劉婧，劉燕，趙軍，李亞杰，顧政一

(1.石河子大學(xué)藥學(xué)院，石河子 832000；2.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，烏魯木齊 830004；3.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830011)

大戟脂為大戟科植物多脂大戟(EuphorbiaresiniferaBerg.)的樹脂狀分泌物。原產(chǎn)于摩洛哥中部、歐洲，非洲亦產(chǎn)[1]。大戟脂有兩千年的藥用歷史，自羅馬時(shí)代就被廣泛使用，最早記載于阿維森納所著的《醫(yī)典》之中，是現(xiàn)在仍在使用的一種維吾爾傳統(tǒng)藥材[2]。目前發(fā)現(xiàn)大戟脂中主要含有二萜、三萜、生物堿、黃酮、酚酸等成分，其中萜類化合物含量較多[3-6]。在傳統(tǒng)作用中，大戟脂具有強(qiáng)筋健骨、散寒止痛、燥濕退腫、除白內(nèi)障等功效[7]。本課題組前期專利ZL201710119132.X報(bào)道了大戟脂藥材中大戟二烯醇的制劑及其在治療白內(nèi)障上的應(yīng)用[8]。除此之外，大戟脂在藥理作用上研究相對(duì)薄弱，現(xiàn)有研究主要集中在化學(xué)成分分離方面?；诖耍狙芯客ㄟ^(guò)經(jīng)典的抗炎鎮(zhèn)痛動(dòng)物模型[9-13]，研究了大戟脂有效部位和大戟二烯醇抗炎鎮(zhèn)痛作用，以期為大戟脂藥材的藥效學(xué)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明(KM)種小鼠，無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(新)2018-0001，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(新)2018-0003。動(dòng)物飼養(yǎng)于新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)房，室溫(22±2) ℃，相對(duì)濕度(50±5)%，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，期間自由飲食飲水，喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼料。

1.2藥物及試劑 大戟脂藥材于2018年8月購(gòu)自新疆濟(jì)人藥業(yè)有限公司(批號(hào)：201706001)，經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所何江副研究員鑒定為大戟科植物多脂大戟E.resiniferaBerg的樹脂狀分泌物，使用前粉碎，過(guò)40目(425 μm)篩，備用。

吲哚美辛腸溶片(山西云鵬制藥有限公司，批號(hào)：G190605。使用前去除包衣，用研缽研細(xì))；伊文思藍(lán)(美國(guó) Sigma 公司，批號(hào)：MKBQ3656V)；福爾馬林(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20140502)；注射用氨芐西林鈉(四川顯華動(dòng)物藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20190801)；水合氯醛、甲醛、冰醋酸、二甲苯，石油醚、乙酸乙酯等均為市售分析純。

1.3儀器 DZF-6090型真空干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；GJ-8402型熱板測(cè)痛儀(浙江寧海白石電子醫(yī)藥儀器廠)；80-2型臺(tái)式低速離心機(jī)(中國(guó)江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠)；DSX-30L型手提式高壓蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)；AL204型電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，感量0.1 mg]。

1.4方法

1.4.1樣品的制備 有效部位的制備：取粉碎后的大戟脂藥材140 g，加20倍量的95%乙醇加熱回流提取3次，每次1.5 h，合并提取液，減壓濃縮至浸膏。濕法上柱(硅膠填料量為上樣量的10倍)，干法上樣。依次用石油醚、石油醚：乙酸乙酯=19：1洗脫，收集石油醚：乙酸乙酯=19：1部分的洗脫液，減壓濃縮，真空干燥，即得大戟脂有效部位14.93 g，其中大戟二烯醇含量為47.03%。取有效部位固體適量，研細(xì)，備用，記為“EPE”。

1.4.2大戟二烯醇單體的制備 按“1.4.1”項(xiàng)下方法操作，洗脫液為石油醚：乙酸乙酯=19：1時(shí)，每250毫升接一瓶流份，經(jīng)TLC薄層鑒別后，收集純度較高的部分，記為“Fr1”。取Fr1部分，干法上柱，過(guò)C8減壓柱，用90%甲醇洗脫，經(jīng)TLC薄層鑒別后收集純度較高的部分，甲醇反復(fù)重結(jié)晶，即得大戟二烯醇單體[經(jīng)碳譜(13C-NMR)和氫譜(1H-NMR)鑒別為大戟二烯醇，純度>95%]。取大戟二烯醇單體適量，研細(xì)，備用，記為“E”。

1.4.3分組及給藥方案 取KM小鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，按體質(zhì)量隨機(jī)分為8組，每組10只，分別為模型對(duì)照組(0.5%CMC-Na溶液)、吲哚美辛組(10 mg·kg-1)、大戟脂有效部位(E)小劑量組(15 mg·kg-1)、大戟脂有效部位(E)中劑量組(30 mg·kg-1)、大戟脂有效部位(E)大劑量組(60 mg·kg-1)和大戟二烯醇(EPE)小劑量組(7.5 mg·kg-1)、大戟二烯醇(EPE)中劑量組(15 mg·kg-1)、大戟二烯醇(EPE)大劑量組(30 mg·kg-1)。陽(yáng)性藥吲哚美辛、大戟脂有效部位和大戟二烯醇均用0.5% CMC-Na溶液溶解，超聲后得到混懸液。連續(xù) 4 d灌胃給藥，每天1 次，給藥量按小鼠體質(zhì)量計(jì)算，每1克給藥0.02 mL。

1.4.4小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn) 分組及給藥同“1.4.3”。末次給藥1.5 h后，在每只小鼠右耳廓正反兩面均勻涂抹二甲苯25 μL，左耳不涂為正常耳對(duì)照，30 min后將小鼠處死，用打孔器(6 mm)在靠近雙耳的外耳線處同一位置打下耳片，用電子分析天平稱重，計(jì)算腫脹度及腫脹抑制率。腫脹度=右耳片重量-左耳片重量。腫脹抑制率(%)=(模型對(duì)照組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)/模型對(duì)照組平均腫脹度×100%。

1.4.5毛細(xì)血管通透性實(shí)驗(yàn) 分組及給藥同“1.4.3”。末次給藥1.5 h后，在小鼠尾靜脈注射0.5%依文思藍(lán)溶液0.01 mL·g-1，隨即每只小鼠腹腔注射0.8%冰醋酸溶液0.2 mL，20 min后處死小鼠，將6 mL0.9%氯化鈉溶液注射進(jìn)小鼠腹腔，輕揉洗滌腹腔后收集洗滌液，洗液以3000 r·min-1離心10 min(r=8 mm)，取上清液在波長(zhǎng)590 nm處測(cè)定吸光度(A)值，計(jì)算滲出抑制率。抑制率(%)=(模型對(duì)照組平均A值-給藥組平均A值)/模型對(duì)照組平均A值×100%。

1.4.6棉球肉芽腫實(shí)驗(yàn) 經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)得到麻醉劑量為5%水合氯醛0.006 mL·g-1。取KM小鼠85只，腹腔注射麻醉小鼠，仰臥位固定，將小鼠左右腹股溝處剃毛后消毒，在腹股溝處分別剪開皮膚小口并植入大小和形狀相同的棉球(質(zhì)量為5 mg，棉球經(jīng)高溫高壓滅菌后打入濃度為10 g·L-1的注射用氨芐西林30 μL，烘干)，縫合皮膚后消毒。第二天取植入棉球后蘇醒的小鼠80只，按“1.4.3”項(xiàng)分組及給藥。連續(xù)7 d灌胃給藥，每天1次。第7天給藥1.5 h后，處死小鼠，取出棉球，剔除脂肪組織，于60 ℃下烘干24 h。將棉球稱質(zhì)量，計(jì)算肉芽組織干重及肉芽腫抑制率。肉芽組織干質(zhì)量=棉球肉芽干質(zhì)量-棉球原質(zhì)量；肉芽腫脹抑制率(%)=(模型對(duì)照組肉芽腫平均質(zhì)量-給藥組肉芽腫平均質(zhì)量)/模型對(duì)照組肉芽腫平均質(zhì)量×100% 。

1.4.7扭體實(shí)驗(yàn) 分組及給藥同“1.4.3”項(xiàng)。末次給藥1.5 h后腹腔注射0.8%醋酸溶液0.2 mL，觀察并記錄小鼠的反應(yīng)潛伏期和小鼠在15 min內(nèi)的扭體次數(shù)，計(jì)算抑制率。抑制率(%)=(模型對(duì)照組平均扭體次數(shù)-給藥組平均扭體次數(shù))/模型對(duì)照組平均扭體次數(shù)×100%。

1.4.8熱板實(shí)驗(yàn) 將熱板測(cè)痛儀溫度調(diào)節(jié)在(55±0.5) ℃，取100只雌性KM小鼠置于熱板上，痛閾值在5～30 s內(nèi)為合格小鼠(測(cè)兩次取平均值)。取合格雌性小鼠80只，分組及給藥同“1.4.3”項(xiàng)。分別于末次給藥后60，120 min 測(cè)小鼠痛閾值(測(cè)兩次取平均值)，計(jì)算痛閾提高百分率。痛閾提高百分率(%)=(給藥后痛閾值-給藥前痛閾值)/給藥前痛閾值×100%。

1.4.9福爾馬林致痛實(shí)驗(yàn) 分組及給藥同“1.4.3”項(xiàng)。末次給藥1.5 h后，在小鼠右后足皮下注射1.0%甲醛30 μL，立即將小鼠置于透明容器內(nèi)，觀察并記錄小鼠在 Ⅰ 相反應(yīng)(0～5 min)和 Ⅱ 相反應(yīng)(15～30 min)的舔、咬足時(shí)間，以每一相的累計(jì)時(shí)間作為動(dòng)物疼痛反應(yīng)強(qiáng)度的指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與模型對(duì)照組比較，吲哚美辛組(10 mg·kg-1)和E大劑量組(30 mg·kg-1)能明顯抑制二甲苯引起的小鼠耳腫脹(P<0.01)，E中劑量組(15 mg·kg-1)對(duì)二甲苯引起的小鼠耳腫脹的抑制作用具有顯著性(P<0.05)。EPE和E抑制作用與劑量呈正相關(guān)。E大劑量組(30 mg·kg-1)抑制率為23.41%，其值小于經(jīng)典抗炎藥吲哚美辛(抑制率為36.79%)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明EPE和E具有一定的抗炎作用，但其作用小于陽(yáng)性藥吲哚美辛。見表1。

表1 EPE和E對(duì)小鼠耳腫脹的影響

2.2毛細(xì)血管通透性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與模型對(duì)照組比較，吲哚美辛組(10 mg·kg-1)、EPE大劑量組(60 mg·kg-1)和E大劑量組(30 mg·kg-1)對(duì)醋酸致小鼠毛細(xì)血管通透性升高具有顯著的抑制作用(P<0.01，P<0.05)，抑制率與劑量有關(guān)。EPE和E大劑量組的抑制率分別為20.01%、21.48%，二者抑制率小于陽(yáng)性組藥吲哚美辛(抑制率為29.34%)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明EPE和E均具有抗炎作用，但其抗炎作用小于陽(yáng)性藥吲哚美辛。見表2。

表2 EPE和E對(duì)小鼠毛細(xì)血管通透性的影響

2.3棉球肉芽腫實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與模型對(duì)照組比較，吲哚美辛組(10 mg·kg-1)、EPE大劑量組(60 mg·kg-1)和E大劑量組(30 mg·kg-1)對(duì)抑制小鼠棉球肉芽腫的質(zhì)量具有極顯著性(P<0.01)，E中劑量組(15 mg·kg-1)也可使小鼠棉球肉芽腫質(zhì)量顯著下降(P<0.05)，其中吲哚美辛組的抑制率為43.19%，給藥組的抑制率均小于吲哚美辛組的抑制率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明EPE和E均具有抗炎作用，但其作用弱于吲哚美辛。見表3。

2.4扭體實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與模型對(duì)照組比較，吲哚美辛組(10 mg·kg-1)顯著延長(zhǎng)了小鼠扭體的潛伏期，并顯著降低了小鼠扭體次數(shù)(P<0.01)，EPE大劑量組(60 mg·kg-1)和E大劑量組(30 mg·kg-1)能明顯減少小鼠的扭體次數(shù)(P<0.05，P<0.01)，說(shuō)明EPE和E具有一定的鎮(zhèn)痛作用。見表4。

2.5熱板實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與模型對(duì)照組比較，給藥60 min后，吲哚美辛組(10 mg·kg-1)、EPE大劑量組(60 mg·kg-1)和E中、大劑量組(30、60 mg·kg-1)對(duì)痛閾值的抑制具有極顯著性(P<0.01)，且E大劑量組的痛閾值抑制率與吲哚美辛相當(dāng)。EPE中劑量組(30 mg·kg-1)的平均痛閾值亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。給藥120 min后，EPE大劑量組(60 mg·kg-1)和E大劑量組(30 mg·kg-1)對(duì)痛閾值的抑制作用仍具有顯著性差異(P<0.05)，且閾值提高百分率均大于吲哚美辛。結(jié)果說(shuō)明給藥60 min和120 min后，大戟脂EPE和E對(duì)小鼠熱板模型具有良好鎮(zhèn)痛作用。見表5。

表3 EPE和E對(duì)小鼠肉芽腫的影響

表4 EPE和 E對(duì)小鼠扭體反應(yīng)的影響

2.6福爾馬林致痛實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與模型對(duì)照組比較，吲哚美辛組(10 mg·kg-1)能明顯減少福爾馬林引起的小鼠 Ⅰ 相和 Ⅱ 相疼痛反應(yīng)(P<0.05，P<0.01)，且抑制 Ⅱ 相疼痛反應(yīng)的效果優(yōu)于 Ⅰ 相；EPE大劑量組(60 mg·kg-1)和E小劑量組(7.5 mg·kg-1)對(duì)縮短小鼠 Ⅰ 相舔、咬足時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，E中、大劑量組(15、30 mg·kg-1)能極顯著的縮短小鼠 Ⅰ 相舔、咬足時(shí)間(P<0.05，P<0.001)。但EPE和E對(duì)抑制 Ⅱ 相疼痛反應(yīng)效果不顯著，顯示出大戟脂EPE和E具有較好的 Ⅰ 相鎮(zhèn)痛作用，能明顯減輕福爾馬林引起的 Ⅰ 相疼痛，但對(duì) Ⅱ 相疼痛的鎮(zhèn)痛效果不明顯，提示其作用機(jī)制可能為中樞鎮(zhèn)痛。見表6。

表5 EPE和E對(duì)小鼠熱板模型痛閾值的影響

表6 EPE和E對(duì)福爾馬林致痛的影響

3 討論

通過(guò)二甲苯致小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)和小鼠毛細(xì)血管通透性實(shí)驗(yàn)研究了大戟脂有效部位和大戟二烯醇對(duì)急性炎癥的影響，采用小鼠棉球肉芽腫實(shí)驗(yàn)研究了大戟脂有效部位和大戟二烯醇對(duì)慢性炎癥的影響[9]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大戟脂有效部位和大戟二烯醇可顯著減小二甲苯所致的小鼠耳腫脹度，降低醋酸導(dǎo)致的小鼠毛細(xì)血管通透性，并能顯著抑制小鼠棉球肉芽腫的增生，表明大戟脂具有良好的抗炎作用，但其抗炎作用弱于陽(yáng)性藥吲哚美辛。

扭體實(shí)驗(yàn)是研究鎮(zhèn)痛藥的經(jīng)典方法，熱板實(shí)驗(yàn)是篩選中樞鎮(zhèn)痛藥的常用手段[10]。根據(jù)扭體實(shí)驗(yàn)結(jié)果，2個(gè)藥物的大劑量組可明顯減少醋酸導(dǎo)致的小鼠扭體次數(shù)，延長(zhǎng)小鼠對(duì)熱刺激產(chǎn)生疼痛的時(shí)間。熱板實(shí)驗(yàn)顯示，給藥后60 min，大戟脂有效部位中、大劑量組和大戟二烯醇中、大劑量組對(duì)降低小鼠熱板痛閾值具有顯著性差異，且給藥后120 min，大戟脂有效部位大劑量組和大戟二烯醇大劑量組仍具有鎮(zhèn)痛作用。福爾馬林致痛模型的Ⅰ相反應(yīng)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起的疼痛，Ⅱ相反應(yīng)為外周神經(jīng)系統(tǒng)引起的疼痛，由此可初步推測(cè)藥物發(fā)揮鎮(zhèn)痛效果的作用機(jī)制。由福爾馬林致痛實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，大戟脂有效部位大劑量組和大戟二烯醇低、中、大劑量組均能明顯減輕福爾馬林實(shí)驗(yàn)的Ⅰ相疼痛反應(yīng)，表明大戟脂具有良好的Ⅰ相鎮(zhèn)痛作用，提示其鎮(zhèn)痛作用機(jī)制可能在中樞。

綜上所述，通過(guò)經(jīng)典的抗炎鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)顯示出大戟脂有效部位和大戟二烯醇具有良好的抗炎鎮(zhèn)痛作用，且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，其中以大戟二烯醇大劑量組效果最好。目前關(guān)于大戟脂的藥效學(xué)研究相對(duì)薄弱，本實(shí)驗(yàn)也并未對(duì)其確切的抗炎鎮(zhèn)痛機(jī)制進(jìn)行深入研究，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步對(duì)大戟脂的藥理作用進(jìn)行探索，開發(fā)其藥用價(jià)值。