王春柳 萬兆新 周潔 劉洋 張紅 李曄 蘇同生

摘要 目的：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學方法探討艾葉揮發(fā)性成分對膝骨關(guān)節(jié)病的作用機制。方法：基于中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）、DrugBank、TTD數(shù)據(jù)庫分別建立艾葉揮發(fā)性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)和疾病靶點網(wǎng)絡(luò)，基于Cytoscape 3.7.0軟件建立艾葉揮發(fā)性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)并進行網(wǎng)絡(luò)拓撲屬性分析;利用DAVID數(shù)據(jù)庫對核心作用靶點進行基因本體（GO）功能富集分析和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。結(jié)果：構(gòu)建的有效成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)有40個有效成分、265個靶點。靶點互做分析得到的核心靶點生物功能注釋分析，得到的核心BP過程包括類固醇代謝、膽汁酸和膽鹽運輸、氧化還原等;CC過程包括突觸后膜、原生質(zhì)膜組成、等離子體膜等;MF過程包括血紅素結(jié)合、細胞外配體門控離子通道活性、類固醇羥化酶活性等。通路富集得到的核心KEGG通路包括神經(jīng)配體受體交互作用通路、甾類激素生物合成、膽汁分泌等。網(wǎng)絡(luò)分析得到重要的活性成分有龍腦、杜松樟腦、異澤蘭黃素等。結(jié)論：艾葉揮發(fā)性成分對膝骨關(guān)節(jié)病的作用可能是基于調(diào)控神經(jīng)配體受體交互作用通路、神經(jīng)信號負傳導(dǎo)Toll樣受體信號等通路調(diào)理膝骨關(guān)節(jié)病。

關(guān)鍵詞 艾葉;網(wǎng)絡(luò)藥理學;揮發(fā)油;膝骨關(guān)節(jié)病;作用機制

Abstract Objective：The aim of this study was to investigate the mechanism of volatile components of artemisia argyi on knee arthropathy based on network pharmacology.Methods：The volatile component-target network and the disease target network of artemisia argyi were established respectively based on TCMSP，DrugBank and TTD databases.Core targets were enriched by DAVID database for gene ontology（GO） function and genome encyclopedia（KEGG） pathway.Results：The active component-action target network consisted of 40 active components and 265 targets.The annotation analysis of the biological function of the core target obtained by the analysis of the target interaction，the core BP process obtained included steroid metabolism，bile acid and bile salt transport，REDOX，inflammatory response，steroid hormone-mediated signaling pathway，etc.CC process included postsynaptic membrane，protoplasmic membrane composition，plasma membrane，organelle membrane，chlorine channel，etc.The MF process includes heme binding，extracellular ligand gated ion channel activity，steroid hydroxylase activity，iron ion binding，steroid binding，etc.The core KEGG pathways enriched by pathway include the neural ligand receptor interaction pathway，steroid hormone biosynthesis，bile secretion，cytochrome P450 metabolic response to exogenous drugs，negative neural signaling pathway，toll-like receptor signaling pathway，etc.The important active ingredients Predicted were borneol，juniper camphor，isoselanflavin，isoselanol，eugenol，eucalyptus olefine，spartanol，ter-turpentine，-pinene，-borneol acetate，cream-carytene，limonene，cur-elemene and cypreslidene.Conclusion：The effect of volatile components of artemisia argyi on knee arthropathy may be based on the regulation of the neural ligand receptor interaction pathway and the negative conduction of toll-like receptor signaling pathways.The pharmacodynamics may be closely related to borneol，juniper camphor，isoselanthin，isoselanol，eugenol and eucalyptus oil.

Keywords Moxa leaf; Network pharmacology; Volatile oil; Knee arthropathy; Pharmacological mechanism

中圖分類號：R285文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.20.003

膝骨關(guān)節(jié)病是因膝關(guān)節(jié)產(chǎn)生退行性改變導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)部功能發(fā)生障礙的一種慢性疾病，主要臨床表現(xiàn)是膝關(guān)節(jié)疼痛、活動受限、關(guān)節(jié)僵硬等，且兼具病程長、病情復(fù)雜等特點，嚴重降低患者生命質(zhì)量[1-2]。

艾葉是菊科植物艾（Artemisia argyi Levl.et Van）的干燥葉。辛、苦、溫，歸肝、脾、腎經(jīng)，具有“溫經(jīng)止血、散寒止痛”的作用[3]?；诎~的溫通散寒作用，艾灸一直是臨床上治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的常用療法，臨床報道療效良好，可明顯改善膝骨性關(guān)節(jié)炎患者疼痛、僵硬、功能障礙等臨床癥狀[4-6]。艾葉制劑如復(fù)方艾葉油乳膏也可減輕關(guān)節(jié)軟骨的病理損傷，治療膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的療效顯著。近年來，隨著艾灸療法的廣泛應(yīng)用，艾煙帶來的環(huán)境污染和毒性問題也引起了普遍關(guān)注，長期高濃度的吸入艾煙對機體具有一定程度損傷作用[7-8]。由此，艾葉、艾灸的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制研究成為了研究者們必須首先探究明確的問題之一。

網(wǎng)絡(luò)藥理學是中藥學與計算科學、化學、藥理學、藥代動力學等多學科融合的一門交叉學科，其研究策略集化學成分-靶標-疾病-藥理作用網(wǎng)絡(luò)分析于一體，可以系統(tǒng)篩選中藥治療某一疾病的具體化學成分、可能作用靶點以及相關(guān)信號通路網(wǎng)絡(luò)，從而揭示藥物與靶標之間相互作用網(wǎng)絡(luò)的特點[9-11]。近年來網(wǎng)絡(luò)藥理學在中藥作用機制研究中逐漸發(fā)揮出越來越大的影響力。由此，本研究擬借助網(wǎng)絡(luò)藥理學方法分析艾葉揮發(fā)性成分對膝骨關(guān)節(jié)病作用機制，為艾葉在膝骨關(guān)節(jié)病中的臨床應(yīng)用推廣和艾葉新型制劑開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫 采用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）;TTD數(shù)據(jù)庫（https：//db.idrblab.org/ttd/）;DisGeNET（https：//www.disgenet.org/）;ETCM（http：//www.nrc.ac.cn：9090/ETCM/index.php/Home/Index/）;DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）;STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/，Version 10.5）;UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）;Cytoscape軟件（Version 3.4.0）。

1.2 艾葉揮發(fā)性成分收集 分別以艾葉揮發(fā)油為關(guān)鍵詞，查找國家知識基礎(chǔ)設(shè)施數(shù)據(jù)庫（簡稱中國知網(wǎng)，China National Knowledge Infrastructure，CNKI）、Web of Science數(shù)據(jù)庫、TCMSP，收集艾葉揮發(fā)油化學成分報道[12-19]。

1.3 艾葉揮發(fā)性活性化合物篩選 基于艾灸的用法，將艾灸視作經(jīng)皮制劑處理，參考經(jīng)皮制劑研究經(jīng)驗報道[20]，以1

1.4 艾葉活性成分靶點集構(gòu)建 利用TCMSP收集整理活性化合物作用靶點。

1.5 膝骨關(guān)節(jié)病靶點集構(gòu)建 通過TCMSP[10]、Drug bank數(shù)據(jù)庫[11]、TTD數(shù)據(jù)庫[21]、ETCM數(shù)據(jù)庫[22]收集與膝關(guān)節(jié)病相關(guān)的作用靶點，將全部靶點信息導(dǎo)入UniProt數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)換為Official Gene Symbol。

1.6 艾葉活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 利用STRING數(shù)據(jù)庫，查找艾葉揮發(fā)油成分-靶點對應(yīng)的直接蛋白互作及疾病靶點蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，分別導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0中，構(gòu)建艾葉揮發(fā)油化學成分-靶點PPI和膝關(guān)節(jié)病靶點PPI，利用Cytospace的Merge功能對上述2個PPI網(wǎng)絡(luò)進行合并，抽取交集網(wǎng)絡(luò)，即得活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)[23]。

1.7 基因功能富集分析與生物過程分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫對艾葉揮發(fā)油核心作用靶點進行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 活性化合物篩選 通過檢索中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫中關(guān)于艾葉揮發(fā)性成分的報道，收集整理共得到71種化合物，經(jīng)過對ALog P指標篩選，最后有40種成分符合要求。見表1。

2.2 活性成分靶點集構(gòu)建 經(jīng)TCMSP收集艾葉揮發(fā)性成分對應(yīng)靶點，去重復(fù)后得到共計265個，由上述265個靶點組成靶點集合A。

2.3 膝骨關(guān)節(jié)病靶點集構(gòu)建 將TCMSP數(shù)據(jù)庫、Drug bank數(shù)據(jù)庫、TTD數(shù)據(jù)庫、ETCM數(shù)據(jù)庫所收集到的膝骨關(guān)節(jié)病相關(guān)靶點匯集整理，去重復(fù)后得到共計265個，組成疾病靶點集合B。

2.4 活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò) 經(jīng)過交集計算，發(fā)現(xiàn)活性成分-靶點集合A與疾病靶點集合B的交集C共有10個靶點，分別為：ABCG2、CD86、CYP1A2、ESRRA、IL6、NOS2、PIK3CG、PLA2G1B、PTGS2、TP53。

PPI網(wǎng)絡(luò)經(jīng)過Cytoscape 3.7.0可視化后見圖1。網(wǎng)絡(luò)拓撲分析可知活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)共計包含371個節(jié)點、137 270條成分-靶點作用關(guān)系，每個靶點平均相鄰靶點數(shù)目為28.943個，網(wǎng)絡(luò)中心度為0.345，上述數(shù)據(jù)可知，該網(wǎng)絡(luò)是個高度復(fù)雜、高密度網(wǎng)絡(luò)。

為了能夠進一步分析出上述網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點作用集，運用Cytoscape的MCODE工具，進行核心網(wǎng)絡(luò)計算，設(shè)定自由度閾值為100，節(jié)點打分閾值為0.2，K值為2，最大深度為100，經(jīng)計算得到2個最核心的子網(wǎng)絡(luò)集合。見圖2-A、圖3-A。經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)，子網(wǎng)絡(luò)1中包含所有集合C中的靶點。子網(wǎng)絡(luò)2中，有交集C中的TP53、IL6靶點也在其中。對2個子網(wǎng)絡(luò)進行網(wǎng)絡(luò)拓撲分析，發(fā)現(xiàn)子網(wǎng)絡(luò)1包含346個節(jié)點119 370條對應(yīng)關(guān)系，每個節(jié)點相鄰靶點數(shù)目為24.012，網(wǎng)絡(luò)中心度為0.456。子網(wǎng)絡(luò)2包含10個節(jié)點，分別為AKT1、TP53、TNF、IL6、STAT3、IL1B、IL10、CXCL8、VEGFA、ALB，每個節(jié)點平均相鄰靶點數(shù)為9個，網(wǎng)絡(luò)中心度為1.0。說明上述10個靶點為關(guān)鍵的樞紐靶點。

歸屬出子網(wǎng)絡(luò)1和子網(wǎng)絡(luò)2中靶點對應(yīng)的活性成分，建立活性成分-靶點映射網(wǎng)絡(luò)分別見圖2-B、圖3-B。由圖2-B可知，按照度值排序，子網(wǎng)絡(luò)1對應(yīng)活性成分前10位主要有：龍腦、異澤蘭黃素、杜松樟腦、異龍腦、丁香酚、桉油精、斯巴醇、α-松油烯、β-蒎烯、（-）-乙酸龍腦酯，另外β-石竹烯、檸檬烯、γ-欖香烯、柏木烯等成分也同樣屬于網(wǎng)絡(luò)核心節(jié)點，表明其活性與膝骨關(guān)節(jié)病相關(guān)。由圖3-B可知，按照度值排序，子網(wǎng)絡(luò)2對應(yīng)活性成分前10位主要有：龍腦、杜松樟腦、異龍腦、α-松油烯、氧化石竹烯、α-松油烯、斯巴醇、桉油精、β-蒎烯、（-）-乙酸龍腦酯。

2.5 基因功能富集分析與生物過程分析 將該核心網(wǎng)絡(luò)中靶點列表導(dǎo)入DAVID進行功能富集分析，子網(wǎng)絡(luò)1和子網(wǎng)絡(luò)2的GO和KEGG分析結(jié)果分別見圖4、圖5。

由圖4可知，按照P值排名，核心靶點子網(wǎng)絡(luò)1中靶點主要參與生物過程（Biological Process，BP）前10位包括藥物反應(yīng)、類固醇代謝、膽汁酸和膽鹽運輸、氧化還原、異型生物質(zhì)的代謝、P450酶、炎癥反應(yīng)、類固醇激素介導(dǎo)的信號通路、藥物代謝;主要參與的細胞組分（Cellular Component，CC）涉及突觸后膜、原生質(zhì)膜組成、等離子體膜、細胞器膜、氯通道、細胞緊密連接、細胞表面性質(zhì)、管基底等離子體膜;參與的分子功能（Molecular Function，MF）包括血紅素結(jié)合、細胞外配體門控離子通道活性、類固醇羥化酶活性、鐵離子結(jié)合、類固醇連接、氧化還原酶活性、供體受體配對、分子氧結(jié)合或還原、類固醇激素受體活性、藥物連接、單氧酶活性等等。

核心靶點子網(wǎng)絡(luò)2雖然包含靶點較少，依然涉及大量核心的生物過程，同樣按照顯著性P值排名，其參與的BP前10位包括凋亡過程負調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、基因表達的正調(diào)控、序列特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的正向調(diào)控、炎癥反應(yīng)、細胞增殖的負調(diào)控、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、DNA模板化、細胞對有機環(huán)化合物的反應(yīng)、肽酰絲氨酸磷酸化的正調(diào)控等;主要參與的CC涉及細胞外區(qū)域、蛋白質(zhì)復(fù)合體、血小板-阿爾法顆粒管腔、分泌顆粒、細胞質(zhì)、核染色質(zhì)等;參與的MF包括細胞因子活性、相同的蛋白結(jié)合、生長因子活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)DNA結(jié)合、蛋白磷酸酶2A結(jié)合、蛋白結(jié)合、銅離子結(jié)合、蛋白磷酸酶綁定、伴侶蛋白綁定、轉(zhuǎn)錄激活子活性、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)序列特異性結(jié)合等。

由圖5-A可知，核心靶點子網(wǎng)絡(luò)1中靶點主要富集的通路過程（前10位）代表性的有汁分泌、細胞色素P450對外源性藥物代謝反應(yīng)、神經(jīng)信號負傳導(dǎo)神經(jīng)配體受體交互作用通路、甾類激素生物合成、膽通路等;由圖5-B可知，核心靶點子網(wǎng)絡(luò)2主要富集的前10位代表性通路有類風濕性關(guān)節(jié)炎、Toll樣受體信號通路等。

3 討論

艾灸是中醫(yī)學的瑰寶之一，守正創(chuàng)新，傳承精華，開展艾灸作用機制研究是其重要內(nèi)容之一。但是，艾灸療法不同于傳統(tǒng)的湯藥等內(nèi)服中藥，其臨床使用方式是用艾絨在體表的穴位上燒灼、溫熨，借灸火的熱力以及藥物的作用，通過經(jīng)絡(luò)的傳導(dǎo)，以起到溫通氣血、扶正祛邪，從而防治疾病。由于給藥方式的特殊性，有關(guān)艾灸的藥理研究尚待深入開展，因此，找到一種可靠方法能夠為動物實驗或臨床試驗開展指定方向，將具有重大的應(yīng)用價值[6]。本研究首次基于網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，對艾灸的典型臨床應(yīng)用—膝骨關(guān)節(jié)病中艾灸的作用機制進行了初步分析，也可為后續(xù)其他疾病中分析應(yīng)用提供方法學參考借鑒。

《中華人民共和國藥典》2015版本中對于艾葉的質(zhì)量控制檢查項還只有水分和總灰分2項，含量測定僅限于對桉油精單成分的測定。隨著臨床及家用艾灸需求的增加，對于艾葉的質(zhì)量控制也將提出新的要求，艾葉中新的質(zhì)控成分還需要繼續(xù)挖掘。本研究從成分藥理活性角度給出了龍腦、杜松樟腦、異澤蘭黃素、異龍腦、丁香酚、斯巴醇、α-松油烯、β-蒎烯、（-）-乙酸龍腦酯、β-石竹烯、檸檬烯、γ-欖香烯、柏木烯等成分作為潛在質(zhì)控指標的依據(jù)，但還需要結(jié)合含量測定及艾葉整體指紋圖譜等分析結(jié)果，作為研究新的艾葉質(zhì)量控制標準的依據(jù)。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學分析，發(fā)現(xiàn)艾葉揮發(fā)性成分可能是通過調(diào)控神經(jīng)配體受體交互作用通路、甾類激素生物合成、膽汁分泌、細胞色素P450對外源性藥物代謝反應(yīng)、神經(jīng)信號負傳導(dǎo)Toll樣受體信號通路等治療膝骨關(guān)節(jié)病。藥效作用與龍腦、杜松樟腦、異澤蘭黃素、異龍腦、丁香酚、桉油精、斯巴醇、α-松油烯、β-蒎烯、（-）-乙酸龍腦酯、β-石竹烯、檸檬烯、γ-欖香烯、柏木烯等成分密切相關(guān)，本研究分析結(jié)果可為艾灸在膝骨關(guān)節(jié)病中臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，為后續(xù)進行艾灸治療膝骨關(guān)節(jié)病作用機制和有效成分尋找及質(zhì)量控制研究提供線索，具體機制還有待進一步的實驗驗證。

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（2020-09-24收稿 責任編輯：魏慶雙，徐穎）