董田玉 劉遠(yuǎn)遠(yuǎn) 段思琦 付雪瑞 常彥忠

1河北醫(yī)科大學(xué)解剖教研室,石家莊050017;2河北師范大學(xué)鐵代謝分子生物學(xué)研究室,石家莊050024;3河北醫(yī)科大學(xué)期刊社,石家莊050017;4河北醫(yī)科大學(xué)大型科研儀器設(shè)備共享服務(wù)平臺(tái),石家莊050017

基因編輯技術(shù)主要包括鋅指核酸酶 (zinc finger nucleases,ZFN)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(transcription activator like effector nucleases,TALEN)、規(guī)律性重復(fù)短回文序列簇 (clustered regularly interspaced short palindro mic repeats/cas endonuclease,CRISPR/Cas)系統(tǒng)。近年來(lái),CRISPR/Cas系統(tǒng)在基因工程領(lǐng)域取得了重要突破。該項(xiàng)技術(shù)雖然研究時(shí)間不長(zhǎng),但在生物研究和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域產(chǎn)生了重大影響。在人類疾病中,呼吸系統(tǒng)類疾病高居癌癥死亡率之首,科學(xué)家利用CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)在治療肺癌等疾病中進(jìn)行了深入研究,并獲得重大突破。本文重點(diǎn)介紹了近年來(lái)基因編輯技術(shù)及其在呼吸系統(tǒng)等疾病中應(yīng)用及其研究進(jìn)展。

1 基因編輯技術(shù)

1.1 ZFN 編輯技術(shù) 鋅指蛋白是上世紀(jì)80年代由科學(xué)家在非洲爪蟾的轉(zhuǎn)錄因子中發(fā)現(xiàn),后逐步發(fā)展完善成為較早的一類人工編輯基因組的技術(shù)[1]。ZFN 由特異識(shí)別DNA的鋅指蛋白和FokⅠ核酸內(nèi)切酶的剪切結(jié)構(gòu)域兩部分構(gòu)成,是一種人工合成的融合蛋白。將人工設(shè)計(jì)產(chǎn)生的鋅指蛋白與非特異性FokⅠ剪切結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成具有活性的二聚體,即可對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行特異剪切。ZFN 作為第一代被廣泛使用的基因剪切工具,在小鼠、大鼠、斑馬魚及人類細(xì)胞中的技術(shù)建立已經(jīng)較為成熟。2003年,科學(xué)家成功地利用該技術(shù)對(duì)果蠅和人類細(xì)胞的基因進(jìn)行編輯[2]。但是由于ZFN的設(shè)計(jì)復(fù)雜,構(gòu)建時(shí)間長(zhǎng)并且成功率低,不能廣泛的被實(shí)驗(yàn)室掌握,因此該技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用在一定程度上受到了阻礙。

1.2 TALEN 技術(shù) 隨著對(duì)基因編輯技術(shù)的深入研究,TALEN 技術(shù)逐漸取代了ZFN 技術(shù),成為第二代基因編輯技術(shù)[3]。TALENs 核酸酶是由特異識(shí)別結(jié)合DNA 的TALE蛋白和FokⅠ核酸內(nèi)切酶融合組成。TALE 蛋白是一類從植物病原菌黃單胞菌屬分離出的效應(yīng)蛋白,識(shí)別靶標(biāo)序列,同樣地利用限制性核酸內(nèi)切酶FokⅠ對(duì)基因組進(jìn)行編輯。2009年,Moscou和Bogdanove[4]發(fā)現(xiàn)了TALE蛋白特異識(shí)別并結(jié)合DNA 的作用機(jī)制。2011 年,Sander等[5]將改造的Tale 蛋白與FokⅠ核酸內(nèi)切酶構(gòu)建了TALEN 技術(shù),并證實(shí)其能定向修飾基因組。此后,有大量實(shí)驗(yàn)證明該技術(shù)在人類細(xì)胞、小鼠、大鼠、斑馬魚等不同物種均適用[5]。與ZFN 相比,在識(shí)別靶序列的特異性上,TALEN 更具優(yōu)勢(shì)。此外,TALEN 的毒性低,蛋白設(shè)計(jì)也相對(duì)簡(jiǎn)單,因而成為基因治療研究中的有力工具。但是,其重復(fù)序列多,工作量大,在實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用仍存在困難。

1.3 CRISPR/Cas技術(shù) CRISPR/Cas技術(shù)是第三代基因編輯技術(shù),開啟了基因編輯技術(shù)領(lǐng)域的新篇章[6]。CRISPR/Cas系統(tǒng)是一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng),通過靶向DNA或RNA 來(lái)保護(hù)微生物免受外來(lái)核酸 (如噬菌體)的侵襲,約50%的細(xì)菌種類和迄今為止幾乎所有的古細(xì)菌物種都有這種系統(tǒng)[7]。該系統(tǒng)的顯著特征是在基因組上含有CRISPRarray序列,由富含AT 的前導(dǎo)序列和串聯(lián)重復(fù)序列組成,這些串聯(lián)重復(fù)序列又被序列特異的間隔隔開。CRISPR/Cas系統(tǒng)抵抗外源DNA 入侵。CRISPR/Cas系統(tǒng)通過三個(gè)階段介導(dǎo)適應(yīng)性免疫 (免疫和防御)[8]:首先,適應(yīng)階段,當(dāng)病毒或其他外來(lái)遺傳物質(zhì)入侵時(shí),細(xì)菌將部分外源的DNA 捕獲并整合到CRISPR array的串聯(lián)重復(fù)序列中,形成新的間隔序列。其次,表達(dá)階段,將CRISPR array轉(zhuǎn)錄并加工成單獨(dú)的cr RNA,每個(gè)cr RNA 帶有病毒或質(zhì)粒的RNA 片段以及CRISPR 重復(fù)序列的一部分成為成熟的cr RNA。第三,干擾階段,cr RNA 引導(dǎo)Cas蛋白的復(fù)合物或單個(gè)Cas蛋白對(duì)入侵者進(jìn)行切割,最終達(dá)到免疫的效果。

CRISPR 有很多變化,而且CRISPR/Cas系統(tǒng)也具有廣泛的自然多樣性,包括靶向DNA 的系統(tǒng)、靶向RNA 的系統(tǒng)以及同時(shí)靶向DNA 和RNA 的系統(tǒng)。CRISPR/Cas系統(tǒng)也以不同的方式運(yùn)行,通過各種效應(yīng)子-cr RNA 復(fù)合物介導(dǎo)的不同機(jī)制識(shí)別和切割其核酸靶點(diǎn)。根據(jù)其獨(dú)特的效應(yīng)蛋白,CRISPR/Cas系統(tǒng)目前分為6種類型 (Ⅰ～Ⅵ),又分為兩大類:1類系統(tǒng) (TypeⅠ、TypeⅢ和TypeⅣ型)使用多個(gè)Cas蛋白復(fù)合物來(lái)實(shí)現(xiàn)免疫應(yīng)答,2類系統(tǒng) (TypeⅡ、TypeⅤ和TypeⅥ型)利用單個(gè)核酸酶Cas效應(yīng)子進(jìn)行免疫應(yīng)答[9-10]。例如屬于TypeⅡ型系統(tǒng)的Cas9,只需要Cas9蛋白即可與成熟的cr RNA 組裝成RNP復(fù)合物對(duì)DNA 進(jìn)行切割[11-12]。2013 年,CRISPR/Cas技術(shù)正式用于DNA 編輯修飾中[13]。與前兩種基因編輯技術(shù)相比,該技術(shù)的構(gòu)建成本更低、操作更加便捷、編輯效率也更高效。其不斷地研究發(fā)現(xiàn)為生物學(xué)及臨床應(yīng)用領(lǐng)域的發(fā)展帶來(lái)了巨大變革,在基因治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

2 基因編輯技術(shù)在疾病中的應(yīng)用

2.1 疾病模型中的應(yīng)用 CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)生物學(xué)研究發(fā)展最直接的影響之一是建立植物、動(dòng)物和細(xì)胞模型。首先,因?yàn)镃RISPR/Cas9技術(shù)極大地減少了修改傳統(tǒng)真核生物模型和細(xì)胞系基因組所需的時(shí)間和精力 (酵母除外,對(duì)于酵母而言,已有數(shù)十年的強(qiáng)大基因操作工具)。其中一個(gè)關(guān)鍵的例子是基因敲除小鼠的產(chǎn)生。在2013年之前,基因敲除小鼠是用改良的胚胎干細(xì)胞制造的,整個(gè)過程需要1～2年,而Cas9介導(dǎo)的基因敲除可以在幾周到幾個(gè)月內(nèi)完成[14-15]。最近,有學(xué)者提出可以通過使用Cas9介導(dǎo)的基因驅(qū)動(dòng)方法來(lái)進(jìn)一步加速定制小鼠模型的產(chǎn)生[16]。這種方法也適用于創(chuàng)建非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型[17]。同樣,CRISPR 工具易于重新編程,使其得以大規(guī)模應(yīng)用,從而快速創(chuàng)建細(xì)胞系庫(kù)。其次,CRISPR/Cas9技術(shù)可以容易地處理多種其他生物的基因,包括寄生蟲、微生物和非模型生物[18],例如甲殼類動(dòng)物[19]、黃蜂[20]、蝴蝶[21]和硅藻[22]。第三,CRISPR/Cas9技術(shù)被用于創(chuàng)建特定的動(dòng)物和細(xì)胞模型,以重現(xiàn)在人類患者發(fā)現(xiàn)的基因變異[23]。這些特定的模型使疾病模型更加精確,可用于了解一系列人類疾病的分子病理學(xué),并開發(fā)新的治療策略來(lái)治療這些疾病。例如,通過Cas9介導(dǎo)的基因編輯創(chuàng)建了亨廷頓舞蹈癥的豬模型,從而可以在相關(guān)的動(dòng)物模型中研究這種疾病[24]。第四,Cas9可在體內(nèi)加速構(gòu)建疾病模型,例如癌癥[25-26]。此外,已經(jīng)創(chuàng)建了d Cas9-EGFP 敲入小鼠,可以輕松、動(dòng)態(tài)地跟蹤目標(biāo)基因組區(qū)域[27]。利用這些小鼠模型,研究人員可以更容易地在特定的細(xì)胞類型中實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因敲除,更快地為疾病建模,從而研究多種生物學(xué)過程,包括癌癥、傷口愈合[28]、突觸傳遞[29]、晝夜節(jié)律[30]和T 細(xì)胞分化[31]等。

2.2 呼吸系統(tǒng)疾病治療中的應(yīng)用 氧化應(yīng)激可導(dǎo)致肺纖維化引起呼吸疾病[32]。通過CRISPR/Cas9 技術(shù)在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中已證明低聚原花色素對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞 (A549)中過氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激起到保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),低聚原花色素刺激的A549細(xì)胞中改變了Nrf2的表達(dá)。Nrf2是對(duì)氧化還原反應(yīng)敏感的轉(zhuǎn)錄因子,可以引起其下游靶基因在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平上的變化。通過CRISPR/Cas9技術(shù)敲除Nrf2可以消除Nrf2與抗氧化反應(yīng)元件ARE 的結(jié)合,從而消除了低聚原花色素介導(dǎo)的針對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的保護(hù)作用[33]。研究表明在A549細(xì)胞的抗氧化反應(yīng)中低聚原花色素通過Nrf2-ARE 途徑起重要作用,這項(xiàng)研究為呼吸疾病的治療提供了理論依據(jù)[34]。

而且在臨床試驗(yàn)中CRISPR/Cas9技術(shù)已經(jīng)開始作為肺癌的干預(yù)手段。該試驗(yàn)主要對(duì)PD-1 的功能進(jìn)行了研究。PD-1只能在活化的T 細(xì)胞中表達(dá),該基因可促進(jìn)細(xì)胞的凋亡,是臨床上的一個(gè)免疫檢查點(diǎn)。當(dāng)PD-1被敲除時(shí)會(huì)延長(zhǎng)T 細(xì)胞的存活時(shí)間,這是因?yàn)門 細(xì)胞周期檢查點(diǎn)被抑制所導(dǎo)致,引起活化的T 細(xì)胞的存活時(shí)間延長(zhǎng)。通過CRISPR/Cas9技術(shù)敲除PD-1基因后,血液中活化的具有免疫功能的T 細(xì)胞數(shù)量明顯增加,以此來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)[35]。此次試驗(yàn)中,通過收集病患自體來(lái)源的T 細(xì)胞 (外周血液中),利用CRISPR/Cas9技術(shù)將PD-1基因敲除而喪失基因功能,再通過擴(kuò)增篩選出已敲除PD-1的T 淋巴細(xì)胞,并將其分批回輸患者身體中,通過觀察臨床效果發(fā)現(xiàn)敲除PD-1基因?qū)Ψ伟┯幸种谱饔肹36]。

2.3 AIDS和白血病治療中的應(yīng)用 CRISPR/Cas9技術(shù)已廣泛應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組的體外編輯。盡管這種方法顯示出潛在的臨床實(shí)用性,并且已經(jīng)開始進(jìn)行臨床試驗(yàn)以探索基于CRISPR 療法的安全性和可行性[37]。有研究表明,G 蛋白偶聯(lián)因子超家族成員CCR5基因是治療人類免疫缺陷病毒Ⅰ型 (hu man i mmunodeficiency vir us type 1,HIV-1)感染的理想靶點(diǎn),因?yàn)镃CR5 缺失的血細(xì)胞對(duì)HIV-1進(jìn)入具有很大的抗性[38]。2019 年,Xu 等[39]利用CRISPR/Cas9技術(shù),在人體造血干細(xì)胞上進(jìn)行CCR5基因編輯,實(shí)現(xiàn)了基因編輯后的成體造血干細(xì)胞在人體長(zhǎng)期穩(wěn)定的造血系統(tǒng)重建,初步證明了CRISPR/Cas9治療AIDS和白血病的可行性和在人體內(nèi)的安全性。該研究將經(jīng)CRISPR/Cas9編輯的CCR5敲除后的供者來(lái)源的CD34+成體造血干細(xì)胞移植到患有HIV-1感染和急性淋巴細(xì)胞白血病的患者中。在之后19個(gè)月的觀察中未發(fā)現(xiàn)基因編輯造成的脫靶及其他不良反應(yīng)。之后為了進(jìn)一步探索治療的有效性,對(duì)該患者短暫停止服用抗人類免疫缺陷病毒藥物。在此期間,CCR5基因編輯的T 細(xì)胞表現(xiàn)出一定程度抵御人類免疫缺陷病毒感染的能力。目前,雖然人們已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了CRISPR 編輯的造血干細(xì)胞的成功移植和長(zhǎng)期植入,但淋巴細(xì)胞中CCR5破壞率僅約為5%,這表明還需要進(jìn)一步進(jìn)行研究。

2.4 其他疾病治療中的應(yīng)用 基因編輯技術(shù)在治療其他多種疾病上也取得了重要的研究進(jìn)展。2018 年,Long等[40]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥患者機(jī)體的多能干細(xì)胞進(jìn)行改造,使其產(chǎn)生了健康的心肌。2017 年,Liao等[41]報(bào)道利用CRISPR/Cas9在糖尿病小鼠體內(nèi)募集轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物,實(shí)現(xiàn)順式表觀遺傳學(xué)修飾,介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄活化的組蛋白修飾狀態(tài),從而實(shí)現(xiàn)內(nèi)源基因的激活。利用該體系可在肝臟內(nèi)成功激活內(nèi)源PDX1表達(dá),使其分泌胰島素。Chen等[42]發(fā)現(xiàn),酸敏感離子通道1 參與了前列腺癌細(xì)胞酸介導(dǎo)的信號(hào)通路,并且在前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)升高,通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除酸敏感離子通道1可以顯著降低前列腺癌細(xì)胞的侵襲能力和去勢(shì)抵抗性。汪超甲等[43]利用CRISPR/Cas9表達(dá)載體敲除了在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中高表達(dá)的Pyk2,抑制了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力,揭示了其在膠質(zhì)瘤發(fā)生過程中的作用,為治療膠質(zhì)瘤提供了理論基礎(chǔ)。Rubio等[44]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在干細(xì)胞中針對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)基因TSC2 與KCNQ2進(jìn)行靶向滅活。TSC2與結(jié)節(jié)性腦硬化相關(guān),KCNQ2與家族性先天性癲癇有關(guān)[45]。

3 問題與展望

CRISPR 系統(tǒng)介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)出現(xiàn)以來(lái),就在生物醫(yī)學(xué)等諸多領(lǐng)域產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響,但目前該技術(shù)在臨床治療應(yīng)用中仍然存在一些問題,如有效性問題。我們知道基因編輯體系依賴于外源編輯酶或效應(yīng)蛋白的表達(dá),而蛋白分子量過大會(huì)很難通過病毒載體進(jìn)行裝載以及人體內(nèi)遞送,并且蛋白過表達(dá)引起的DNA/RNA 水平的脫靶效應(yīng)、機(jī)體內(nèi)的抗體中和外源編輯酶或效應(yīng)蛋白都會(huì)導(dǎo)致基因編輯失敗。此外,還存在由外源蛋白表達(dá)引起的機(jī)體免疫反應(yīng)及排斥的安全性問題。除了這些技術(shù)問題,倫理問題也不容忽視。2018年,有研究者跨過人類胚胎基因編輯技術(shù)的體外試驗(yàn)階段,對(duì)2名志愿者在胚胎上進(jìn)行基因編輯并植入母體,其中1名已經(jīng)產(chǎn)下雙胞胎女嬰,由于這對(duì)雙胞胎的一個(gè)基因 (CCR5)經(jīng)過修改,她們出生后即能天然抵抗人類免疫缺陷病毒[46]。這一事件一經(jīng)宣布,立即引起了世界的關(guān)注,科學(xué)家們對(duì)此事更多的是質(zhì)疑和負(fù)面評(píng)價(jià)。

隨著科學(xué)家研究的不斷深入探索,基因編輯技術(shù)正在走向成熟?；蚓庉嫾夹g(shù)已經(jīng)在基礎(chǔ)科研和臨床應(yīng)用中取得了重大突破與進(jìn)展,具有極大的研究潛力和廣闊的應(yīng)用前景,將會(huì)使我們對(duì)疾病機(jī)制的理解、對(duì)生物基因網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)更加清楚。盡管目前對(duì)于基因治療還有許多技術(shù)難題需要解決,但我們可以相信隨著人類基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的闡明,以及轉(zhuǎn)基因方法的完善,基因編輯技術(shù)會(huì)在臨床疾病治療中發(fā)揮其不可替代的價(jià)值。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突