK4可以降低其腎臟GRK4表達(dá)，從而作用于腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)使血壓下降。此外，UTMD在阿霉素心肌病、糖尿病性心肌病、化療相關(guān)心臟毒性及心臟移植急性排斥反應(yīng)等疾病的基因研究中也起著突出作用[29-32]。王卓等[33]首次使用UTMD技術(shù)轉(zhuǎn)染siGal-7，選擇性地抑制介導(dǎo)急性排斥反應(yīng)的半乳糖凝集素-7的合成和分泌，使移植心臟的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和壞死明顯減少，并將免疫抑制作用局限于心肌，避免了激素及多克隆抗體帶來(lái)的感染風(fēng)險(xiǎn)和其他全身不良反應(yīng)。

4.3 UTMD在大動(dòng)物模型中的應(yīng)用 UTMD在大動(dòng)物應(yīng)用上還處于探索階段。大動(dòng)物比小動(dòng)物模型心肌壁相對(duì)較厚，冠狀動(dòng)脈解剖清晰，精準(zhǔn)結(jié)扎目標(biāo)動(dòng)脈，對(duì)轉(zhuǎn)染后梗死區(qū)域變化評(píng)估更加精準(zhǔn)。在以中大型犬為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的研究中，利用UTMD引起心肌梗死犬心肌微環(huán)境改變，而心肌微環(huán)境對(duì)干細(xì)胞的存活、遷移和分化起著決定性作用，UTMD導(dǎo)致的輕度炎性反應(yīng)改變和心肌損傷使MSCs移植效率及對(duì)心肌梗死的治療作用明顯增強(qiáng)[34-35]。有實(shí)驗(yàn)分別利用1 MHZ、1.0 W/cm2和300 KHZ、2.0 W/cm2UTMD將HGF、Ang-1基因轉(zhuǎn)染至心肌梗死犬心臟中促進(jìn)新生血管生成，減少心室重構(gòu)和梗死面積，達(dá)到改善心功能的目的，不但用結(jié)合核定位信號(hào)肽和冠狀動(dòng)脈注射的方式提高了單純靜脈注射的效率，并且在參數(shù)選擇上有了更深入的探索[36-38]。由于豬的組織與人的解剖結(jié)構(gòu)十分相似，以豬為動(dòng)物模型的研究有著近乎臨床應(yīng)用價(jià)值，但目前此類研究較少。早期有研究將UTMD用于改變心肌梗死豬的心肌微環(huán)境促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCS)在心肌梗死區(qū)域的歸巢，近年來(lái)也用于基因直接轉(zhuǎn)染[39]。Schlegel等[16]向豬前室間靜脈注入AVV6-Luc MBs，在1.3 MHZ、機(jī)械指數(shù)1.6的超聲下靶向轉(zhuǎn)染熒光素酶基因，增加了外源基因在特定心臟部位的表達(dá)，并且短期內(nèi)未發(fā)現(xiàn)心肌損傷。冠狀動(dòng)脈微栓塞是PCI后重要并發(fā)癥，其誘導(dǎo)的心肌炎性反應(yīng)是心功能障礙的主要原因。有學(xué)者建立了豬的冠狀動(dòng)脈微栓塞模型，用UTMD靶向轉(zhuǎn)染microRNA-21到心臟，通過(guò)抑制PDCD4/NF-κB/TNF-α通路抑制心肌炎性反應(yīng)，改善心臟功能，并進(jìn)一步探索了超聲參數(shù)，認(rèn)為2.0 W/cm2的脈沖強(qiáng)度在豬的心臟應(yīng)用是適宜的[39-40]。可見，盡管UTMD作為一種新的基因轉(zhuǎn)染方式已被廣泛證實(shí)，但目前的研究大多是基于小動(dòng)物模型。為更好的臨床轉(zhuǎn)化，需要進(jìn)行更多的大型動(dòng)物研究進(jìn)一步評(píng)估其可行性和安全性。

5 UTMD在心臟病中的臨床研究

目前，UTMD在心臟病基因治療方面還未有應(yīng)用于臨床的報(bào)道，但在心臟病超聲診斷中的應(yīng)用十分廣泛。超聲微泡是良好的造影劑，與紅細(xì)胞相似的直徑使其既可以通過(guò)肺部毛細(xì)血管不被破壞，也不會(huì)被腎小球?yàn)V過(guò)，在血液中性質(zhì)穩(wěn)定。當(dāng)微泡在特定的器官系統(tǒng)中循環(huán)，超聲波可以引起微泡內(nèi)氣體顯著的振蕩和壓縮，這種變化產(chǎn)生的諧波回聲，使血池和心內(nèi)膜的輪廓清晰，在體內(nèi)產(chǎn)生增強(qiáng)的超聲造影。普通超聲對(duì)于評(píng)估肥胖、肺氣腫和胸壁畸形患者往往顯影不良，而超聲微泡檢查在心功能診斷中具有更高的敏感度和準(zhǔn)確度[41]。皮淑芳等[42]報(bào)道1例因肥胖導(dǎo)致透聲條件差的心力衰竭患者，采用超聲微泡檢查清晰地顯示心肌致密化不全，左心室側(cè)壁及心尖部肌小梁粗大，深陷隱窩內(nèi)可見微泡填充，致密層和非致密層分界清楚，診斷為心肌致密化不全心肌病，為患者避免了危險(xiǎn)性高的心肌活檢和誤診的可能。Larsson等[43]分別用普通超聲和超聲微泡檢查患者左心室射血分?jǐn)?shù)和左心室容積，在普通超聲檢查中，不同超聲醫(yī)師之間得出的結(jié)果存在顯著差異，而采用超聲微泡檢查，這種差異性明顯降低，提示超聲微泡檢查減少了超聲醫(yī)師主觀偏倚造成的結(jié)果差異。

此外，超聲微泡在心肌微灌注造影和血栓診治方面亦有突出貢獻(xiàn)。超聲微泡不但能夠清晰地顯示心腔結(jié)構(gòu)，而且能夠床旁檢查并且實(shí)時(shí)觀察心肌微循環(huán)灌注，對(duì)于相關(guān)疾病的確診具有重要意義，尤其在超聲微泡在評(píng)估冠狀動(dòng)脈血流方面，具有及時(shí)性和實(shí)時(shí)性等優(yōu)點(diǎn)[44]。Senior等[45]比較了516例冠心病患者的超聲微泡檢查和單光子發(fā)射斷層掃描，發(fā)現(xiàn)超聲微泡檢查具有更高的敏感度。血栓對(duì)人體有嚴(yán)重危害，溶栓和抗凝藥物亦有極大的臨床風(fēng)險(xiǎn)。一定強(qiáng)度的超聲輻照產(chǎn)生的空化效應(yīng)可使血栓軟化甚至溶解，也有研究在靶向微泡中包裹溶栓藥物，定向爆破微泡釋放藥物可增加溶栓效果，提升心肌灌注、改善心功能。綜上，UTMD在心臟病超聲診斷中的應(yīng)用效果較好，給基因轉(zhuǎn)染和藥物遞送的臨床研究奠定了一定基礎(chǔ)。

6 問(wèn)題與展望

越來(lái)越多的臨床前研究證實(shí)UTMD具有低免疫原性、無(wú)創(chuàng)、靶向性、實(shí)用潛力大等優(yōu)點(diǎn)，肯定了其在治療心血管疾病方面的潛在價(jià)值。然而，UTMD在臨床應(yīng)用前的技術(shù)改進(jìn)仍需進(jìn)一步研究：(1)超聲靶向微泡擊碎技術(shù)最佳參數(shù)目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，針對(duì)不同組織、不同基因及不同疾病的單獨(dú)優(yōu)化方案需要進(jìn)行更多的實(shí)用性研究；(2)缺乏較長(zhǎng)期的隨訪，無(wú)法對(duì)遠(yuǎn)期治療效果和基因的長(zhǎng)期表達(dá)進(jìn)行評(píng)估；(3)缺乏在大動(dòng)物模型中應(yīng)用的研究，是臨床轉(zhuǎn)化的最大阻礙之一；(4)UTMD應(yīng)用于臨床的安全性尚需進(jìn)一步研究和論證?？梢?，盡管許多研究肯定了UTMD的實(shí)用價(jià)值，但目前這項(xiàng)技術(shù)仍需不斷完善。

綜上所述，UTMD有很強(qiáng)的潛力用于心臟病基因治療，但是未來(lái)研究會(huì)面臨諸多挑戰(zhàn)。隨著研究的深入和技術(shù)的進(jìn)步，更多治療基因位點(diǎn)被發(fā)掘，疾病譜和基因數(shù)據(jù)庫(kù)不斷完善，相信這項(xiàng)技術(shù)會(huì)朝著更加個(gè)體化、高效、安全和靶向性強(qiáng)的方向不斷發(fā)展，成為臨床上心血管疾病基因治療的理想途徑。