間充質(zhì)干細胞源性外泌體在呼吸系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用與機制研究進展

郭瑞敏，曹毓琳，程世翔，連 杰，劉彥禮，林俊堂

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院干細胞與生物治療技術(shù)研究中心，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.北京臻溪谷醫(yī)學研究中心，北京 100034；3.武警部隊腦創(chuàng)傷與神經(jīng)疾病研究所/天津市神經(jīng)創(chuàng)傷修復(fù)重點實驗室，天津 300052)

細胞外囊泡是一種由真核細胞在正?；虿±項l件下釋放至細胞外、含有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)、與細胞具有相同拓撲結(jié)構(gòu)的胞外顆粒，其大小從約30 nm至數(shù)微米不等[1]。細胞外囊泡攜帶有大量的來自母體細胞的分子物質(zhì)，負責細胞間信號傳遞及物質(zhì)代謝過程，其內(nèi)容物主要包括各種蛋白質(zhì)、氨基酸、脂質(zhì)、核酸及代謝物[2-4]。依據(jù)細胞外囊泡直徑大小可分為3類，分別是凋亡小體(500 nm至4 μm)、微囊泡(100 nm至1 μm)和外泌體(30～100 nm)[5-6]。

外泌體包含一系列膜相關(guān)的高階寡聚蛋白復(fù)合物，表現(xiàn)出明顯的分子異質(zhì)性，由內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷或向內(nèi)出芽形成多泡體(multivesicular body,MVB)，隨后MVB外膜與細胞膜融合而產(chǎn)生[7]。外泌體生物發(fā)生是一種蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等的調(diào)控機制，被胞體釋放的外泌體具有多種活性功效，是促進細胞間通訊的重要介質(zhì)，不需要細胞與細胞直接接觸。在各種疾病中，外泌體也成為了解細胞或組織狀態(tài)變化的窗口，通過檢測其在生物液體中的多種組分為疾病診斷提供依據(jù)[8]。上述機制在人類健康和疾病的許多方面發(fā)揮重要作用，包括發(fā)育、免疫、組織穩(wěn)態(tài)、癌癥和神經(jīng)退行性疾病等[9]。同時，一些創(chuàng)新性研究揭示了外泌體作為納米載體的優(yōu)勢，與合成的納米顆粒相比，外泌體具有毒性低、無免疫原性和滲透性好等優(yōu)勢，所以外泌體具有可以穿透天然屏障(如血腦屏障等)和逃脫免疫系統(tǒng)降解或清除的能力?？偠灾饷隗w天然的生物相容性使其成為臨床理想的天然納米載體[10]?；谶@些特性，外泌體逐漸被開發(fā)為多種疾病模型的治療藥物。

使用間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell,MSC)治療呼吸系統(tǒng)疾病具有廣闊的前景，然而，對MSC帶來的醫(yī)源性腫瘤形成風險的擔憂仍然存在[11]。越來越多的證據(jù)表明，MSC來源的條件培養(yǎng)基和MSC釋放的細胞外囊泡在新型無細胞治療領(lǐng)域是極具吸引力的替代方案[12-15]。研究顯示，MSC主要通過其分泌產(chǎn)物外泌體發(fā)揮作用[16]，間充質(zhì)干細胞外泌體(mesenchymal stem cell exosome,MSC-Exo)的功能是MSC作為組織基質(zhì)支持細胞發(fā)揮生物學作用的延伸，同其母體細胞一樣，MSC-Exo有助于維持組織穩(wěn)態(tài)，以獲得最佳的組織功能[17]。與MSC功能類似，MSC-Exo在免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)方面的作用也備受關(guān)注。研究顯示，MSC-Exo可抑制CD4+、CD8+T細胞和自然殺傷細胞的增殖和分化[18]，抑制T細胞表達白細胞介素(interleukin,IL)-17，并誘導調(diào)節(jié)性T細胞表達IL-10，這些細胞因子均與炎癥反應(yīng)有關(guān)；MSC-Exo通過釋放轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor,TGF)等分子而輔助抑制CD4+和CD8+T細胞的分化，從而預(yù)防體內(nèi)炎癥反應(yīng)[19]；MSC-Exo還可將巨噬細胞從M1表型轉(zhuǎn)化到M2表型，抑制其促炎狀態(tài)[18]；MSC-Exo也可抑制促炎因子如轉(zhuǎn)化生長因子-α(transforming growth factor-α,TGF-α)、γ干擾素(interferon-γ,IFN-γ)、IL-6、IL-17和IL-1的釋放[20]，促進抗炎因子IL-4、IL-10和TGF-β的釋放[21]。值得注意的是，MSC-Exo被大量用于多種疾病模型的臨床前研究，如骨骼肌再生[22]、免疫治療和皮膚組織再生、骨關(guān)節(jié)炎和骨折[23-25]、肝臟疾病[26]、自身免疫疾病和神經(jīng)系統(tǒng)退行性紊亂疾病[27-28]、2型糖尿病[29]、腫瘤或癌癥[30]、牙齦修復(fù)和牙周組織再生[31-32]、心臟病[33-34]及眼科疾病[10]等，同時，對呼吸系統(tǒng)疾病也具有廣闊的治療前景。故本文就MSC-Exo治療呼吸系統(tǒng)疾病及相關(guān)機制進行闡述，以期對臨床藥物開發(fā)起到指導作用。

1 MSC-Exo對哮喘的作用

哮喘是一種復(fù)雜的慢性炎癥性疾病，通常始于兒童時期[35]，其特征是呼吸道收縮并伴隨炎癥，該病理特征可能導致呼吸道結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，且對過敏原、感染和空氣污染物[36]發(fā)生較強烈的反應(yīng)。哮喘的主要臨床癥狀為咳嗽、呼吸急促、胸悶和喘息等，是由呼吸道炎癥受損而導致的黏液過度分泌、支氣管高反應(yīng)性和呼吸道粒細胞活化所引起的。哮喘的生物療法主要針對患者Ⅱ型細胞因子活性升高而定，迄今為止，已有4種被批準的藥物可以直接抑制Ⅱ型細胞因子，其中美泊利單抗(mepolizumab)、貝那利珠單抗(benralizumab)和瑞利珠單抗(reslizumab)等3種藥物靶向細胞因子IL-5或其受體(IL-5RA)，第4種藥物度普利尤單抗(dupilumab)是靶向IL-4和IL-13的信號受體IL-4RA[37]。但這些單抗只能減輕呼吸道炎癥反應(yīng)，并不能夠加速受損肺臟的修復(fù)。有研究顯示，骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMMSC)可以減輕過敏性哮喘導致的肺部炎癥，促進呼吸道結(jié)構(gòu)功能重塑[38-39]。

MSC-Exo似乎比MSC治療具有更大的優(yōu)勢和更好的療效。研究顯示，類固醇抵抗哮喘小鼠氣管內(nèi)給予MSC-Exo可以逆轉(zhuǎn)氣道高反應(yīng)性、組織病理學改變和炎癥反應(yīng)；MSC-Exo可通過重塑巨噬細胞極化、調(diào)控核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)和磷酯酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3 kinase/ protein kinase B,PI3K/Akt)信號通路來抑制腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子1表達，從而緩解炎癥反應(yīng)，改善哮喘[40]。另外一項研究也發(fā)現(xiàn)了外泌體在MSC免疫調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，以BMMSC分泌的外泌體處理哮喘患者外周血單個核細胞，發(fā)現(xiàn)MSC-Exo上調(diào)外周血單個核細胞分泌的IL-10和TGF-β1水平，從而促進調(diào)節(jié)性T細胞的增殖和免疫抑制，并提出了MSC-Exo治療哮喘具有巨大潛力的建議[41]。

2 MSC-Exo對急性肺損傷(acute lung injury,ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)的作用

ALI與組織病理學上的彌漫性肺泡損傷相關(guān)。MSC-Exo治療ALI的分子調(diào)控機制比較復(fù)雜，但可以肯定的是外泌體中miR-30b-3p升高對ALI有保護作用，miR-30b-3p過表達可逆轉(zhuǎn)脂多糖誘導的小鼠ALI，其機制可能是通過抑制肺泡上皮細胞凋亡、下調(diào)血清淀粉樣蛋白(serum amyloid a protein A3,SAA3)表達而對肺損傷起到修復(fù)和功能改善作用[42]。MSC-Exo對光氣誘導的ALI也有治療作用，其主要是通過降低機體TNF-α、IL-1β和IL-6水平、提高IL-10和表面活性蛋白C水平、抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9合成等機制來發(fā)揮作用[43]。MSC-Exo還可以通過核因子E2相關(guān)因子2/抗氧化反應(yīng)原件和NF-κB信號通路來逆轉(zhuǎn)脂多糖誘導的ALI[44]。

肺部病毒感染常常伴隨著ALI。在一項豬流感病毒模型實驗中發(fā)現(xiàn)了MSC源細胞外囊泡(mesenchymal stem cell derived extracellular vesicle,MSC-EV)具有抗病毒效果，在流感病毒感染12 h后，氣管內(nèi)給予MSC-EV后顯著減少了流感病毒在鼻拭子中的病毒脫落和在肺部的復(fù)制，以及肺部促炎細胞因子的產(chǎn)生，該研究首次在大型動物中驗證了MSC-EV的抗病毒和抗炎特性，以及EV作為無細胞療法治療流感的可能性[45]。因此，將來MSC-EV極有可能成為人類流行性感冒的無細胞治療策略。

細菌性肺炎是危重患者呼吸衰竭的主要原因之一。盡管支持性護理和適當使用抗生素可使細菌性肺炎癥狀有所改善，但其發(fā)病率和患者的病死率仍然很高[46]。MSC-EV在治療重癥細菌性肺炎方面也療效顯著。MSC-EV可通過促進角質(zhì)形成細胞生長因子的分泌，減少炎癥細胞、細胞因子、蛋白質(zhì)和細菌的流入，減輕小鼠肺部損傷，從而提高重癥細菌性肺炎小鼠的生存率[47]。EV的攝取是由CD44受體介導的，EV可以增強受損肺泡上皮Ⅱ型細胞的單核細胞吞噬作用，減少炎癥細胞因子分泌，提高細胞內(nèi)ATP水平[47]。在銅綠假單胞菌感染的肺炎小鼠中，機體通過向肺泡運輸MSC-EV來降低損傷肺泡內(nèi)的細菌負荷[48]，這可能與肺泡巨噬細胞經(jīng)MSC-EV作用后具有較高的抗菌活性有關(guān)[49]。

ARDS與ALI具有性質(zhì)相同的病理生理改變。ARDS的特征是先天免疫細胞介導的肺泡-毛細血管屏障損壞、富含蛋白質(zhì)的水腫液涌入小間隙和肺泡等，常會導致進行性呼吸衰竭[50]。雖然ARDS的治療和支持性護理措施已取得重大進展，但患者病死率仍在40%左右[51]。新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)是由嚴重急性呼吸綜合征2型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)感染引起的急性呼吸道傳染病，傳染性高、傳播速度快，且該病毒具有很強的變異性，為疾病防控和治療帶來艱巨挑戰(zhàn)，從而嚴重影響國內(nèi)外經(jīng)濟發(fā)展和人民健康。COVID-19的治療基本上依賴于患者自身的免疫系統(tǒng)，當免疫系統(tǒng)過度激活試圖殺死病毒時，會產(chǎn)生大量的炎癥因子，導致嚴重的細胞因子風暴，細胞因子風暴可引起器官損傷，繼發(fā)水腫、肺換氣功能障礙、ARDS、感染等，進而導致患者死亡[52]。超過50%的重癥監(jiān)護患者血漿中粒細胞集落刺激因子和TNF-α水平升高，因此，避免細胞因子風暴可能是治療COVID-19的關(guān)鍵。MSC對自身免疫性疾病不僅可提供基于宿主細胞的免疫調(diào)節(jié)作用，還可防止組織纖維化，使肺功能障礙得以逆轉(zhuǎn)，有助于受損組織的再生[53]。一些臨床前和臨床研究探索了MSC和外泌體治療COVID-19的潛力。2020年1月，首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院對7例COVID-19患者使用BMMSC進行治療，結(jié)果顯示，發(fā)熱、呼吸急促、低氧飽和度等癥狀在治療后2～4 d消失或改善[50]。臨床前研究顯示，MSC-EV或其條件培養(yǎng)基(MSC derived conditional medium，MSC-CM)在各種疾病模型如支氣管肺發(fā)育不良、哮喘、纖維化和慢性阻塞性肺疾病中的療效與MSC治療的療效相似[54]，其可以強有效地調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[55]，能夠內(nèi)源性修復(fù)并減少與COVID-19發(fā)病率和病死率相關(guān)的炎癥反應(yīng)[56]。與MSC相比，外泌體具有顯著優(yōu)勢，例如：可量產(chǎn)，且更易運輸和保存，大大增加了成為貨架商品的可能性；系統(tǒng)性給藥毒性和血管栓塞風險更??；無致瘤風險且可輕松穿越血腦屏障，并能高效到達目標或損傷部位等。另外，MSC-Exo可以在體內(nèi)被修飾，釋放具有更高免疫調(diào)節(jié)潛能的外泌體，故MSC-Exo可能是非常適合治療COVID -19的藥物[55]。在美國醫(yī)療資源嚴重緊缺的情況下，對危重患者用人臍帶MSC采取同情治療來降低發(fā)病率和病死率，獲得了政府和冠狀病毒特別工作小組的認可[52]。2020年4月，ExoFloTM(源于BMMSC的外泌體產(chǎn)品)被提供給某中心醫(yī)院的24例重癥COVID-19患者，在接受單次靜脈注射ExoFloTM 15 mL治療后第1～14天評估其安全性和有效性，結(jié)果顯示患者存活率為83%[57]。因此，MSC-Exo可能是緩解重癥感染的優(yōu)良選擇，然而，其作用機制需要更多的臨床前和臨床研究來探索，并需進一步確定其安全性和有效性。

3 MSC-Exo對慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)的作用

COPD是一種呼吸系統(tǒng)疾病，根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，COPD是世界第3致死疾病，2019年死亡人數(shù)高達3.23百萬[58]，在中國COPD形式也很嚴峻，40歲和60歲以上人群的發(fā)病率分別高達13.7%和40.0%[59]。目前仍缺乏有效的治療方法來改善肺結(jié)構(gòu)異常并逆轉(zhuǎn)COPD的進展。而以MSC及其外泌體為基礎(chǔ)的治療方法在COPD治療中備受關(guān)注，并顯示出良好的臨床應(yīng)用前景。研究顯示，MSC-Exo對COPD大鼠模型具有顯著的治療作用，可抑制支氣管和血管周圍的炎癥反應(yīng)，使肺泡間隔增厚，杯狀細胞數(shù)量減少，同時降低肺組織中亞基p65的表達水平[60]。塞爾維亞克拉古耶瓦茨大學醫(yī)學院微生物學、分子醫(yī)學和干細胞研究中心設(shè)計出MSC衍生產(chǎn)品“Exosome-derived multiple allogeneic protein paracrine signaling (Exo-d-MAPPS)”，Exo-d-MAPPS含有高濃度的免疫調(diào)節(jié)因子，包括可溶性TNF受體Ⅰ和Ⅱ、IL-1受體拮抗劑和晚期糖基化終產(chǎn)物可溶性受體，這些因子能夠減輕慢性呼吸道炎癥；實驗研究顯示，Exo-d-MAPPS可以顯著改善COPD小鼠的呼吸功能，下調(diào)血清炎癥因子(TNF-α、IL-1β、IL-12和IFN-γ)水平，上調(diào)血清免疫抑制因子IL-10水平，減輕慢性呼吸道炎癥；在肺細胞組成方面，Exo-d-MAPPS處理可減少肺浸潤的巨噬細胞、中性粒細胞、自然殺傷細胞和自然殺傷T細胞中炎癥細胞因子的產(chǎn)生，并減弱肺浸潤的巨噬細胞和樹突狀細胞的抗原提呈特性；此外，Exo-d-MAPPS可促進炎癥肺部產(chǎn)生免疫抑制IL-10，交替激活巨噬細胞、調(diào)節(jié)性樹突狀細胞和CD4+FoxP3+調(diào)節(jié)性T細胞，從而減輕慢性呼吸道炎癥[41]。臨床研究顯示，Exo-d-MAPPS可以顯著改善COPD患者的肺功能和生活質(zhì)量，且Exo-d-MAPPS耐受性良好，30例COPD患者在使用Exo-d-MAPPS后均未出現(xiàn)任何不良反應(yīng)[61]。

4 MSC-Exo對肺纖維化的作用

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)為肺纖維化最常見的類型，其是一種慢性、進行性、不可逆的間質(zhì)性肺疾病[62]，通常具有致命性，患者確診后生存期為3～5 a[63]。IPF的組織病理學特征主要為胸膜下纖維化、成纖維細胞灶(顯微鏡下呈蜂窩狀)。肺纖維化的發(fā)病機制復(fù)雜，涉及多種危險因素，包括環(huán)境暴露、吸煙、慢性病毒感染等。肺纖維化的傳統(tǒng)治療方法有藥物治療、肺移植、長期氧氣治療、姑息治療等，而MSC治療作為一種新興的治療方法，已被大量臨床前研究和正在進行的臨床試驗證明具有十分廣闊的應(yīng)用前景[63]。

近期臨床前研究證明，MSC-Exo對IPF的治療效果取得了可喜的成績。MSC-Exo可治療小鼠高氧誘發(fā)的肺纖維化和肺損傷，減輕高氧癥相關(guān)炎癥，改變高氧肺轉(zhuǎn)錄組，減少纖維化和肺血管重塑，改善肺動脈高壓，其作用機制與調(diào)節(jié)肺巨噬細胞表型有關(guān)[64]。一項對博萊霉素誘導的C57BL/6肺纖維化小鼠模型的研究顯示，骨髓來源的MSC-Exo可調(diào)節(jié)肺泡巨噬細胞表型，使肺促炎癥經(jīng)典和非經(jīng)典途徑的單核和巨噬細胞的比例向正常的轉(zhuǎn)變[65]。人臍帶來源的MSC-Exo可調(diào)節(jié)二氧化硅誘導的肺纖維化小鼠的肺功能，其機制可能是通過抑制TGF-β1/Smad2/3信號通路激活的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化來緩解肺纖維化[66]。總之，由于外泌體自身組成的復(fù)雜性，導致MSC-Exo對肺纖維化的調(diào)節(jié)機制也異常復(fù)雜，尚需要更多的研究來進一步闡明其詳細機制。

5 MSC-Exo對肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension,PAH)的作用

PAH是一種以小肺動脈平滑肌細胞增生和肥大為病理改變的疾病，其主要特征是肺動脈重構(gòu)、肺浸潤增加、血管橫斷面損失等，從而導致平均肺動脈壓增加和右心室負荷過重[67]。研究顯示，PAH的嚴重程度與受刺激或發(fā)生凋亡的內(nèi)皮細胞釋放的循環(huán)細胞外囊泡的增加有關(guān)，可能是由于可溶性血管細胞黏附分子-1的釋放及促炎標志物如單核細胞趨化蛋白和高度特異性C反應(yīng)蛋白水平升高所致[68]。有研究發(fā)現(xiàn)，野百合堿誘導的PAH小鼠給予MSC-Exo治療后，經(jīng)miRNA微陣列芯片分析發(fā)現(xiàn)，MSC-Exo可以逆轉(zhuǎn)右心室/(左心室+室間隔)之比，降低肺動脈壁厚度與直徑之比；對野百合堿誘導的PAH小鼠和先天性PAH患者的血漿分析發(fā)現(xiàn)，miR-19b、miR-20a、miR-20b和miR-145表達水平升高，而使用MSC-Exo治療后，具有抗炎和抗惡性細胞增生作用的miR-34a、miR-122、miR-124和miR-127表達水平升高，提示MSC-Exo可根據(jù)其運載的miRNA調(diào)節(jié)PAH[69]。MSC-Exo的這些功能可為PAH提供新的治療策略。

6 討論

細胞外囊泡或外泌體作為細胞間通訊交流的載體，參與多種病理生理過程。與細胞治療相比，外泌體具有更低的免疫原性和成瘤風險，且基本不涉及倫理問題。在材料學方面，外泌體是天然的納米材料，具有更好的組織相容性和更高的治療安全性，而且其來源廣泛，易于獲取，大大降低了細胞治療成本。通過目前已有的基因工程、細胞工程及外泌體工程等手段，可對外泌體所攜帶的信號分子進行特定修飾，制備成具有特定功能的工程化外泌體，用于各種疾病的臨床治療。

基于上述優(yōu)勢，外泌體治療在生物醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用正在迅速崛起。從1946年首次觀察到細胞外囊泡至今，其研究熱度逐年上漲，在疾病的臨床診斷和治療中展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景。在臨床疾病精準診斷中，細胞外囊泡或外泌體可用于腫瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病、腎臟疾病、內(nèi)分泌疾病及心血管疾病等的診斷。同時，人類血液外泌體RNA數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建極大方便了對癌癥患者的溯源研究。在疾病治療方面，MSC-Exo主要被用于減緩炎癥反應(yīng)、腫瘤免疫治療、逆轉(zhuǎn)認知功能衰退、改善壓瘡愈合、預(yù)防老年性骨丟失及缺血性疾病、肝臟疾病、呼吸系統(tǒng)疾病的治療等。

經(jīng)典的外泌體治療途徑主要包括肌內(nèi)注射和靜脈注射，而霧化吸入是治療呼吸系統(tǒng)疾病的最佳方式之一。MSC-CM或MSC-Exo中的活化因子通過霧化吸入可直接到達呼吸道和肺泡，借助趨化作用歸巢于受損組織，激活免疫細胞，調(diào)節(jié)機體免疫應(yīng)答。相較于傳統(tǒng)的靜脈途徑和滴鼻給藥等治療方式，霧化吸入能夠使載藥外泌體更準確地到達靶器官，為哮喘、鼻炎、肺炎、IPF、上呼吸道感染、ARDS等提供了一種更加安全、有效、方便的治療方式。美國北卡羅萊納州立大學程柯教授帶領(lǐng)的團隊研究發(fā)現(xiàn)，通過霧化吸入方式輸送肺干細胞分泌物(包括外泌體和其他細胞分泌因子)可修復(fù)小鼠和大鼠因IPF所致的肺損傷[70]。為更快推動這一霧化治療的臨床轉(zhuǎn)化，程柯教授聯(lián)合發(fā)起成立了BreStem Therapeutics 公司，提交了多個針對分泌組和外泌體治療肺部疾病的新藥臨床申請。在應(yīng)用MSC-Exo抑制炎癥因子和增強機體免疫力方面，《間充質(zhì)干細胞外泌體霧化吸入治療新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)的關(guān)鍵技術(shù)研究》項目(ChiCTR2000030261)已在中國臨床試驗注冊中心登記注冊，其治療方式也是通過霧化吸入肺直接接觸病灶，通過分泌多種生長因子改善肺部細胞微環(huán)境，修復(fù)損傷細胞，促進血管新生，提高機體免疫應(yīng)答，減少并發(fā)癥。

研究顯示，細胞外囊泡和其他納米顆粒會在肺毛細血管中積聚，對肺癌等病癥的治療是有益的，但對慢性阻塞性肺疾病或哮喘的治療效果并不理想，如果顆?？ㄔ诿氀芾?，不能從血液中滲出到肺組織，可能看不到很好的治療效果；任何通過細胞外囊泡運載核酸藥物的吸入治療均面臨肺積液的挑戰(zhàn)，肺下層的表面活性劑也會破壞脂質(zhì)體和脂質(zhì)納米顆粒的穩(wěn)定[63，71]。同時，細胞外囊泡或外泌體治療機制的復(fù)雜性也將使科學家們的研究進入下一個瓶頸期，闡明細胞外囊泡或外泌體治療疾病的機制勢必成為巨大的挑戰(zhàn)。

另外，綜合目前外泌體的基礎(chǔ)研究成果發(fā)現(xiàn)，從基礎(chǔ)研究成品到臨床轉(zhuǎn)化還存在很大問題。首先是外泌體如何實現(xiàn)穩(wěn)定的大規(guī)模量產(chǎn)；其次是生產(chǎn)出來的外泌體如何實現(xiàn)快速鑒定和標準化的有效質(zhì)控；再者是外泌體的復(fù)雜成分要通過哪些分析方法進行定性、定量分析。雖然目前已開發(fā)出十余種外泌體的分離提取方法，但由于設(shè)備的局限、昂貴的分離試劑成本、分離純化工藝操作的復(fù)雜性等，均無法實現(xiàn)大規(guī)模批量生產(chǎn)。而對于已經(jīng)小量分離出來的用于科學研究的外泌體，需要做進一步的性能和純度的鑒定和確認，相關(guān)技術(shù)也在不斷涌現(xiàn)，如蛋白質(zhì)組學、納米流式、質(zhì)譜或微陣列等，但尚無金標準來確定科研所使用的外泌體。在整個分離純化的工藝過程中，超速離心力等外力對外泌體擠壓造成外泌體形變，該作用力對外泌體自身功效的影響也需要進一步探討研究；而且，外泌體組成的復(fù)雜性也決定了后期分析驗證方法的開發(fā)和質(zhì)量控制的復(fù)雜性，這些都將成為未來外泌體從基礎(chǔ)研究向臨床轉(zhuǎn)化的熱點和難點。