血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2在SARS-CoV-2感染中的作用機(jī)制研究進(jìn)展

王薈，呂巧怡，趙楊靜，吳皓杰，邵啟祥

(1. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 江蘇省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

1 SARS-CoV-2與COVID-19概述

2019年底一場(chǎng)不明原因的肺炎暴發(fā)于湖北武漢，隨后確認(rèn)為新型冠狀病毒感染，該病毒最初被命名為2019-nCoV，2019年2月11日，國(guó)際病毒分類委員會(huì)(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)將新型冠狀病毒(2019-nCoV)官方命名為重癥急性呼吸道綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)，同一天世界衛(wèi)生組織(WHO)將該病毒感染引起的疾病命名為2019冠狀病毒病(coronavirus disease 2019，COVID-19)。COVID-19雖然病死率低于SARS，但由于感染后潛伏期具有感染性而變得很難控制，導(dǎo)致感染人群基數(shù)很大。老年和伴有基礎(chǔ)疾病的患者感染后往往病情更嚴(yán)重，具有不良預(yù)后，嚴(yán)重威脅患者生活和健康[1]。

SARS-CoV-2屬于β-冠狀病毒屬，與2種蝙蝠冠狀病毒親緣性很近，目前猜測(cè)菊頭蝠可能是其自然宿主[2]。SARS-CoV-2利用其Spike蛋白(S蛋白)與宿主細(xì)胞血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)結(jié)合，從而進(jìn)入細(xì)胞。SARS-CoV-2與SARS-CoV的差異較大，被認(rèn)為是一種新型的人類感染性β冠狀病毒。SARS-CoV-2可通過呼吸道傳播進(jìn)入鼻咽部，部分研究表明SARS-CoV-2也可能通過消化道、結(jié)膜等途徑進(jìn)入機(jī)體[3]。COVID-19患者主要臨床癥狀為發(fā)熱、乏力、干咳等，住院期間可發(fā)展為肺炎、急性呼吸窘迫癥和休克[4]。然而研究發(fā)現(xiàn)除了肺部損傷外，突然加重的病情包括急性心肌損傷、心律不齊和急性腎損傷等并發(fā)癥[5]。因此，SARS-CoV-2 感染后損傷的不只是肺部，可能導(dǎo)致全身多個(gè)臟器損傷。SARS-CoV-2通過不同途徑傳播、損傷不同組織器官的特點(diǎn)與ACE2的表達(dá)情況、機(jī)體的免疫狀態(tài)有關(guān)。

2 SARS-CoV-2結(jié)合ACE2的結(jié)構(gòu)解析

SARS-CoV-2主要利用其表面突觸蛋白S蛋白的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (receptor binding domain,RBD) 結(jié)合ACE2。Yan等[6]率先采用冷凍電鏡技術(shù)成功解析了ACE2全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)ACE2以二聚體形式存在，無論開放或關(guān)閉狀態(tài)都包含一個(gè)共同識(shí)別SARS-CoV-2的表面。Lan等[7]利用X射線衍射技術(shù)準(zhǔn)確定位了SARS-CoV-2的RBD與ACE2的結(jié)合位點(diǎn)。Wrapp等[8]利用冷凍電鏡成功解析了SARS-CoV-2的S蛋白三聚體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2的S蛋白與ACE2的親和力是SARS-CoV的S蛋白和ACE2結(jié)合的10倍，從分子層面解析了SARS-CoV-2具有強(qiáng)感染性的原因。然而Walls等[9]發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2和SARS-CoV的S蛋白與人ACE2具有相同的結(jié)合能力，結(jié)構(gòu)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2和SARS-CoV的S蛋白膜融合區(qū)域S2亞基高度保守。Shang等[10]發(fā)現(xiàn)與SARS-CoV的RBD相比，SARS-CoV-2中的RBD與ACE2結(jié)合可形成更緊湊的構(gòu)象，其中部分氨基酸殘基的改變穩(wěn)定了RBD-ACE2上的兩個(gè)病毒結(jié)合熱點(diǎn)，這些結(jié)構(gòu)特征增強(qiáng)了與ACE2結(jié)合的親和力。部分遺傳學(xué)和結(jié)構(gòu)學(xué)研究表明SARS-CoV-2的S蛋白被多種人體組織(包括肺、肝和小腸)中的Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶TMPRSS2活化，其他宿主蛋白酶如furin被認(rèn)為對(duì)人畜共患病傳播至關(guān)重要，在氣道上皮細(xì)胞、心臟組織、腸道均有表達(dá)，可促進(jìn)SARS-CoV-2進(jìn)入宿主細(xì)胞[11]。

3 ACE2的組織表達(dá)與SARS-CoV-2感染

SARS-CoV-2和2003年爆發(fā)的SARS都通過ACE2感染機(jī)體[2]。單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)ACE2表達(dá)在肺臟、心臟、腎臟、食管、膀胱、回腸、睪丸等不同器官，這些器官可能成為病毒攻擊的靶器官，而臨床報(bào)道也驗(yàn)證了這一推測(cè)，因此SARS-CoV-2可能通過不同的途徑感染機(jī)體[12]。SARS-CoV-2可與支氣管上皮和人類Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞表面廣泛表達(dá)的ACE2結(jié)合，從而引起下呼吸道癥狀[13]。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)近一半COVID-19患者以食欲缺乏、乏力、精神萎靡、惡心嘔吐和腹瀉等消化道癥狀為首發(fā)癥狀，這不僅可能與ACE2高表達(dá)于小腸近端和遠(yuǎn)端上皮細(xì)胞有關(guān)，還與ACE2參與調(diào)節(jié)小腸炎癥和腹瀉有關(guān)[14]。近期發(fā)現(xiàn)有少數(shù)治療后“復(fù)陽”的患者也與腸道感染有關(guān)，病理結(jié)果發(fā)現(xiàn)盡管這些“康復(fù)患者”呼吸道檢測(cè)病毒為陰性，但胃腸道仍為陽性，且在腸道固有層中浸潤(rùn)有大量的漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞，但多數(shù)患者腸道的損傷并不嚴(yán)重，僅表現(xiàn)為間質(zhì)水腫。因此認(rèn)為SARS-CoV-2可能破壞了腸道對(duì)微生物的屏障功能[15]。Chai等[16]利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析30余種惡性腫瘤遺傳和表觀遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)ACE2在多種腫瘤組織中高表達(dá)，因此腫瘤患者可能對(duì)SARS-CoV-2更加易感。腫瘤患者ACE2高表達(dá)同時(shí)還伴有ACE2突變、拷貝數(shù)異常、啟動(dòng)子區(qū)甲基化等異常，從而影響ACE2的生理功能。Cao等[17]發(fā)現(xiàn)東亞人群中ACE2 相關(guān)eQTL變異具有更高的等位基因頻率，這提示可能不同人群存在不同易感性。

4 ACE2參與免疫炎癥調(diào)節(jié)

除了作為病毒結(jié)合的受體，ACE2還參與調(diào)節(jié)免疫過程。在SARS-CoV感染的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)S蛋白可下調(diào)ACE2的表達(dá)，并誘導(dǎo)ACE2胞外區(qū)脫落。人氣道上皮細(xì)胞分泌的金屬肽酶域17(metallopeptidase domain 17，ADAM17)和炎性細(xì)胞因子也可剪切膜表面的ACE2，使其脫落形成可溶性的ACE2，但引起普通感冒的冠狀病毒并不引起ACE2脫落[18]，因此推測(cè)可溶性的ACE2可能在COVID-19炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。但Monteil等[19]最近利用細(xì)胞、類器官培養(yǎng)研究卻發(fā)現(xiàn)重組可溶性ACE2可阻斷SARS-CoV-2的感染，這種重組的可溶性ACE2可通過在細(xì)胞外結(jié)合SARS-CoV-2發(fā)揮中和病毒作用從而阻斷感染。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)肺癌組織中ACE2表達(dá)增高，存在miR-125b-5p-ACE2-IL6軸的調(diào)控作用，且miR-125b-5p促進(jìn)ACE2表達(dá)，但抑制IL-6的表達(dá)，而SARS-CoV-2感染引起ACE2表達(dá)下調(diào)，可能會(huì)上調(diào)IL-6表達(dá)，引發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴，也稱為細(xì)胞因子釋放綜合征(cytokine release syndrome，CRS)，因此肺癌患者合并SARS-CoV-2感染，可能導(dǎo)致更為嚴(yán)重的細(xì)胞因子風(fēng)暴和肺炎癥狀[20]。ACE2還廣泛表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，這對(duì)調(diào)節(jié)血管張力和維持血管均質(zhì)狀態(tài)是必不可少的。血管內(nèi)皮細(xì)胞感染SARS-CoV-2后可招募免疫細(xì)胞并誘導(dǎo)自身凋亡，從而活化凝血系統(tǒng)，導(dǎo)致微循環(huán)功能障礙，進(jìn)而引起心血管系統(tǒng)的缺血、出血、炎癥和功能障礙[21]。ACE2的表達(dá)下降也可引起腎素-血管緊張素系統(tǒng)紊亂，導(dǎo)致血管通透性增加，血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)是其中的關(guān)鍵效應(yīng)物，過多的AngⅡ可通過ADAM17切割腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor α，TNF-α)和IL-6，產(chǎn)生可溶性IL-6，進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)。值得一提的是，最近研究發(fā)現(xiàn)ACE2屬于人干擾素刺激基因(interferon-stimulated gene，ISG)，當(dāng)機(jī)體感染SARS-CoV-2產(chǎn)生干擾素(interferon，IFN)抵抗病毒的同時(shí)，IFN-α上調(diào)ACE2的表達(dá)，促進(jìn)更多的SARS-CoV-2侵入宿主細(xì)胞，這可能是某些患者快速進(jìn)展的原因之一[22]。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)ACE2在鼻分泌細(xì)胞和纖毛細(xì)胞中表達(dá)最高，因此鼻內(nèi)給藥有可能限制病毒感染，同時(shí)ACE2共表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)鼻黏膜還表達(dá)天然免疫相關(guān)基因，這些基因表達(dá)可能與降低病毒敏感性有關(guān)。而在Ⅱ型肺泡細(xì)胞中ACE2與多個(gè)病毒組裝復(fù)制相關(guān)的基因共表達(dá)，如小窩蛋白(caveolin)可促進(jìn)病毒更易被吞噬[23]。不同組織ACE2表達(dá)和免疫特征聯(lián)合分析顯示，不同個(gè)體免疫反應(yīng)具有差異性，男性可能具有更高的病死率[24]。此外，胸腺和骨髓是機(jī)體T細(xì)胞和B細(xì)胞的發(fā)育場(chǎng)所，研究表明胸腺和骨髓中也表達(dá)ACE2，可能成為病毒感染的靶器官[25]。

5 不同性別ACE2表達(dá)差異與疾病易感性和嚴(yán)重程度相關(guān)

許多研究觀察到COVID-19男性的發(fā)病率要顯著高于女性，同時(shí)重癥率和病死率也高于女性。研究表明吸煙會(huì)影響ACE2的表達(dá)，這也可能是男性患者更易感原因之一[26]。此外，共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，ACE2和雄激素受體表達(dá)呈正相關(guān)，染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序結(jié)果提示雄激素受體可能與ACE2上游的增強(qiáng)子區(qū)域結(jié)合；單細(xì)胞RNA測(cè)序結(jié)果顯示男性的前列腺和睪丸中ACE2普遍表達(dá)，是SARS-CoV-2感染的潛在靶器官[27]。以往研究發(fā)現(xiàn)中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East Respiratory Syndrome-Coronavirus,MERS-CoV) 和SARS-CoV感染中男性患者數(shù)也高于女性[28]，推測(cè)可能與X染色體相關(guān)的基因和性激素的差異有關(guān)。同時(shí)研究表明SARS-CoV-2在進(jìn)入宿主細(xì)胞時(shí)依賴宿主的Ⅱ型踦膜絲氨酸蛋白酶TMPRSS2激活S蛋白[29]，該蛋白酶受雄激素調(diào)控。通過對(duì)男性和女性表達(dá)ACE2的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞因子差異表達(dá)分析后發(fā)現(xiàn)，促炎細(xì)胞因子特別是IL-6的受體在男性肺部多種細(xì)胞高表達(dá)，提示男性可能較女性更容易發(fā)生CRS[30]。

6 高齡和慢性并發(fā)癥患者ACE2變化與預(yù)后更差相關(guān)

高齡常作為SARS不良反應(yīng)與死亡率預(yù)測(cè)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，對(duì)于60歲或60歲以上的人群，SARS相關(guān)的死亡率可能超過50%[31]。高齡伴有并發(fā)癥也是與MERS-CoV感染、嚴(yán)重程度和死亡率相關(guān)的因素[32]。60歲以上老年人胸腺體積只有年輕人的1/10，幾乎不會(huì)產(chǎn)生初始T細(xì)胞，主要依靠外周免疫系統(tǒng)維持，因此對(duì)新發(fā)病毒感染的抵抗力較弱。不同組織ACE2表達(dá)和免疫特征聯(lián)合分析顯示，不同宿主免疫反應(yīng)具有差異性，老年人可能具有更高的病死率[24]。代謝性炎癥會(huì)損害免疫系統(tǒng)，降低機(jī)體應(yīng)對(duì)感染的能力，損害愈合過程，延長(zhǎng)恢復(fù)時(shí)間。

臨床數(shù)據(jù)顯示高血壓、血管疾病患者感染SARS-CoV-2比例較大，而血管緊張素受體阻滯劑(ARB)沙坦類藥物和ACE抑制劑都能上調(diào)高血壓患者的ACE2表達(dá)，高脂肪和糖尿病也能上調(diào)ACE2表達(dá)[33]。因此具有慢性基礎(chǔ)疾病的患者ACE2表達(dá)增高可能導(dǎo)致其對(duì)SARS-CoV-2更加易感，但感染SARS-CoV-2后ACE2表達(dá)過低，可能破壞腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，導(dǎo)致多器官衰竭。

7 針對(duì)ACE2的靶向治療藥物、抗體和疫苗研究

SARS-CoV-2的S蛋白通過ACE2入侵細(xì)胞是感染機(jī)體的第一步，阻斷S蛋白和ACE2的結(jié)合可以有效阻止SARS-CoV-2的感染。針對(duì)ACE2化學(xué)藥物的臨床應(yīng)用與新藥研發(fā)可能達(dá)到有效預(yù)防與治療的臨床效果。氯喹不僅具有抗瘧疾作用，還具備廣譜的抗病毒作用，其作用機(jī)制之一是氯喹可通過干擾宿主細(xì)胞ACE2末端糖基化從而影響S蛋白與ACE2的結(jié)合[34]。ACE抑制劑和他汀類降血壓藥物對(duì)非病毒性肺炎及無基礎(chǔ)疾病的患者具有臨床療效，而對(duì)COVID-19患者的臨床療效還有待充足的臨床試驗(yàn)研究證明[35]。此外，重組ACE2蛋白被證明可有效阻止病毒入侵[19]。

Tian等[36]比對(duì)發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2和SARS-CoV的S蛋白的RBD相似度為73%，因此針對(duì)兩種病毒的抗體可能具有交叉反應(yīng)，從SARS-CoV單克隆抗體庫(kù)中篩選可能治療SARS-CoV-2的中和抗體，通過比較多種SARS-CoV單克隆抗體與SARS-CoV-2 RBD結(jié)合的親和力，發(fā)現(xiàn)CR3022抗體具有較強(qiáng)結(jié)合SARS-CoV-2的能力，但并不能確定其具有中和活性。特異性中和抗體治療可以有效阻止病毒通過ACE2入侵，研究發(fā)現(xiàn)靶向SARS-CoV 的S蛋白的特異性中和抗體(m396、CR3014)雖然能阻斷其與ACE2的結(jié)合，但卻無法與SARS-CoV-2的S蛋白結(jié)合，這一結(jié)果提示SARS-CoV和SARS-CoV-2的S蛋白R(shí)BD的差異影響其與中和抗體的交叉結(jié)合反應(yīng)，因此現(xiàn)有的SARS疫苗能否預(yù)防SARS-CoV-2感染尚不能確定。除了在SARS病毒抗體庫(kù)中篩選針對(duì)SARS-CoV-2的抗體外，還可從COVID-19康復(fù)患者體內(nèi)分離分泌中和抗體的B細(xì)胞克隆，以篩選針對(duì)SARS-CoV-2的特異性單克隆抗體。Ju等[37]從COVID-19康復(fù)者外周血中篩選與SARS-CoV-2的RBD具有較強(qiáng)結(jié)合和中和能力，但與SARS和MERS病原體無交叉的抗體克隆，結(jié)果獲得206個(gè)B細(xì)胞克隆，通過測(cè)序獲得抗體編碼基因。Chen等[38]利用單個(gè)B細(xì)胞克隆的方法，從COVID-19患者分離出2個(gè)能分泌高中和活性抗體的B細(xì)胞克隆311mab-31B5和11mab-32D4，兩者的IC50分別為0.033 8和0.069 8 μg/mL。然而文獻(xiàn)表明非中和抗體可通過巨噬細(xì)胞的吞噬作用促進(jìn)病毒在體內(nèi)播散，或引起抗體依賴性增強(qiáng)作用(antibody-dependent enhancement，ADE)，或通過巨噬細(xì)胞表面的免疫球蛋白Fc受體進(jìn)一步刺激炎癥細(xì)胞因子釋放，加劇CRS，而高親和力的單克隆抗體則不容易誘導(dǎo)ADE效應(yīng)[39]。因此，從COVID-19患者體內(nèi)獲取的高親和力單克隆抗體可能在治療和控制疫情方面發(fā)揮較大作用?；謴?fù)期血漿具有較好的耐受性[40]，可能通過中和病毒血癥改善臨床療效，與康復(fù)者血漿相比，單克隆抗體特異性高，也更容易生產(chǎn)和大規(guī)模制備，但篩選的單抗需要進(jìn)一步臨床試驗(yàn)進(jìn)行有效性評(píng)估。

抗體治療主要通過中和病毒，阻止病毒入侵宿主細(xì)胞，還可介導(dǎo)免疫調(diào)理和抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒 (antibody-dependent cell-mediated cytoto-xicity,ADCC) 作用以清除病毒，但這是一種被動(dòng)免疫，持續(xù)時(shí)間很短，主要用于緊急預(yù)防和治療；而疫苗介導(dǎo)的是主動(dòng)免疫，主要用于疾病預(yù)防。通過測(cè)序掌握SARS-CoV-2基因組，成功解析S蛋白及ACE2晶體結(jié)構(gòu)對(duì)理解SARS-CoV-2如何入侵靶宿主細(xì)胞和疫苗設(shè)計(jì)提供了重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。目前發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2的S蛋白較為保守，尚未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生變異，且其中的RBD在與ACE2結(jié)合過程中發(fā)揮決定性作用，因此SARS-CoV-2疫苗主要針對(duì)S蛋白或其RBD設(shè)計(jì)。除了重組蛋白疫苗外，目前同步開展研究的還有減毒活疫苗、牛痘苗嵌合疫苗、滅活病毒疫苗、亞單位疫苗、重組DNA和蛋白質(zhì)疫苗的實(shí)驗(yàn)研究和臨床試驗(yàn)[41]。

8 結(jié)語

由SARS-CoV-2引起的新冠肺炎大流行是一個(gè)全球性的衛(wèi)生挑戰(zhàn)，ACE2是SARS-CoV-2進(jìn)入宿主細(xì)胞并造成靶器官損傷的重要受體。本文主要闡述了ACE2參與的免疫炎癥過程的機(jī)制，分析了性別、年齡和基礎(chǔ)疾病等因素與ACE2表達(dá)差異及預(yù)后的聯(lián)系。通過對(duì)SARS-CoV-2結(jié)合ACE2的結(jié)構(gòu)解析有助于研發(fā)阻斷病毒和受體有效結(jié)合的藥物靶點(diǎn)。目前不同類型疫苗和中和抗體的研究正在同步進(jìn)行中，部分項(xiàng)目初期臨床數(shù)據(jù)較好，新冠疫苗和中和抗體有望成為抗疫主力應(yīng)用于臨床預(yù)防和治療。