蛋白激酶C-βⅡ在糖尿病腎病中的研究進(jìn)展

姜樂(lè)臨 葉凡豪 韓絲絲 黃時(shí)偉

在臨床診斷與介入治療中，對(duì)比劑的應(yīng)用較多，其主要通過(guò)腎臟排泄。對(duì)比劑腎損傷是指使用對(duì)比劑48 h內(nèi)發(fā)生的腎功能損害，表現(xiàn)為血清肌酐絕對(duì)值增加至少44 μmol/L或相對(duì)基線增加至少25%。該病是住院患者急性腎功能不全的第三大原因[1-2]。糖尿病是對(duì)比劑介入后腎功能障礙的主要危險(xiǎn)因素之一，而蛋白激酶C-βⅡ（protein kinase C βⅡ，PKC-βⅡ）在糖尿病腎病中起著重要作用，本文就其相關(guān)研究進(jìn)展作一綜述。

1 PKC-βⅡ結(jié)構(gòu)及分子功能

PKC-βⅡ是單個(gè)多肽鏈，包含由5個(gè)可變區(qū)（V1～V5）間隔的4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域（C1～C4）。假底物結(jié)構(gòu)域C1、C2、V1、V2、V3的一部分構(gòu)成調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，存在于氨基末端。C3、C4、V4和V5在羧基末端形成催化結(jié)構(gòu)域，并且這2個(gè)結(jié)構(gòu)域通過(guò)蛋白水解敏感鉸鏈區(qū)連接。

假底物占據(jù)C1結(jié)構(gòu)域的末端并介導(dǎo)酶的自動(dòng)抑制，它與蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）底物具有序列同一性，丙氨酸取代絲氨酸/蘇氨酸磷酸受體位點(diǎn)。因此，在酶的無(wú)活性狀態(tài)下，假底物結(jié)構(gòu)域阻斷底物結(jié)合腔并在活化過(guò)程中從活性位點(diǎn)釋放并引起酶的完全活化[3]。C1結(jié)構(gòu)域（約70個(gè)氨基酸）是緊湊的，富含半胱氨酸并由5個(gè)短β鏈、α螺旋和2個(gè)Zn2+組成，并形成DAG和PD結(jié)合位點(diǎn)。C1結(jié)構(gòu)域分為2個(gè)部分，即C1a和C1b，共享高度的序列相似性。中心體蛋白Pericentrin、RING指蛋白是與C1a區(qū)相互作用的2種蛋白[4]，前者負(fù)責(zé)紡錘體形成和胞質(zhì)分裂，這種相互作用的破壞可抑制細(xì)胞分裂；后者過(guò)表達(dá)導(dǎo)致PKC-βⅡ蛋白化和降解。因此，通過(guò)與PKC-βⅡ的C1結(jié)構(gòu)域結(jié)合，這些蛋白質(zhì)可以改變酶的亞細(xì)胞定位和活性[4]。C2結(jié)構(gòu)域由通過(guò)環(huán)連接的8個(gè)反平行β鏈形成，其由多個(gè)天冬氨酸殘基排列，而天冬氨酸殘基與3個(gè)Ca2+配位來(lái)充當(dāng)C2結(jié)構(gòu)域和磷脂頭部基團(tuán)之間的橋梁?；罨疌激酶（RACK）-1（36 kDa）受體的蛋白質(zhì)由7個(gè)重復(fù)的WD40基序組成，以螺旋槳狀結(jié)構(gòu)排列，與PKC-βⅡ相互作用并穩(wěn)定其活性形式，從而提高基質(zhì)的磷酸化效率。C3結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為是三磷酸腺苷結(jié)合的高度保守位點(diǎn)，且該結(jié)構(gòu)域的序列對(duì)于PKC-βⅠ和PKC-βⅡ同工酶是相同的[5]。三磷酸腺苷結(jié)合位點(diǎn)突變可消除激酶活性。C4結(jié)構(gòu)域是底物結(jié)合位點(diǎn)，參與磷酰基轉(zhuǎn)移。它是所有PKC中的保守區(qū)域，具有105～108個(gè)氨基酸的保守序列，這些序列在三磷酸腺苷結(jié)合位點(diǎn)末端開(kāi)始并持續(xù)至磷酸轉(zhuǎn)移基團(tuán)的開(kāi)始。V5區(qū)域由50～70個(gè)氨基酸組成，在PKC的定位和磷酸化中起重要作用。它具有多種功能，具有不同異構(gòu)體的功能，也可導(dǎo)致酶在不同組織中以不同方式定位。Kiley等[6]分析了V5區(qū)域?qū)θ薝937單核細(xì)胞系的影響，結(jié)果顯示PKC-βⅠ定位于微管，PKC-βⅡ部分定位于分泌顆粒。Blobe等[7]在MOLT-4 T淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系中也證實(shí)了這種定位效應(yīng)，觀察到PKC-βⅡ而非PKC-βⅠ在佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）處理細(xì)胞后易位至肌動(dòng)蛋白微絲。鉸鏈區(qū)由殘基422-425限定，殘基422-425連接調(diào)節(jié)區(qū)和催化區(qū)。它被蛋白水解酶破壞，并被確定為半胱氨酸蛋白酶依賴性切割、酪氨酸磷酸化和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的靶標(biāo)。

2 PKC-βⅡ作用機(jī)制及通路

PKC在平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞中廣泛表達(dá)，在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用[8]。PKC有3個(gè)不同的亞型：常規(guī)PKC（α、βⅠ/Ⅱ、γ）、新型PKC和非典型PKC[9]。高糖環(huán)境可導(dǎo)致組織中二酰甘油水平普遍升高，進(jìn)而激活PKC-β。

PKC-β能夠激活一系列下游信號(hào)通路，引發(fā)多組織器官發(fā)生病變，引起糖尿病相關(guān)并發(fā)癥（如糖尿病腎病等）。因此，糖尿病腎病的新型治療藥物研究早期集中在PKC上[10-11]。某實(shí)驗(yàn)在糖尿病2型大鼠模型中觀察到晚期糖基化終產(chǎn)物的積累和多元醇通路的激活，同時(shí)PKC-β表達(dá)增加，促炎癥介質(zhì)（如腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6等）被釋放，腎臟出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白尿和腎纖維化[12]。上述結(jié)果提示PKC-β與腎纖維化有關(guān)。在糖尿病大鼠模型中，高血糖導(dǎo)致糖尿病腎病加重，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，提示PKC-β通過(guò)加劇腎小球內(nèi)皮細(xì)胞凋亡進(jìn)導(dǎo)致糖尿病腎病。

3 PKC-βⅡ抑制劑LY333531

LY333531是PKC-βⅡ特異性抑制劑，通過(guò)與PKC-βⅡ的活性位點(diǎn)結(jié)合，進(jìn)而干擾三磷酸腺苷的結(jié)合并抑制底物的磷酸化。目前LY333531已在糖尿病腎病的多種嚙齒動(dòng)物模型中進(jìn)行測(cè)試，包括鏈脲佐菌素大鼠，鏈脲佐菌素-REN2大鼠（鏈脲佐菌素導(dǎo)致糖尿病的遺傳性高血壓模型）、db/db小鼠（一種發(fā)展為糖尿病和腎臟疾病的肥胖遺傳模型）等，結(jié)果顯示腎小球高濾過(guò)率正?；瑫r(shí)蛋白尿、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白減少[13]。此外，LY333531治療還能減少系膜擴(kuò)張，改善腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化。加用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑后，LY333531能進(jìn)一步減少蛋白尿，緩解腎小球硬化嚴(yán)重程度和內(nèi)皮細(xì)胞丟失。相關(guān)研究表明，在敲除PKC-β基因或用PKC-β抑制劑治療的糖尿病大鼠中，腎臟肥大、腎小球超濾、細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)物及活性氧的生成減少，糖尿病腎病得到緩解[14]。在糖尿病大鼠模型和人腎近端小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)中，研究發(fā)現(xiàn)還原型輔酶Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧 化 酶、PKC-β、p66shc表達(dá)均明顯增加；而PKC-β抑制劑能逆轉(zhuǎn)高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的p-p66shc/p66shc、NADPH氧化酶升高[15]。在細(xì)胞培養(yǎng)模型中，大鼠系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白表達(dá)均明顯增加，以應(yīng)對(duì)糖尿病狀態(tài)下的高血糖和其他異常代謝產(chǎn)物（如增加的氨基酸和晚期糖基化終產(chǎn)物等）[16]。

在糖尿病小鼠中，高血糖引起腎病加重、腎小球內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的同時(shí)，伴隨著促凋亡蛋白Swiprosin-1表達(dá)顯著增加。而LY333531能減少糖尿病小鼠中腎小球內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，降低Swiprosin-1表達(dá)。腎小球內(nèi)皮細(xì)胞中Swiprosin-1過(guò)表達(dá)，可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡以及半胱氨酸蛋白酶-9、半胱氨酸蛋白酶-3和Bax表達(dá)均明顯增加。相反的，Swiprosin-1的敲除可減弱高葡萄糖或PMA誘導(dǎo)的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞凋亡。此外，Swiprosin-1過(guò)表達(dá)可促進(jìn)Swiprosin-1和半胱氨酸蛋白酶-9之間的相互作用，增加凋亡小體的形成。與糖尿病Swiprosin-1+/+小鼠相比，糖尿病Swiprosin-1-/-小鼠腎臟重量/體重降低，尿蛋白、腎小球肥大、線粒體凋亡相關(guān)蛋白以及腎小球內(nèi)皮細(xì)胞凋亡均明顯改善[17]。在糖尿病腎病早期，Swiprosin-1表達(dá)被PKC-β上調(diào)，同時(shí)PKC-β通過(guò)線粒體依賴性途徑促進(jìn)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[17]。在人腎小球系膜細(xì)胞中，葡萄糖和（或）轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1誘導(dǎo)PKC-α、PKC-β的基因表達(dá)增加，使用siRNA法能減弱其表達(dá)[18]。相關(guān)數(shù)據(jù)表明，PKC-α或PKC-β在糖尿病腎病患者蛋白尿和細(xì)胞外基質(zhì)積聚的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用[19]。Wang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，LY333531能顯著降低糖尿病大鼠血清肌酐水平、腎臟重量/體重和尿蛋白排泄量，且下調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1、Smad2和Smad3 mRNA表達(dá)，預(yù)防GRAP蛋白表達(dá)降低。有文獻(xiàn)報(bào)道LY333531的腎臟保護(hù)作用可能是由于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1/Smad通路的下調(diào)和GRAP蛋白表達(dá)的正?；瘜?shí)現(xiàn)的[20]。

4 小結(jié)

PKC-βⅡ在糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。PKC-βⅡ抑制劑LY333531可以通過(guò)抑制PKC-βⅡ的激活來(lái)阻斷下游信號(hào)通路，從而起到治療糖尿病腎病的作用。隨著PKC-βⅡ相關(guān)研究的深入，PKC-βⅡ特異性抑制劑治療糖尿病并發(fā)癥將有更廣闊的前景。