江佳佳，吳佩佩，許文榮

(1. 江蘇大學(xué)附屬澳洋醫(yī)院腫瘤研究院，江蘇 蘇州 215600； 2. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

惡性腫瘤的早預(yù)防、早診斷和早治療是精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)和個體化治療的關(guān)鍵。目前臨床采用的腫瘤診斷指標(biāo)多為血清中蛋白類分子，其特異性及敏感性均不高[1]，因此，亟須開拓早期非創(chuàng)傷性的診斷標(biāo)志物。液體活檢是一種非侵入性的血液檢測突破性技術(shù)，能早期快速地檢測腫瘤及其病灶或者轉(zhuǎn)移過程中釋放到血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell，CTC)、循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)和腫瘤外泌體等腫瘤組分。腫瘤外泌體作為液體活檢的一個重要組成，基于其內(nèi)容物成分多樣和穩(wěn)定等優(yōu)勢，正成為腫瘤標(biāo)志物相關(guān)研究的熱點。

腫瘤異質(zhì)性、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥等依然是腫瘤難治的主要原因，而以手術(shù)、化療和放療為主的治療手段，由于靶向性不足、藥物和放療的毒副作用等諸多挑戰(zhàn)，導(dǎo)致腫瘤的治療效果不佳。有研究表明，腫瘤治療不能僅針對惡性腫瘤細(xì)胞，更要考慮到腫瘤微環(huán)境的影響[2]。腫瘤來源納米大小的外泌體具有易通過血腦屏障、天然的歸巢特性、雙分子層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和高效的生物相容性等特征。因此，腫瘤外泌體正成為腫瘤靶向治療理想的載體，尤其是工程化外泌體更表現(xiàn)出卓越的腫瘤靶向干預(yù)和增強藥物治療的效果(圖1)。

1 腫瘤外泌體與液體活檢

疾病診斷和預(yù)后監(jiān)測的理想生物標(biāo)志物一般具備以下特點：通過無創(chuàng)性操作易于獲得，高度的敏感性和特異性，對疾病的早期階段具有診斷能力，樣本有較長的半衰期，檢測方法快速準(zhǔn)確等。針對CTC、ctDNA和腫瘤外泌體等成分進行檢測的液體活檢技術(shù)已成為轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中快速發(fā)展的領(lǐng)域[3]。外泌體能攜帶多種生物活性分子循環(huán)于血液/體液中并介導(dǎo)長距離的細(xì)胞間通訊，腫瘤來源外泌體富含的蛋白質(zhì)、核苷酸、脂質(zhì)等分子能夠反映其來源細(xì)胞的生理及病理狀態(tài)，外泌體特殊的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)能保護其內(nèi)RNA等分子免于降解，因此，檢測腫瘤外泌體成為液體活檢一個顯著優(yōu)勢[4-5]。臨床試驗研究表明，外泌體在多種疾病的早期診斷、療效和預(yù)后監(jiān)測等方面都具備較好的應(yīng)用價值，正逐漸成為臨床診療中新的、理想的生物標(biāo)志物和可能的靶向藥物載體。隨著技術(shù)的進步，組學(xué)時代的到來，大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)被聯(lián)合應(yīng)用于篩選和揭示多種癌癥細(xì)胞外囊泡的標(biāo)志物[6]。

1.1 腫瘤外泌體樣本的采集

在血液和大多數(shù)體液(如尿液、腦脊液、唾液、胸腹腔積液、羊水和乳汁等)中均可檢測到外泌體。血液外泌體的檢測通常采用EDTA抗凝血分離的血漿，miRNA等一些微小RNA則采用血清樣本[7]。泌尿系統(tǒng)中存在大量的RNA水解酶可降解尿液中的裸miRNAs，但外泌體外膜則可幫助RNA免于被降解，因此研究尿液外泌體miRNAs更具有應(yīng)用價值[8]。相較于血清中相關(guān)miRNA的水平，腦脊液外泌體中的miR-21可作為膠質(zhì)瘤診斷和預(yù)后的指標(biāo)，特別對預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移具有價值[9]。唾液樣本在安靜狀態(tài)下主要來源于舌下腺和頜下腺，刺激狀態(tài)下則主要來源于腮腺[10]。

1.2 腫瘤外泌體樣本的提取

目前較為常用的外泌體提取方法包括離心法(超速差速離心法、蔗糖密度梯度離心法)，磁珠分選法，微流控技術(shù)和試劑盒法提取試劑盒等。而不同提取方法獲得的外泌體在產(chǎn)量、純度和顆粒完整性等方面差異較大。超速差速離心法是目前較為公認(rèn)的分離外泌體的經(jīng)典方法，被用于細(xì)胞培養(yǎng)液及體液的外泌體分離，主要是基于細(xì)胞外囊泡(extracelluar vesicles，EVs)的大小、密度等，但耗時且所獲得的外泌體純度低，并可能會破壞其形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)[7]。蔗糖密度梯度離心法根據(jù)不同物質(zhì)密度分離外泌體，所獲得外泌體純度較高，適用于外泌體形態(tài)學(xué)的鑒定，但耗時、產(chǎn)量低[7]。免疫磁珠捕獲法通過結(jié)合單克隆抗體來捕獲暴露特定配體的EVs，簡單省時且分離純度較高，可用于臨床，但不適于大體積樣本的分離，且所獲外泌體活性受到一定影響，不利于后續(xù)功能學(xué)研究[7]。微流控技術(shù)是利用外泌體在微量體上的物理和生物化學(xué)特性來進行快速有效地分離，省時高效，但不適于大體積樣本分離[11]。外泌體分離商業(yè)試劑盒主要用于尿液、血清、腦脊液和細(xì)胞培養(yǎng)基等無細(xì)胞樣本，并提取所獲外泌體RNA進行miRNA檢測和表達(dá)譜分析[11]。流式細(xì)胞分選法純度高，能特異性分選某種細(xì)胞來源的外泌體，適合后續(xù)功能學(xué)研究，同樣不適于大體積樣本的分選[7]。根據(jù)實驗?zāi)康囊约俺杀究紤]，研究人員應(yīng)根據(jù)實際情況選擇最適宜的分離方法。

2 腫瘤外泌體標(biāo)志物的應(yīng)用

外泌體富含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸分子，這些分子具有來源細(xì)胞的特異性，所以通過分析腫瘤細(xì)胞所釋放的外泌體分子特征就可部分反映其來源細(xì)胞表型及其生物學(xué)作用[3,12]。

2.1 外泌體蛋白標(biāo)志物

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種腫瘤外泌體來源的蛋白類分子標(biāo)志物。例如，乳腺癌、結(jié)腸癌和胰腺癌中均可檢測到磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(glypican 1，GPC1)的表達(dá)，且與乳腺癌和結(jié)腸癌相比，GPC1對胰腺癌的早期診斷尤具價值[13-14]。前列腺癌患者血漿外泌體中凋亡抑制蛋白的表達(dá)增高則提示與腫瘤進展相關(guān)[15]。隨著蛋白組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血液外泌體來源的蛋白標(biāo)志物其診斷特異性和敏感性分別可達(dá)到95%和90%[6]。

2.2 外泌體miRNA分子標(biāo)志物

miRNA是腫瘤外泌體檢測中較常見的標(biāo)志物，到目前為止已鑒別了2 500余種miRNAs分子[16-18]。例如，血液外泌體miR-21的升高已被證實與胰腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌及食管癌等多種腫瘤相關(guān)，可能與其參與腫瘤血管生成有關(guān)，研究表明肺癌細(xì)胞釋放的外泌體miR-21會通過STAT3依賴機制誘導(dǎo)周圍支氣管細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的產(chǎn)生，從而促進血管生成[19-20]。在食管癌中，miR-21還可以反映腫瘤的惡性程度，食管癌患者的miR-21水平與良性腫瘤患者相比急劇上升，上升的miR-21水平也與腫瘤的淋巴侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)[21]。在膀胱癌患者中，尿液中的miR-21和miR-4454會顯著上調(diào)[18]。前列腺癌患者尿液外泌體中的miR-574-3p、miR-141-5p和miR-21-5p的表達(dá)水平顯著上升，表明這些miRNAs可用于前列腺癌的早期篩查[22]。膽管癌是惡性程度較高的消化系統(tǒng)腫瘤，發(fā)展隱蔽且臨床癥狀及體征出現(xiàn)晚，故給早期診斷帶來困難。高通量小RNA測序篩查了來自膽管癌和膽囊癌患者外泌體中一系列差異表達(dá)的miRNA，小RNA長度在正常個體、膽管癌患者和膽囊癌患者之間的分布存在顯著差異，膽管癌患者的外泌體中miR-96-5p、miR-151a-5p、miR-191-5p、miR-4732-3p顯著升高，而膽囊癌患者的外泌體中miR-151a-5p略有升高，為膽管癌和膽囊癌提供了一套新的生物診斷標(biāo)志物[23]。

2.3 外泌體長鏈非編碼RNA分子標(biāo)志物

當(dāng)前，應(yīng)用于胃癌診斷的血清生物標(biāo)志物包括癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、癌抗原72-4(CA72-4)和CA19-9，然而這些分子的特異性和敏感性均較低[1]。因此，開發(fā)具有高特異性和敏感性的診斷早期胃癌的新方法至關(guān)重要[24]。胃癌相關(guān)的長鏈非編碼RNA1(lncRNA-GC1)在胃癌發(fā)生中起重要作用，但是外泌體lncRNA-GC1及其在胃癌中的潛在作用此前研究較少。研究證實，循環(huán)外泌體lncRNA-GC1具有作為早期檢測和監(jiān)測胃癌進展的重要診斷價值，可作為無創(chuàng)生物標(biāo)志物用于早期診斷和監(jiān)測胃癌進展[25]。上述研究表明，腫瘤外泌體內(nèi)的lncRNA分子在一些腫瘤相關(guān)疾病中同樣具有重要的診斷應(yīng)用價值。

2.4 外泌體circRNA分子標(biāo)志物

近年來，circRNA分子因獨特的環(huán)狀結(jié)構(gòu)具備更穩(wěn)定的生物學(xué)特性而備受關(guān)注。如circZKSCAN1在肝癌細(xì)胞中低表達(dá)且抑制肝癌細(xì)胞的增殖[26]，ciRS-7則被認(rèn)為是非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌和胃癌等腫瘤的預(yù)后指標(biāo)，其高表達(dá)與較高的臨床分期和較差的總體生存期相關(guān)[27]。目前已發(fā)現(xiàn)組織、血液和外泌體中的circRNA分子表達(dá)失調(diào)，而多種circRNA的聯(lián)合檢測會提高外泌體標(biāo)志物的敏感性和特異性，甚至可達(dá)到90%左右[4,28]。

3 腫瘤外泌體與靶向治療

外泌體可作為納米載體來介導(dǎo)細(xì)胞間的信息傳遞，發(fā)揮信息傳遞作用的方式主要有：在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移受體，通過配體-受體介導(dǎo)的方式作用于受體細(xì)胞，向受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移功能蛋白，通過膜融合方式向受體細(xì)胞傳遞mRNA、miRNAs或轉(zhuǎn)錄因子等信息[29-32]。這些方式為腫瘤靶向治療開辟了新的途徑。例如，miRNA-130b-3p可通過p53信號通路靶向絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(SIK1)抑制髓母細(xì)胞瘤生長[16]。

外泌體廣泛分布于不同體液中，在體內(nèi)有較長的半衰期，可利用電穿孔法、化學(xué)轉(zhuǎn)染法或共孵育等方式把治療性藥物裝載到外泌體中或?qū)⒕幋a某蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)入到分泌外泌體的細(xì)胞中[33]。例如，合成的miR159可通過靶向編碼Wnt信號轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄因子7(TCF7)基因抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，導(dǎo)致致癌蛋白MYC水平下降，異體移植乳腺腫瘤的動物模型也顯示口服植物源性miR159可顯著抑制腫瘤生長[34]。腫瘤細(xì)胞衍生的微粒(tumor derived microparticles，TMPs)可以用作化療藥物的載體，同時可作為免疫調(diào)節(jié)劑發(fā)揮抗腫瘤治療效應(yīng)。近期，一項臨床研究顯示，腫瘤細(xì)胞衍生的含甲氨蝶呤的TMPs能夠有效緩解膽管癌患者發(fā)生膽道梗阻的癥狀[35]。綜上表明，天然或者工程化修飾的外泌體或可用于治療難治性腫瘤。

4 腫瘤外泌體與耐藥

現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)多種外泌體來源的circRNA分子可能與腫瘤耐藥性相關(guān)，如has_circ_0004015高表達(dá)與酪氨酸激酶抑制劑耐藥相關(guān)，該分子可能通過與miR-1183結(jié)合靶向磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(PDPK1)基因，從而導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌對吉非替尼耐藥；circAKT3的高表達(dá)與胃癌對順鉑耐藥相關(guān)[36]。單細(xì)胞RNA測序確定了一種新的與癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞(cancer associated fibroblast，CAF)亞群CD63+CAFs，分泌富含miR-22的外泌體，miR-22可以結(jié)合其靶標(biāo)雌激素受體α(ERα)和磷脂酶及張力蛋白同源物(PTEN)，從而促進乳腺癌細(xì)胞他莫昔芬抗性，使ERα陽性的乳腺癌患者對他莫昔芬產(chǎn)生耐藥性并伴有轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)[37]。CAFs的EVs蛋白質(zhì)組學(xué)分析確定了膜聯(lián)蛋白A6的重要作用，其通過激活β1整聯(lián)蛋白-局灶性黏附激酶(FAK)-YAP信號從而誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)中胃癌細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的形成和耐藥的發(fā)生。這些發(fā)現(xiàn)表明，耐藥性是由CAFs的EVs中的膜聯(lián)蛋白A6賦予，并通過結(jié)合常規(guī)化學(xué)療法抑制FAK-YAP信號傳導(dǎo)，這為抑制胃癌耐藥性提供了潛在途徑[38]。

5 腫瘤外泌體與腫瘤發(fā)生、發(fā)展

腫瘤細(xì)胞來源的外泌體可抑制T細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，或抑制NK細(xì)胞促進腫瘤免疫[39-40]；能抑制抗原遞呈細(xì)胞的分化和成熟，從而抑制免疫反應(yīng)[41]；可促進髓系抑制性細(xì)胞抑制免疫應(yīng)答[42]；通過抑制T細(xì)胞增殖誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化以協(xié)助腫瘤逃逸免疫監(jiān)視，最終促進腫瘤的發(fā)生[43]。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞通過EVs傳遞缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)穩(wěn)定的lncRNA，增強乳腺癌細(xì)胞的有氧糖酵解和細(xì)胞凋亡抗性，從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的代謝重編程[44]。另一項研究顯示，外泌體內(nèi)circSHKBP1可通過調(diào)節(jié)miR-582-3p/HUR/VEGF途徑，抑制HSP90降解，促進胃癌進展，是探索進一步治療的絕佳候選者[45]。

研究還發(fā)現(xiàn)外泌體可促進血管生成，如心肌內(nèi)皮細(xì)胞來源的外泌體能夠誘導(dǎo)細(xì)胞增殖及血管生成；黑色素瘤細(xì)胞來源的外泌體中miR-9通過抑制細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子5(SOCS5)的表達(dá)激活了JAK-STAT信號通路，從而促進內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和血管生成[46]。此外，腫瘤細(xì)胞來源的外泌體能促進腫瘤的轉(zhuǎn)移，還可轉(zhuǎn)運具有侵襲潛能的miRNA[47]，也可通過促進腫瘤細(xì)胞的上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化來增強腫瘤的轉(zhuǎn)移性進展[12]。例如，外泌體可釋放轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)激活TGF-β信號通路，使成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌杉±w維細(xì)胞，從而促進腫瘤的轉(zhuǎn)移[48]。除了細(xì)胞來源外泌體對腫瘤的影響外，細(xì)菌也是影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素。最新研究顯示，具核梭桿菌是一種重要的結(jié)直腸癌相關(guān)細(xì)菌，感染該菌后可刺激結(jié)直腸癌細(xì)胞生成富含miR-1246/92b-3p/27a-3p和CXCL16/RhoA/IL-8的外泌體并遞送至未感染的細(xì)胞，促進腫瘤轉(zhuǎn)移[49]。

6 結(jié)語

由于外泌體分離方法存在差異化，檢測方法缺乏標(biāo)準(zhǔn)化以及樣本來源不一致等因素，研究報道的外泌體標(biāo)志物檢測結(jié)果差異較大，常有矛盾之處[50]。因此，提高外泌體分離的提取效率是外泌體臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用過程中值得關(guān)注和解決的首要問題。蛋白組學(xué)分析結(jié)果表明，血液外泌體中蛋白類標(biāo)志物具備成為早期診斷標(biāo)志物和鑒別原發(fā)性腫瘤的潛力[6]，外泌體中miRNA和circRNA分子的研究則為臨床建立特異性檢測Panel提供了依據(jù)。

外泌體傳遞細(xì)胞間遺傳信息的機制是引起腫瘤異質(zhì)性的重要因素之一[51]。在腫瘤異質(zhì)性環(huán)境中，外泌體可促進腫瘤的進展[52]，也可能通過信號傳導(dǎo)在治療方面產(chǎn)生腫瘤異質(zhì)性[53]。此外，不同細(xì)胞生成的外泌體也存在異質(zhì)性，Baietti等[54]發(fā)現(xiàn)沉默液泡分選蛋白4(VPS4)基因和腫瘤易感基因101蛋白(TSG-101)基因均可抑制乳腺癌MCF7細(xì)胞產(chǎn)生外泌體。因此，在選擇外泌體作為腫瘤診斷與預(yù)后監(jiān)測的分子標(biāo)志物時應(yīng)考慮到腫瘤異質(zhì)性的發(fā)生機制。

外泌體是機體來源的自然成分，能在體內(nèi)穩(wěn)定存在，經(jīng)過特定修飾后具有靶向性，但也需關(guān)注外泌體的靶向性與耐藥性的關(guān)系。目前，天然或者工程化修飾的外泌體被視為一種理想工具用于治療一些難治性腫瘤。因此，外泌體在靶向治療中的應(yīng)用前景值得期待和進一步挖掘。