朱閩 彭杰 蔣越 買鵬宇 張禹姝

摘要 目的：基于整合藥理學和分子對接技術(shù)預測大黃防治前列腺癌可能的質(zhì)量標志物。方法：通過中醫(yī)藥整合藥理學網(wǎng)絡計算研究平臺V2.0（TCMIP V2.0），將大黃化學信息進行靶標預測，與前列腺癌疾病靶標信息進行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡構(gòu)建，從而開展藥物干預疾病的關鍵靶標富集分析。在此基礎上，利用大黃的化學成分、關鍵靶標、疾病通路的多維網(wǎng)絡，繪制中藥“成分-靶標-通路-疾病”網(wǎng)絡圖，解析獲得作用于這些關鍵靶標的主要成分，然后依據(jù)中藥質(zhì)量標志物（Q-marker）“五原則”結(jié)合已知相關文獻對大黃防治前列腺癌的質(zhì)量標志物進行預測分析。最后，應用AutoDock Vina分子對接軟件對候選成分與關鍵靶點進行分子對接計算和驗證。結(jié)果：篩選得到大黃防治前列腺癌的活性成分14個，關鍵核心靶標21個，涉及11條信號通路。分子對接表明雄激素受體（AR）與大黃蒽醌類中8個均入最佳藥物油水分配系數(shù)范圍的成分有較好的結(jié)合性。結(jié)論：通過TCMIP V2.0及前期文獻研究基礎上，分析并獲得大黃防治前列腺癌可能的質(zhì)量標志物為大黃蒽醌類化合物，具體成分包括大黃素、大黃酸、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚等，對藥物和疾病的共同靶標AR產(chǎn)生藥理作用。

關鍵詞 大黃;前列腺癌;質(zhì)量標志物;中醫(yī)藥整合藥理學網(wǎng)絡計算研究平臺2.0;分子對接;中藥

Abstract Objective：To predict the possible quality markers of Radix et Rhizoma Rhei in the prevention and treatment of prostate cancer based on integrated pharmacology and molecular docking techniques.Methods：Through the integrated pharmacology research platform V2.0（TCMIPV2.0） of traditional Chinese medicine，the chemical information of Radix et Rhizoma Rhei was predicted，and the protein interaction（PPI） network was constructed with the disease target information of prostate cancer，so as to carry out the enrichment analysis of the key targets of drug intervention.On this basis，we used the multi-dimensional network of chemical components，key targets，and disease pathways of Radix et Rhizoma Rhei，draw the network diagram of “component-target-pathway-disease” of Chinese medicinal，analyzed and obtained the main components acting on these key targets，and then base on the quality mark of traditional Chinese medicinal，the “Five Principles” of Q-marker combined with known related literature were used predict and analyze the quality markers of Radix et Rhizoma Rhei in preventing and treating prostate cancer.Finally，the AutoDock Vina molecular docking software was used to calculate and verify the molecular docking of candidate components and key targets.Results：A total of 14 active components of Radix et Rhizoma Rhei against prostate cancer，21 key core targets and 11 signal pathways were screened.Molecular docking showed that there was a good binding between AR and 8 components of Radix et Rhizoma Rhei anthraquinones which were all in the range of optimal oil-water partition coefficient.Conclusion：Based on the integration of pharmacological V2.0 platform and previous literature research，the possible quality markers of Radix et Rhizoma Rhei in the prevention and treatment of prostate cancer are Radix et Rhizoma Rhei anthraquinones，including emodin，Rhein，chrysophanol，aloe-emodin，emodin methyl ether，etc.，which have pharmacological effects on AR of the common target of drugs and diseases.

Keywords Radix et Rhizoma Rhei; Prostate cancer; Quality marker; TCMIP V2.0; Molecular docking; Chinese medicine

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.20.007

大黃為蓼科植物掌葉大黃、藥用大黃及唐古特大黃的干燥根和根莖，性味苦寒，歸脾、胃、肝、大腸、心包經(jīng)，主瀉下攻積、逐瘀通經(jīng)、清熱瀉火、涼血解毒、利濕退黃[1]。大黃又稱為“將軍”，逐瘀瀉熱、推陳致新是其主要功效，可用于治療積滯便秘、血閉寒熱、癥瘕積聚等[2]。在中醫(yī)學中，前列腺癌為本虛標實之證，臟腑虧虛為本，濕熱、痰濁、瘀血、氣滯為標，且認為該病主要臟腑病變責之于腎和膀胱[3]?；谥嗅t(yī)學對前列腺癌發(fā)病機制的認識，祛瘀消癥治法可廣泛應用于前列腺癌疾病治療。而大黃作為常用的祛瘀消癥藥材，也經(jīng)常用于治療前列腺癌?，F(xiàn)有相關文獻報道大黃對前列腺癌有較好的治療效果，有研究顯示，從大黃中提取的大黃素能誘導人前列腺癌細胞（LNCaP）凋亡，通過雄激素受體（AR）和P53-P21線粒體途徑抑制增殖，有效抑制癌細胞轉(zhuǎn)移及再生，在癌細胞DNA損傷過程中起到良好的修復作用[4-5]。

盡管大黃治療前列腺癌具有確切療效，但作為常用的大宗藥材之一，由于產(chǎn)地不同，大黃種植質(zhì)量控制、田間管理技術(shù)及產(chǎn)品加工方法有差異，故市場來源不同大黃的有效成分差異較大[6]。藥材品質(zhì)資源混亂，其質(zhì)量難以得到保證，會直接或間接影響疾病的治療效果。為了有效整治這一現(xiàn)狀，近年來由劉昌孝院士提出了“中藥質(zhì)量標志物”及其五原則概念，即通過藥材成分的有效性、特有性、傳遞與溯源、可測性、配伍環(huán)境5個方面評價和把控藥材的質(zhì)量標志物[7]。目前，整合藥理學已被廣泛應用到中藥與方劑及機體之間的藥效基礎、分子機制等方面，且能在一定程度上對中藥質(zhì)量標志物進行發(fā)掘和深入確證[8-9]。中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺的構(gòu)建，更為整合藥理學“多靶點、多層次、多環(huán)節(jié)”策略提供強有力的數(shù)據(jù)基礎與分析工具[10]?；诖耍狙芯恳罁?jù)中藥質(zhì)量標志物（Q-marker）“五原則”方法，并借助中醫(yī)藥整合藥理學網(wǎng)絡計算研究平臺V2.0（TCMIP V2.0），結(jié)合現(xiàn)代藥理文獻對大黃防治前列腺癌的質(zhì)量標志物和其活性成分與關鍵靶標蛋白進行模擬結(jié)合研究。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 中醫(yī)百科全書數(shù)據(jù)庫（http：//www.ehbio.com/ETCM/）是TCMIP V2.0的數(shù)據(jù)來源[11]。本研究基于TCMIP V2.0（http：//www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/）“中藥材數(shù)據(jù)庫”“中藥靶標數(shù)據(jù)庫”“中藥成分數(shù)據(jù)庫”及“疾病相關分子庫”等數(shù)據(jù)庫。其中，中藥靶標預測及功能分析、疾病相關分子集及功能挖掘數(shù)據(jù)來源于“基因相關性數(shù)據(jù)庫”（DisGeNET）、基因本體（Gene Ontology）數(shù)據(jù)庫、“人類表型本體”（HPO）數(shù)據(jù)庫、“DrugBank數(shù)據(jù)庫”“治療靶標數(shù)據(jù)庫”（TTD）、OMIM（Online Mendelian Inheritance In Man）等資源數(shù)據(jù)平臺。在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡信息中，TCMIP V2.0容納了DIP、HAPPI、HPRD、In Act、MINT、OPHID、PDZ Base、Reactome等生物分子相互作用數(shù)據(jù)庫。通過計算網(wǎng)絡節(jié)點的3種拓撲結(jié)構(gòu)特征值，即連接度（Degree）、介度（Betweenness）和緊密度（Closeness），篩選網(wǎng)絡中的核心節(jié)點基因，并實現(xiàn)核心節(jié)點網(wǎng)絡的可視化。在獲得目標中藥關鍵網(wǎng)絡靶標基因集的基礎上，進一步開展生物學功能及通路的富集分析。

1.2 基于“成分-靶標-通路-疾病”挖掘大黃防治前列腺癌有效成分 中藥質(zhì)量標志物的核心因素是“有效性”。針對藥材中“成分-靶標-通路-疾病”之間的關聯(lián)性，TCMIP V2.0可任意選定不同類別的節(jié)點，建立中藥多維關聯(lián)網(wǎng)絡，實現(xiàn)對作用于核心靶標的大黃化學成分的可視化操作，進而獲得與有效性相關的成分。

在TCMIP V2.0的中藥材數(shù)據(jù)庫中，以“大黃”為關鍵詞進行搜索，得到關于大黃的化學成分及其相關對應的所有靶標。然后在中藥靶標預測功能模塊中，根據(jù)二維結(jié)構(gòu)相似性（MACCS分子指紋）進行檢索，對Tanimoto系數(shù)定義進行相似度打分，并與美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）上市藥物的相似度進行比對，從而獲取高可信度（Similar Score≥0.8）的大黃候選靶標譜。

在TCMIP V2.0的疾病數(shù)據(jù)庫中，以“Prostate Cancer”為關鍵詞進行搜索，可得到與前列腺癌相關的靶點。

根據(jù)中藥（大黃）候選靶標和目標疾?。ㄇ傲邢侔┗蛑g的互作信息，可建立“中藥-疾病”關聯(lián)網(wǎng)絡。基于藥材中“成分-靶標-通路-疾病”之間的關聯(lián)性，任意選定不同類別的節(jié)點，建立有關中藥的多維網(wǎng)絡圖，并進一步挖掘獲得大黃防治前列腺癌的可能有效成分，初步完成大黃防治前列腺癌關鍵靶標及質(zhì)量標志物的篩選。

1.3 基于大黃成分分析質(zhì)量標志物 中藥質(zhì)量標志物的必備條件是“可測性”。結(jié)合已知相關文獻對大黃的含量檢測情況，并按照TCMIP V2.0對初步篩選出的大黃有效成分進行整理。

中藥質(zhì)量標志物原則之一的“特有性”主要表現(xiàn)為2個層次：一方面是發(fā)掘能代表與反映同種藥材的共有性并有別于其他藥材的特有性成分，另一方面是能深入反映同一類藥材中所含成分的差異性，包括定性和定量2個層次[12]。本研究首先從大黃有別于其他藥材的特征性成分即大黃蒽醌類化合物開展研究，其次從不同品種、產(chǎn)地、年限及部位的主要活性化合物大黃蒽醌類含量差異進行比較確定大黃的質(zhì)量標志物。

1.4 基于大黃成分傳遞與溯源確定質(zhì)量標志物 ? 通過TCMIP V2.0中的中藥成分數(shù)據(jù)庫，本研究初步篩選可能作為大黃質(zhì)量標志物的有效成分，整理其相關理化性質(zhì)，包含平衡溶解度和油水分配系數(shù)[13]，并在臨床復方用藥配伍及工藝研究等方面進一步證實大黃防治前列腺癌的質(zhì)量標志物。

1.5 基于分子對接模擬結(jié)合關鍵靶標蛋白與候選質(zhì)量標志物 通過PubChem網(wǎng)站（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索獲取候選質(zhì)量標志物的SDF結(jié)構(gòu)文件，并利用Open Babel 2.3.2軟件將SDF文件轉(zhuǎn)化為PDB文件，從Protein Data Bank（http：//www.rcsb.org/pdb）數(shù)據(jù)庫中檢索獲得關鍵靶標蛋白PD BID，利用PYMOL 2.3.4軟件對關鍵靶標蛋白進行去水、去配體等操作。采用AutoDockTools軟件對關鍵靶標蛋白進行加氫、平衡電荷等修飾，用Grid程序下的Grid Box命令打開Grid Option工具對關鍵靶標蛋白進行處理，配體結(jié)合口袋的大小由各個方向上格點的數(shù)目和格點間距共同決定，因此調(diào)整蛋白每個方向上格點的數(shù)目、結(jié)合口袋的中心以及格點的間距。首先將格點間距設為1，然后調(diào)整結(jié)合口袋體積使預對接的分子在其最伸展的狀態(tài)下也能在盒子內(nèi)轉(zhuǎn)動，口袋中心即設定為結(jié)合位點中心，并將關鍵靶標蛋白和配體小分子分別轉(zhuǎn)化為pdbqt格式。AutoDock Vina是由Scripps研究結(jié)構(gòu)開發(fā)的開源分子對接軟件，該軟件采用的是擬牛頓方法進行局部優(yōu)化，其打分函數(shù)結(jié)合了基于經(jīng)驗打分和知識打分函數(shù)的優(yōu)點，將結(jié)果以一種親和能（Affinity）的形式輸出，通過計算受體-配體復合物的空間效果、排斥作用、氫鍵、疏水相互作用以及分子的靈活性等值綜合打分，評估其親和力，最終給出親和能打分。這種親和能是衡量配體是否能與受體分子有效結(jié)合的重要指標，是AutoDock Vina軟件的核心參數(shù)，能值越低表示二者的結(jié)合效果越好。

2 結(jié)果

2.1 基于“成分-靶標-通路-疾病”挖掘大黃防治前列腺癌有效成分分析結(jié)果

2.1.1 藥物靶標預測分析 在TCMIP V2.0中藥（含方劑）靶標預測及功能分析模塊中，獲取高可信度（Similar Score≥0.8）的大黃及其化學成分相關對應的潛在靶標，結(jié)果得到大黃化學成分88種，主要為大黃蒽醌類、蒽酮類等。有研究顯示，從大黃蒽醌類中提取的大黃素能通過下調(diào)趨化因子受體CXCR4的表達來抑制前列腺癌和肺癌細胞的侵襲和遷移[13]。動物實驗結(jié)果表明，大黃素能夠直接作用于前列腺癌模型裸鼠雄激素受體（AR）并促進其降解，從而對癌細胞的發(fā)生起到較好的預防作用[14]。大黃候選靶標有actⅢ、AR、ALOX5、CSNK2A1、cyp158a2、CYP1A2、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A43、CYP3A5、CYP3A7、fabZ、GSTA1、GSTP1、NR1H2、NR1H3、actVA_6、KRT12、KRT2、MAPK8IP1、PTGS1、PTGS2、SCO5081等。對大黃的預測靶標進行GO和Reactome pathway分析，候選靶標基因功能分析的生物過程涉及異源代謝過程、長鏈脂肪酸生物合成過程、單萜類代謝過程、藥物分解代謝過程等，分子功能涉及氧化還原酶活性、血紅素結(jié)合、鐵離子結(jié)合、單加氧酶活性、芳香化酶活性等，細胞組分主要集中在細胞器膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、膜結(jié)合細胞器等方面。通路富集分析結(jié)果顯示，涉及通路有異生物素途徑、炎癥消退介質(zhì)反應、細胞色素酶反應、藥物代謝酶系統(tǒng)、核受體轉(zhuǎn)錄途徑等。

2.1.2 疾病靶點收集分析 在疾病相關分子集及其功能挖掘模塊中，獲得與前列腺癌相關疾病靶標71個，包括HSP90AA1、PTGS2、MMP14、NFKB2、MCL1、SPHK2、HPSE、MMP9、MMP2、MMP3、TP53、NTSR1、MAP3K4、MAP2K7、MAP2K1、MMP13、MMP12、HDAC4、PRKCA、ALOX15、CYP1B1、VDR、GNRH1、LHCGR、FGFBP1、NTRK1、AR、EGFR、TRPV6、NCOA4、NSD1、PSCA、SLC7A1、BDKRB1、FOLH1、STEAP2、KLK3、HPN、TGFβ1、LOX、IL13RA1、IL13RA2、TMPRSS2、OR51E2、TMBIM6、RXRA、USP2、GRN、SRD5A1、SRD5A2、TNFSF4、STEAP1、ENG、CLU、BARD1、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CHEK2、KLF6、MAD1L1、MRE11、MSR1、NBN、PALB2、PTEN、RAD50、RAD51、RAD51C、RAD51D、RNASEL。

2.1.3 “藥物-疾病”靶標核心網(wǎng)絡分析 共獲得44個與前列腺癌以及藥材關聯(lián)的核心網(wǎng)絡靶標，并通過PPI功能模塊構(gòu)建“藥物-疾病”核心網(wǎng)絡靶標分析圖（圖1），設置卡值并同時滿足大于其節(jié)點“連接度”“介度”“緊密度”的中位數(shù)，所得關鍵核心靶標21個，且大部分為藥物潛在靶標（Putative drug Targets），如MMP2、TGFβ1、EGFR、MAP3K4等，已知疾病靶標2條，即AR、HSP90AA1，藥物與疾病共有靶標2條，即AR、HSP90AA1。

2.1.4 “藥物-靶標-通路-疾病”網(wǎng)絡可視化分析及大黃防治前列腺癌可能的質(zhì)量標志物探討 前期通過TCMIP V2.0獲得大黃防治前列腺癌的關鍵核心靶標，可以推測大黃發(fā)揮藥效的藥理作用與其干預疾病的共同靶標有關，并在藥物成分、藥物靶標和疾病之間的關系中構(gòu)建大黃防治前列腺癌“藥物-成分-關鍵靶標-通路”多維關聯(lián)網(wǎng)絡圖。由圖2可知，大黃中含有多種有效成分，主要包括大黃蒽醌類，對藥物和疾病的共同靶標AR產(chǎn)生藥理作用，具體成分為RheinosideA、RheinosideB、RheinosideC、RheinosideD、Rhein-8-O-β-D-Glucopyranoside、Rhein-8-O-β-D-（6′-Oxalyl）-Glucopyra-Noside、Aloeemodin-8-O-β-D-Glucopyranoside、AnthraglycosideB、Emodin-1-O-β-D-Glucopyranoside、Chrysophanol-8-O-β-D-Glucopyranoside、Chrysophanol-1-O-β-D-Glucoside、Physcion-8-β-D-Glucopyranoside、Physcion-8-O-β-D-Gentiobioside、Physcion-8-O-β-D-Glucopyranoside，可基本歸為大黃素、大黃酸、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚5大類（以下亦如此統(tǒng)稱）。體內(nèi)體外實驗結(jié)果表明，大黃素通過上調(diào)LRP1基因?qū)R陽性表達下LNCaP細胞的生長產(chǎn)生抑制作用[15]。而大黃酸也可在AR陽性表達下激發(fā)LNCaP細胞產(chǎn)生S期阻滯，并顯著降低cyclin A和CDK2的表達含量[16]。Lu等[17]采用大黃酚納米囊調(diào)控細胞周期相關蛋白，包括P27、CHK1、cyclin D1、CDK1、P-AMP等活化蛋白激酶（AMPK）和P-蛋白激酶B（AKT），以防止LNCaP細胞在AR陽性表達下增殖并誘導其凋亡。蘆薈大黃素通過AR陽性表達下抑制PKCα-AKT-mTORC2及其下游底物的活化，從而有效控制前列腺癌模型裸鼠體內(nèi)腫瘤細胞PC3的增長趨勢[18]。白鳳等[19]、李斌鑫等[20]利用網(wǎng)絡藥理學方法篩選出蒙藥復方協(xié)日嘎-4的有效成分大黃素和大黃素甲醚，然后對蒙藥靶向調(diào)控前列腺癌AR等多個受體進行分子對接且發(fā)現(xiàn)結(jié)合能較低，從而有力闡明該藥治療前列腺癌的效應物質(zhì)基礎。

2.2 基于大黃成分探討質(zhì)量標志物的分析結(jié)果 ? 2015年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定的大黃含量測定的成分以游離蒽醌類為主，其中有蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚[1]。劉月紅等[21]運用高效液相色譜法（HPLC）同時測定了大黃中14個成分含量，主要包括大黃素、大黃酸、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚、番瀉苷A、番瀉苷B、沒食子酸、兒茶素、（-）-表兒茶素-3-沒食子酸酯、異蓮花掌苷、4-4′-羥基苯基-2-丁酮、蓮花掌苷、4′-羥基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-（2″-O-桂皮?；?6″-O-沒食子?；?葡萄糖苷，為大黃藥材多成分含量的測定及質(zhì)量控制提供便利。屈義虎[22]經(jīng)制備型高效液相色譜純化測定得到藥用大黃主要5個游離型蒽醌單體，分別為蘆薈大黃素（99.26%）、大黃酸（98.47%）、大黃素（98.65%）、大黃酚（99.75%）、大黃素甲醚（92.31%），并經(jīng)與標準品比對得到藥用大黃主要2個結(jié)合型蒽醌單體，分別為大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷（97.65%）和大黃酸-8-O-β-D-葡萄糖苷（98.32%）。說明大黃中主要活性成分大黃蒽醌類化合物具有高強度的專屬性和藥理活性，并易通過HPLC法測定，可將其視作大黃質(zhì)量標志物。

其一，大黃含有多種有效活性成分，如游離蒽醌類、鞣質(zhì)類、蒽醌苷類等[23]。大黃的主要活性成分大黃蒽醌類化合物在抗炎、抗腫瘤、抗纖維化、保護心腦血管以及多個器官組織等方面效果顯著，是大黃發(fā)揮藥理作用的特征性成分[24]。其二，由于大黃來源存在差別，而不同來源的大黃質(zhì)量差異較大。有學者采用超高效液相色譜法（UPLC）對3個不同品種的大黃對照藥材及不同產(chǎn)地的21批市售大黃飲片建立指紋圖譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)掌葉大黃和唐古特大黃整體色譜峰具有數(shù)量多、面積大的特點，而藥用大黃色譜峰較少且面積小，且其飲片成分含量也隨著產(chǎn)地來源、采收及加工等影響而有一定差異[25]。又有學者以2015年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定的5種游離蒽醌化合物為基礎，結(jié)合現(xiàn)有文獻分析研究1、2、3年生藥用大黃根、根莖、葉片中10種有效活性成分的含量和變化規(guī)律并建立HPLC圖譜，結(jié)果顯示同一部位大黃的多數(shù)成分含量越高，生長年限越長，且同一年份大黃葉片多數(shù)成分含量低于根或根莖，而3年生大黃根及根莖的總蒽醌含量最高（0.32%），說明大黃蒽醌類能較好適應該基地的生態(tài)環(huán)境[26]。另有研究表明，同一產(chǎn)地相同年限的掌葉大黃與唐古特大黃游離蒽醌含量差異較大，5年栽培大黃與野生大黃的游離蒽醌總量相近（均高于2.0%），且蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量之間均有一定差異，而3年栽培大黃的游離蒽醌總量為0.64%～1.40%，離藥典標準仍有不小差距[27]。

綜上所述，大黃蒽醌類中大黃素、大黃酸、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚可能是大黃治療前列腺癌的質(zhì)量標志物。

2.3 基于大黃防治前列腺癌質(zhì)量傳遞與溯源的質(zhì)量標志物分析結(jié)果 研究在前期TCMIP V2.0網(wǎng)絡可視化分析中獲得了大黃和前列腺癌的共同靶標AR產(chǎn)生藥理作用的14個有效活性成分，并結(jié)合中藥成分數(shù)據(jù)庫，查詢得到上述有關大黃蒽醌類中5個有效活性成分的常見理化性質(zhì)如藥物油水分配系數(shù)，具體參考數(shù)據(jù)見表1。通過該平臺運用Pipeline Pilot software（version 7.5）計算獲得分子溶解度（Molecular Solubility）和藥物在體內(nèi)的吸收水平（ADMET Absorption Level），藥物油水分配系數(shù)由AlogP和logD值表示，在藥物沒有進行電離下，AlogP≈logD。目前公認的藥物油水分配系數(shù)logP值最佳范圍為-1

2.4 基于分子對接針對關鍵靶標與候選質(zhì)量標志物分析結(jié)果 為了進一步驗證前列腺癌中大黃靶點的候選質(zhì)量標志物，利用AutoDock Vina 1.1.2軟件對關鍵靶標蛋白AR（PDBID：5V8Q）與以上8個配體小分子（AnthraglycosideB、Emodin-1-O-β-D-Glucopyranoside、Chrysophanol-1-O-β-D-Glucoside、Chrysophanol-8-O-β-D-Glucopyranoside、RheinosideB、Aloeemodin-8-O-β-D-Glucopyranoside、Physcion-8-O-β-D-Glucopyranoside、Physcion-8-β-D-Glucopyranoside，以下分別對應簡稱01～08配體小分子）分別進行分子對接驗證。圖3A.AR與01配體小分子之間的結(jié)合模式，氨基酸殘基Thr755、Trp751、Glu681與01配體小分子形成氫鍵相互作用，氨基酸殘基Pro801、Phe804、Pro682、Gly683、Gln711、Val684、Arg752與01配體小分子形成疏水相互作用。圖3B.AR與02配體小分子之間的結(jié)合模式，氨基酸殘基Glu678、Glu681、Trp751、Gly683、Gln711與02配體小分子形成氫鍵相互作用，氨基酸殘基Val684、Pro682、Pro801、Lys808、Arg752、Ala748與02配體小分子形成疏水相互作用。圖3C.AR與03配體小分子之間的結(jié)合模式，氨基酸殘基Val685、Gly683、Glu678、Trp751與03配體小分子形成氫鍵相互作用，氨基酸殘基Pro682、Glu681、Leu805、Pro801、Phe804、Arg752、Tyr763、Pro766、Val684與03配體小分子形成疏水相互作用。圖3D.AR與04配體小分子之間的結(jié)合模式，氨基酸殘基Gly683、Glu681、Trp751、Thr755與04配體小分子形成氫鍵相互作用，氨基酸殘基Val684、Gln711、Pro682、Phe804、Pro801、Ala748、Arg752與04配體小分子形成疏水相互作用。圖3E.AR與05配體小分子之間的結(jié)合模式，氨基酸殘基Thr755、Trp751、Glu681、Gln711與05配體小分子形成氫鍵相互作用，氨基酸殘基His714、Val715、Pro682、Gly683、Lys808、Phe804、Arg752、Val684與05配體小分子形成疏水相互作用。圖3F.AR與06配體小分子之間的結(jié)合模式，氨基酸殘基Trp751、Thr755、Glu681、Gln711、Gly683與06配體小分子形成氫鍵相互作用，氨基酸殘基Val685、Val684、Pro682、Ala748、Arg752、Phe804、Pro801與06配體小分子形成疏水相互作用。圖3G.AR與07配體小分子之間的結(jié)合模式，氨基酸殘基Glu678、Trp751與07配體小分子形成氫鍵相互作用，氨基酸殘基Glu681、Pro682、Gly683、Val684、Pro766、Tyr763、Arg752與07配體小分子形成疏水相互作用。圖3H. AR與08配體小分子之間的結(jié)合模式，氨基酸殘基Tyr763、Gly683、Glu678、Trp751與08配體小分子形成氫鍵相互作用，氨基酸殘基Val684、Pro682、Glu681、Leu805、Pro801、Phe804、Thr755、Arg752、Pro766與08配體小分子形成疏水相互作用。本研究選擇關鍵靶標蛋白AR是因為在“藥物-成分-關鍵靶標-通路”多維關聯(lián)網(wǎng)絡中處于關鍵位置，同時它參與了多條重要通路，提示其在前列腺癌對大黃化合物的反應中可能起關鍵作用。分子對接結(jié)果分析見表2，靶蛋白和對應的化合物分子的得分小于-7，表明靶蛋白和化合物分子之間結(jié)合點位較好，同時根據(jù)分子對接分析成功地預測了大黃蒽醌類中8個均入最佳藥物油水分配系數(shù)范圍的化合物與該被測靶蛋白AR亦具有較好的結(jié)合性?？傮w表明，這些結(jié)果進一步證明AR在前列腺癌中作為大黃蒽醌類化合物的治療靶點。

3 討論

前列腺癌是指前列腺發(fā)生的上皮惡性腫瘤，常見于60歲以上老年男性。盡管我國前列腺癌的發(fā)病率與西方國家相比較低，但隨著生活水平的提高和生存環(huán)境的改善，最新流行病學統(tǒng)計顯示近年來呈增長趨勢[30]。前列腺癌的發(fā)病機制尚不明確，轉(zhuǎn)移途徑可經(jīng)局部、淋巴和血行，目前臨床治療方法主要包括藥物治療、手術(shù)治療、化學治療、放射治療、冷凍治療等，但每種治療方法都存在其局限性，因此尋找新的治療藥物和手段具有積極意義[31]。中醫(yī)藥在前列腺癌的診治方面頗具特色，不良反應率低，具有一定的臨床安全性，如健脾利濕化瘀方對人前列腺癌C4-2細胞抑制增殖作用顯著，且大黃在復方中起著化瘀消癥的功效[32]。然而中醫(yī)藥具有“多靶點、多層次、多環(huán)節(jié)”的作用，即各種化學成分聯(lián)合起效的特點，故其治療疾病的具體分子機制和質(zhì)量標志物難以被分析挖掘。本研究通過TCMIP V2.0平臺預測大黃防治前列腺癌的有效成分及其潛在作用靶標，并依據(jù)中藥質(zhì)量標志物“五原則”結(jié)合文獻對大黃防治前列腺癌的質(zhì)量標志物進行預測分析，以求進一步探索前列腺癌與宿主的關系。

研究發(fā)現(xiàn)，大黃防治前列腺癌的質(zhì)量標志物可能以大黃蒽醌類化合物為主。根據(jù)中藥多維關聯(lián)網(wǎng)絡圖分析，關于藥物與疾病的共有靶標為AR和HSP90AA1，發(fā)現(xiàn)多數(shù)化學成分作用于前者，且前列腺癌與雄激素受體聯(lián)系密切[33]。因此，作用于核心靶標AR的大黃化學成分可能是大黃發(fā)揮藥理作用的有效活性成分，并且大部分為大黃蒽醌類化合物，具體可歸為大黃素、大黃酸、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚5大類。本研究又根據(jù)確定質(zhì)量標志物的其他原則，深入挖掘并確認大黃防治前列腺癌的質(zhì)量標志物可能為大黃蒽醌類化合物AnthraglycosideB、Emodin-1-O-β-D-Glucopyranoside、Chrysophanol-8-O-β-D-Glucopyranoside、Chrysophanol-1-O-β-D-Glucoside、RheinosideB、Aloeemodin-8-O-β-D-Glucopyranoside、Physcion-8-β-D-Glucopyranoside、Physcion-8-O-β-D-Glucopyranoside，這些化合物均涉及以上5大類。這與現(xiàn)有的有關大黃的文獻報道一致，或許是大黃防治前列腺癌質(zhì)量標志物篩選的重要依據(jù)[34-35]。與此同時，本研究通過分子對接技術(shù)來探討大黃關鍵靶標AR和成分治療前列腺癌的物質(zhì)基礎和作用機制，為進一步開展的實驗研究提供了參考和線索。但是，鑒于中藥化學成分并不是簡單相加、中藥成分含量及濃度會影響藥效、中藥成分與靶點的作用類型多樣化等復雜特點，后續(xù)仍需要對大黃的具體藥效成分群和候選靶標開展進一步的體內(nèi)外驗證與臨床轉(zhuǎn)化研究，以期開發(fā)出更適用于臨床治療前列腺癌的有效天然化學成分。

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（2020-12-01收稿 責任編輯：魏慶雙，徐穎）