楊 坤綜述 陳謙學審校

膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）是成人最常見的顱內惡性腫瘤[1]，標準的治療方案包括最大而安全的腫瘤切除輔以放療和化療，但預后很差，中位生存期僅12～15個月[2]。近年來，晚期癌癥的治療更多地轉向免疫治療。目前，有多種形式的免疫治療，如樹突狀細胞疫苗、免疫檢查點抑制劑和過繼T細胞療法（adoptive T cell therapy，ACT）。ACT包括腫瘤浸潤淋巴細胞、細胞因子誘導的殺傷細胞、工程T細胞和嵌合型抗原受體修飾T細胞（chimeric antigen receptor modified T-cell，CAR-T）等。CAR-T是將病人的T細胞加工并表達相關嵌合抗原受體后，回輸至腫瘤病人體內并對抗原相關腫瘤細胞進行殺傷的一種新型治療手段。本文就CAR-T在GBM治療中研究進展進行綜述。

1 CAR-T療法簡介

CAR-T治療是將病人的T細胞加工，用重組逆轉錄病毒載體將編碼CAR的RNA或DNA轉導至T細胞中短暫地或永久地表達，使其表達由胞外腫瘤特異性抗體單克隆片段、胞內信號傳導結構域和/或共刺激分子組成的嵌合性抗原受體，回輸至腫瘤病人體內，在死亡受體/死亡受體配體的作用下激活死亡受體，分泌破壞腫瘤細胞的穿孔素酶，從而誘導細胞毒性殺傷腫瘤細胞的技術。該療法綜合運用轉基因技術、現(xiàn)代T細胞分離培養(yǎng)技術和腫瘤生物學技術、T細胞分離技術培養(yǎng)活化技術等。

CAR-T治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤，諸如B細胞急性淋巴細胞白血病、急性淋巴細胞白血病、急性髓性白血病慢性淋巴細胞白血病和非霍奇金淋巴瘤等，有良好的效果[3]，特別是復發(fā)或難治性大B細胞急性淋巴細胞白血病，其完全緩解率高達90%。其他實體腫瘤，如非小細胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌等，也有文獻報道[4]。美國聯(lián)邦食品藥品監(jiān)督管理局于2017年批準CD19導向的CAR-T用于治療經(jīng)過兩種或兩種以上系統(tǒng)治療后復發(fā)或難治性大B細胞淋巴瘤的成年病人[5]。

CAR-T主要結構包括：特異性識別腫瘤相關抗原的胞外區(qū)、鉸鏈區(qū)、跨膜結構域以及細胞內T細胞活化/信號域四部分組成。細胞外結構域由單鏈可變片段組成，來自于抗體的輕鏈和重鏈，T細胞表面將抗體的單鏈可變片段與T細胞受體信號域CD3結合，使抗體樣抗原識別具有T細胞溶細胞活性，腫瘤相關抗原的受體也可作為CAR-T胞外的特異性識別功能區(qū)，故CAR-T能夠以非主要組織相容性復合體受限的方式識別抗原，并隨后被激活。胞外抗原結合區(qū)由來源于單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)組成，可特異性識別腫瘤表面抗原，是CAR-T特異性基礎，其和鉸鏈區(qū)連接形成單鏈抗體。CART的跨膜區(qū)由同源或異源的CD4、CD8或CD28等二聚體膜蛋白組成，通過CAR二聚化以及與內源性T細胞抗原受體的相互作用產(chǎn)生的信號，可促進T細胞活化，其相連的信號轉導區(qū)對CAR-T的增殖、體內存活時間以及抗腫瘤活性具有重要作用，該區(qū)域導入共刺激分子4-1BB后，CAR-T在體內的存活時間顯著延長，抗腫瘤效應也顯著增強[6]。

2 CAR-T療法的最新發(fā)展

20世紀90年代，T細胞工程作為免疫療法建立。第一代的CAR僅有一個胞內信號組分，CD3ζ或者FcεRIγ分子，CD3不變鏈的胞質部分包含保守的可磷酸化，產(chǎn)生胞內第一信號，并與胞質蛋白絡氨酸激酶Zap-70結合，從而啟動T細胞受體（T cell receptor，TCR）早期信號。由于胞內只有一個活化結構域，所以，T細胞不能有效地增殖和分泌細胞因子，不能產(chǎn)生明顯的體內抗腫瘤效應和臨床治療效果。第二代只有一個共刺激分子，如CD28、4-1BB。CD28與靶細胞或抗原提呈細胞表面的CD80或CD86結合，產(chǎn)生T細胞早期活化的“第二信號”，細胞外調節(jié)蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶、核因子-κB及胞內磷脂酰肌醇激酶-蛋白激酶B等可被激活，使白介素2、干擾素-γ等多種細胞因子表達上調[7]，保持并增強T細胞的功能活性，從而使其對腫瘤的持續(xù)殺傷成為可能[8]。4-1BB共刺激信號促進細胞因子分泌，通過影響CD8+T細胞，保證T細胞在體內長期生存并保持其記憶功能及各信號通路的激活，誘導抗凋亡因子的表達。第三代的CAR-T，將CD28和4-1BB/OX40串聯(lián)起來與CD3ζ鏈連接，將早期活化信號與持續(xù)活化信號相結合，持續(xù)增強細胞活力。第四代CAR通過聯(lián)合細胞因子或共刺激分子的配體，這些細胞因子在增強CAR-T的擴張和持久性的同時，使其對免疫抑制腫瘤環(huán)境具有抵抗力[9]。

基因編輯技術，如轉錄激活因子樣效應物核酸酶和基因編輯技術系統(tǒng)，可修改T細胞基因組。這些技術可以通過靶向破壞基因，如負T細胞調節(jié)因子，也可增強某些基因來強化CAR-T功能及活性[10]。有研究顯示，通過轉基因過表達白介素-15，能促進T細胞的活化，從而提高CAR-T的體外持久性，過表達細胞因子受體，如白介素-7受體，也顯示出良好的效果[11]。

在腫瘤微環(huán)境中，治療性和內生性激活的T細胞都受到免疫檢查點抑制水平升高的影響，聯(lián)合使用程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1，PD-1）/程序性死亡受體-配體1（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）的阻斷抗體有望提高CAR-T的抗腫瘤效果。檢查點阻斷治療實體腫瘤，如非小細胞肺癌和轉移性黑色素瘤，具有一定的效果。T細胞免疫球蛋白黏液素3、淋巴細胞激活基因-3、細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4和PD-1等免疫檢查點蛋白在美國于2011年批準用于相關腫瘤的治療。腫瘤細胞在受到免疫攻擊后會上調免疫抑制性配體，如PD-L1的表達，這些配體與CAR-T的相應受體如PD-1結合，可明顯抑制T細胞的殺傷活性，從而減弱其抗腫瘤效果，敲除PD-1均可顯著增強抗腫瘤活性和對腫瘤微環(huán)境的耐受性[12，13]。除了在T細胞表面表達負調控因子外，細胞內信號分子也被用作CAR-T敲除的潛在靶點。二酰基甘油激酶通過二?；视偷拇x負調控CAR-T活化，從而抑制相應細胞內信號通路。

單一靶向抗原的CAR-T治療會使腫瘤組織靶抗原下調進而導致腫瘤復發(fā)，靶抗原下調和或抗原陰性腫瘤細胞克隆擴增可能是這一現(xiàn)象的原因。CAR-T靶向多個抗原的一種方法是使用雙抗原靶向CAR，在一個CAR結構中包含兩個抗原靶向域。Hegde等[14]描述一種將人表皮生長因子受體-2和白介素13受體α2等兩個膠質瘤相關抗原結合一起的CAR-T對腫瘤的殺傷能力大大增強并使腫瘤復發(fā)的減少。而添加酪氨酸蛋白激酶受體A2抗原共識別的CAR-T比雙特異性CAR-T更有效[15]。多腫瘤相關抗原在臨床前動物模型中及部分臨床試驗中取得了較好的結果[16]。

3 CAR-T療法在GBM中的運用及面臨的困難

傳統(tǒng)觀點認為設計CAR-T治療GBM的主要挑戰(zhàn)之一是血腦屏障的半滲透性，使CAR-T在腫瘤組織中的侵潤存在困難，但Mount等[9]通過大鼠研究發(fā)現(xiàn)，CAR-T治療中活化的T細胞可以滲透到中樞神經(jīng)系統(tǒng)并抵達腫瘤區(qū)域。血腦屏障由專門的內皮細胞組成，可以阻止大型親水分子和不需要的細胞進入大腦。目前幾乎所有GBM的CAR-T試驗都是采用靜脈途徑，但GBM血腦屏障破壞，在腫瘤的某些區(qū)域形成異常血管，在臨床實踐中也可以考慮通過手術方式直接將CAR-T送入腫瘤區(qū)域。

GBM周圍混合有實質間質細胞、非腫瘤性星形膠質細胞、多種浸潤性炎癥細胞、內源性神經(jīng)干細胞和祖細胞。腫瘤體積的大部分由腫瘤相關的小膠質細胞/巨噬細胞組成，促進膠質瘤的遷移、侵襲和腫瘤生長。GBM微環(huán)境中巨噬細胞和骨髓源性抑制細胞，在指導免疫抑制反應中也起重要作用。膠質瘤干細胞在腫瘤微環(huán)境中也很重要，是腫瘤增殖、維持和治療耐藥的關鍵因素。CAR-T輸注后，GBM吲哚胺2,3-雙加氧酶等免疫抑制分子上調，導致T細胞持久性較差[15]。因此，可能需要專門針對中樞神經(jīng)系統(tǒng)獨特的免疫抑制環(huán)境制定相應的方案，以便好地開發(fā)CAR-T。

CAR-T成功治療實體瘤的報道還很少，細胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome，CRS）是CAR治療中最常見的和最嚴重的毒性之一，其由高水平的免疫激活引起。CRS反應強烈的嚴重損傷或死亡案例主要見于靜脈CAR-T治療，故安全性將是該療法考慮的首要因素。

脫靶效應是CAR-T療法存在的另一個重要困難。如人表皮生長因子受體-2在正常肺組織表達，有文獻報道使用人表皮生長因子受體-2的CAR-T治療后出現(xiàn)呼吸衰竭、多器官衰竭，并隨后死亡[17]。由于腫瘤細胞的異質性、高突變性和腫瘤相關抗原的表達譜在治療后可能發(fā)生改變。在接受白介素13受體α2CAR-T治療的病人中，治療后對腫瘤組織的分析顯示白介素13受體α2的總體表達降低[18]。

總之，CAR-T治療腫瘤的臨床應用還處于起步階段，其在GBM與在其他實體腫瘤運用中遇到的困難相似，尋找腫瘤特異性抗原、減輕CAR-T對正常細胞攻擊產(chǎn)生的脫靶效應、抑制經(jīng)修飾后的CAR-T可能潛在的在體內的免疫排斥反應、克服對腫瘤實體的浸潤和在腫瘤內的免疫抑制微環(huán)境的障礙，是CAR-T治療GBM的挑戰(zhàn)性因素。