周子馨，蘭海燕

(新疆大學 生命科學與技術學院 新疆生物資源基因工程重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830017)

0 引言

鈣離子作為植物信號轉(zhuǎn)導途徑中的第二信使，其游離態(tài)幾乎參與植物的所有生長發(fā)育過程[1].而作為鈣離子信號響應元件的CDPK是一類鈣依賴的蛋白激酶，它通過磷酸化作用將信號傳遞給下游組分并引起相關基因的表達，在植物生長發(fā)育以及多種脅迫響應過程中發(fā)揮積極作用[2].CDPK信號途徑與逆境應答密切相關，目前對CDPK基因和蛋白的研究較為深入，但對其互作組分及功能的研究比較有限.本文基于前人的相關研究進展，對植物CDPK信號途徑及其互作組分的生物學功能進行綜述，以期為相關研究提供借鑒.

1 CDPK信號轉(zhuǎn)導途徑

1.1 CDPK是重要的Ca2+感受器

植物細胞中的多種信號轉(zhuǎn)導途徑均依賴信號分子進行信息交流，包括鈣離子、脂質(zhì)小分子、cAMP（cyclic adenosine monophosphate）、cGMP（cyclic guanosine monophosphate）等，其中游離的鈣離子作用范圍最廣[3].Williamson和Ashley[4]對海藻細胞內(nèi)鈣信號的研究首次發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)游離的Ca2+可能對細胞功能的調(diào)節(jié)具有重要作用.植物細胞內(nèi)的鈣離子濃度受到多種鈣結合蛋白的調(diào)控，如鈣調(diào)素（Calmodulin，CaM）、類鈣調(diào)神經(jīng)素B亞基蛋白（Calcineurin B-like Proteins，CBLs）、CDPKs等[5].CaM是最典型的鈣結合蛋白，它作為鈣信號的“應答感受器”能迅速響應胞質(zhì)中鈣離子濃度變化，并維持胞內(nèi)鈣離子的穩(wěn)態(tài)[6].CaM和CBL以無激酶活性的形式存在，只在結合Ca2+后被激活進而與靶蛋白相互作用并使其磷酸化，從而調(diào)控植物生長發(fā)育或響應逆境脅迫[7?8].CBL能與其特定的作用底物CIPKs（CBL-interacting protein kinases）形成CBL-CIPKs信號系統(tǒng)，在Ca2+信號轉(zhuǎn)導通路中發(fā)揮重要作用[8].

CDPKs是最具特點的新型Ca2+傳感器，同時具有Ca2+結合活性和激酶活性[5]，能夠直接結合胞質(zhì)中的Ca2+，將鈣信號轉(zhuǎn)化為磷酸化反應[5,9].外源添加Ca2+時，擬南芥AtCPK12能夠磷酸化轉(zhuǎn)錄因子ABF1（ABA-responsive element-binding factor 1）、ABF4以及蛋白磷酸酶2C（PP2C），而無外源Ca2+時則不發(fā)生磷酸化作用[10].CDPK信號通路在植物生長發(fā)育過程中參與多種細胞活動，包括初級代謝、次級代謝、應激反應、離子和水的運輸以及轉(zhuǎn)錄和信號轉(zhuǎn)導等過程[11]，但不同CDPK具有不同的內(nèi)源底物，因而在信號傳遞過程中發(fā)揮不同的生物學功能.

1.2 CDPK通過磷酸化傳遞信號

在外界信號刺激下，植物胞質(zhì)游離Ca2+濃度變化激活CDPKs，將鈣信號級聯(lián)放大并作用于下游組分，經(jīng)磷酸化或自磷酸化作用使植物產(chǎn)生各種生理響應[12].大量實驗證明CDPK的N端可變區(qū)存在許多自磷酸化位點[13]，對其在細胞內(nèi)的定位、底物特異性結合以及蛋白質(zhì)之間的相互作用有重要影響[14].煙草NtCDPK1的N端可變區(qū)6Ser和21Thr的自磷酸化可降低其結合并進一步磷酸化底物RSG（repression of shoot growth）的能力[15].CDPKs的自磷酸化除了作用于Ser/Thr殘基，也存在于酪氨酸殘基上.在大豆GmCDPKβ中首次發(fā)現(xiàn)24Tyr的自磷酸化降低了該蛋白激酶的活性[16].CDPKs的非自磷酸化作用更為普遍，AtCPK12通過磷酸化轉(zhuǎn)錄因子ABI2進而調(diào)控下游組分[10].Lee等發(fā)現(xiàn)NtCDPK1在體內(nèi)磷酸化26S蛋白酶體的調(diào)節(jié)亞基NtRpn3，從而響應激素信號并共同參與細胞分裂、分化及凋亡等過程[17].此外，CDPKs還受到上游激酶的調(diào)控，AtCPK11在體外能夠磷酸化AtCPK24，因此，推斷AtCPK11/24可能與MAPKs（mitogen-activated protein kinase）一樣在磷酸化級聯(lián)反應中發(fā)揮作用[18]，類似的還有NtCDPK2/3[19].

1.3 CDPK廣泛參與脅迫信號網(wǎng)絡

生物和非生物脅迫以及一些胞內(nèi)刺激會引起胞質(zhì)Ca2+水平升高，當Ca2+傳感器識別鈣信號后進一步作用于下游互作蛋白，進而引起一系列生理響應（見圖1）[20].Ca2+傳感器（CDPKs）能夠直接或間接地調(diào)控下游重要的靶蛋白，如離子通道、轉(zhuǎn)運蛋白、轉(zhuǎn)錄因子或一些其他信號通路相關的蛋白質(zhì)[21].在擬南芥中，AtCPK4/11作為ABA信號途徑的負調(diào)控因子發(fā)揮功能，參與種子萌發(fā)、幼苗生長、氣孔運動和鹽脅迫耐受等過程[22].過表達水稻OsCDPK7/13/21后，轉(zhuǎn)基因植株對鹽、旱、冷脅迫的耐受性增強[23?25].除了目前研究較為深入的擬南芥、水稻等植物外，近期通過植物基因組學分析發(fā)現(xiàn)，大部分黃麻（Chorchorus capsularis）CDPKs在鹽、旱脅迫下表達量顯著增加，表明CDPKs在植物應對不利環(huán)境的過程中發(fā)揮重要作用[26].通常多種信號途徑之間存在交叉作用，例如一些保衛(wèi)細胞信號轉(zhuǎn)導蛋白既是CDPKs的底物，又能作為SnRK2（SNF1-related kinases 2）的底物，這些轉(zhuǎn)導蛋白包括KAT1（Arabidopsis inward rectifier K+channel 1）、SLAC1（slowly activating anion channel）、RBOHs（respiratory burst oxidase homolog）、ABFs等，可能二者作用位點不同[27].CDPKs和MAPK兩種信號通路間也可能存在交互作用，當植物受到刺激后，通常CDPKs和MAPKs均能被激活.例如，當番茄(Lycopersicon esculentum)受傷時，CDPKs和MAPKs能在不同位點磷酸化番茄LeACS2（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase），其結果對維持該蛋白的穩(wěn)定是必需的[28].CDPKs與其他信號途徑協(xié)同作用為植物應對外界脅迫和調(diào)節(jié)自身免疫等方面提供了更多的可能.

圖1 植物細胞中的Ca2+信號調(diào)控網(wǎng)絡（該圖引自參考文獻[20]，稍作修改）Fig 1 Ca2+ signal regulatory network in plants

2 CDPKs的結構、分類及表達與定位

2.1 CDPKs的結構

典型的CDPK蛋白結構主要由四部分組成，包括N端可變區(qū)、Ser/Thr激酶域、自抑制域（連接域）以及類鈣調(diào)素結合域（見圖2A）[2,5,29].其中，N端可變區(qū)的結構域長度變化較大，同源性不高，但對底物的識別起作用，該結構對CDPKs的亞細胞定位及調(diào)控植物生長發(fā)育十分重要[5].激酶域具有典型的Ser/Thr蛋白激酶的保守催化序列，在不同物種間同源性較高，替換催化中心附近的氨基酸通常會降低激酶活性，且可能影響對底物的特異性結合[30].自抑制域具有高度保守性，大多由20～30個氨基酸殘基組成.類鈣調(diào)素結合域作為Ca2+感受器，通常具有四個EF手型，分為N端和C端兩部分，C端的鈣親和力高于N端[5,31].在Ca2+濃度較低的靜息狀態(tài)下，C端能夠結合鈣離子，并與自抑制域相互作用穩(wěn)定蛋白構象.與此同時，自抑制域上的假底物與激酶域上的活性位點結合阻止進一步識別底物[32?33].當Ca2+濃度升高時，鈣調(diào)素結構域N端也與鈣離子結合，并與自抑制域相互作用，通過蛋白構象變化使得自抑制域脫離，釋放出激酶域的活性位點[30].此時，鈣調(diào)素C端與N端可變區(qū)和激酶域的N端結合，鈣調(diào)素N端靠近激酶域的C端（見圖2B）[29].

圖2 植物CDPKs的結構（A）和激活機制（B）（該圖引自參考文獻[29]，稍作修改）Fig 2 Structures (A) and activation mechanism(B) of plant CDPKs

2.2 CDPKs的分類

CDPKs是多基因編碼的蛋白家族，迄今為止，在高等植物、原生動物、卵菌和綠藻中均發(fā)現(xiàn)該蛋白，但是在動物和真菌中尚未報道[34].隨著植物基因組的測序以及對CDPKs的研究不斷深入，不同植物中的CDPK家族成員組成逐漸被揭示，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）[35]有34個CDPKs成員，水稻（Oryza sativa）[36]有31個，小麥（Triticum aestivum）[37]有20個，在煙草（Nicotiana tabacum）[38]、玉米（Zea mays）[39]、番茄（Solanum lycopersicum）[40]等植物中也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)CDPKs.在高等植物中CDPKs分為四個主要的進化家族(I-IV)，對擬南芥CDPKs基因家族的34個成員進行進化分析發(fā)現(xiàn)，第IV家族最早形成一個單獨的進化枝，第III組與第I、II 組又分別形成一個進化枝，而I組和II組之間的進化關系最近（見圖3），這與Valmonte等[34]得出的結論一致.值得注意的是，Zhu等[22]發(fā)現(xiàn)第I家族中AtCPK4和AtCPK11兩個基因同源性很高，具有功能冗余現(xiàn)象.

圖3 擬南芥CDPKs基因家族的進化分析Fig 3 Phylogenetic analysis of CDPKs gene family in Arabidopsis thaliana

2.3 CDPKs基因的表達模式

CDPKs在細胞、組織、器官中具有多種表達模式，可能參與特定的信號途徑.例如，AtCPK17/34只能在花粉中表達，參與調(diào)控花粉管的生長[41?42]，而AtCPK3/6在保衛(wèi)細胞中顯著表達，參與調(diào)控氣孔運動[43].馬鈴薯StCDPK1受發(fā)育過程的調(diào)控，在形成塊莖時表達[44].CDPKs在種子形成和萌發(fā)過程中也發(fā)揮重要作用，檀香木CDPKs參與胚胎發(fā)育和種子萌發(fā)過程[45]，而過表達水稻OsCDPK2后會抑制種子形成，導致發(fā)育提前終止[46].擬南芥AtCPK12在根、莖、葉等多種組織中均表達，但在干種子中則不表達[10].AtCPK10在根、莖、葉、花和角果等組織或器官中表達[47].CDPKs的時空表達差異表明其可能參與植物的不同生長發(fā)育過程，在復雜的細胞調(diào)控網(wǎng)絡中發(fā)揮功能.

2.4 CDPKs蛋白定位與功能的關系

亞細胞定位對于CDPKs識別底物和確定作用范圍十分重要.CDPKs分布廣泛，包括胞質(zhì)、細胞核、質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、過氧化物酶體、脂質(zhì)體等[7,48].其中大部分定位于質(zhì)膜、液泡膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等部位，這種膜定位是由N端可變域的豆蔻酰化位點（在N端第2位的甘氨酸殘基）和棕櫚?；稽c（在N端第4/5位的半胱氨酸殘基）的酰化作用介導的[5].煙草NtCDPK5定位于細胞膜，當單突變豆蔻酰化、棕櫚酰化位點或兩個位點雙突變后，導致膜定位功能喪失[49].水稻OsCPK18的N端豆蔻?；稽c突變后，膜定位效應喪失[50].AtCPK9蛋白定位于質(zhì)膜，當豆蔻?；稽c（在N端第2位的甘氨酸殘基）突變?yōu)楸彼岷?，該蛋白定位于細胞質(zhì)中，同樣也說明豆蔻?；稽c對膜定位的重要性[51].N端豆蔻酰化作用由翻譯后修飾完成并維持蛋白的膜定位，而半胱氨酸殘基上的棕櫚?；目赡嫘詾榈鞍踪|(zhì)在細胞膜和胞質(zhì)或細胞核之間穿梭提供了可能[7,19].AtCPK6通過作用于SLAC1調(diào)節(jié)各種刺激下的氣孔運動，當豆蔻?；妥貦磅；稽c發(fā)生突變后，其穩(wěn)定的膜定位消失，同時喪失對SLAC1的調(diào)節(jié)功能，表明AtCPK6的膜定位對其調(diào)控SLAC1是必需的[52].Kobayashi等[53]發(fā)現(xiàn)馬鈴薯StCDPK5定位于質(zhì)膜，其N端發(fā)生磷酸化作用后激活底物StRBOHB，但突變其N端的豆蔻?；妥貦磅；稽c后，StCDPK5喪失質(zhì)膜定位和體內(nèi)激活StRBOHB的能力[54]，以上研究表明，CDPK的N端?；饔脤ζ淠ざㄎ患靶惺构δ苁种匾?

3 CDPKs的互作組分及功能

3.1 CDPKs的互作組分

3.1.1 CDPKs對底物的特異性識別

CDPKs對底物特異性識別受到激酶活性位點和底物磷酸化位點周圍氨基酸序列相互影響[55].煙草NtCDPK1能夠負調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子RSG，參與赤霉素的反饋調(diào)節(jié).將其N端可變區(qū)的氨基酸突變（10R-A）后，雖仍具有激酶活性，但結合RSG的能力和磷酸化作用均降低[56].此外，有研究表明自磷酸化作用可以防止底物過度磷酸化，改變CDPKs對底物的偏好.NtCDPK1的自磷酸化作用（6S和21T）降低其對RSG的親合力，同時降低了磷酸化效率[15].結構域刪除和交換實驗表明，N端可變結構域在底物特異性識別過程中具有至關重要的作用[56].替換NtCDPK1和AtCPK9（二者同源性較高）的N端可變域，發(fā)現(xiàn)NtCDPK1的N端可變域賦予AtCPK9結合RSG的能力和激酶活性[56].煙草NtCDPK2和NtCDPK3結構域交換實驗也證實，磷酸化作用僅由各自的N端可變結構域決定[19].值得注意的是，一些CDPKs及底物在細胞的不同環(huán)境下可能發(fā)揮不同的生理功能.比如AtCPK21/AtCPK23能夠激活保衛(wèi)細胞離子通道蛋白SLAC1/SLAH3從而促進氣孔關閉[57?58]，但cpk21/cpk23突變體植株也表現(xiàn)出較強的干旱耐受性[59?60].CDPKs的內(nèi)源底物種類眾多，包括轉(zhuǎn)錄因子、熱激蛋白、通道蛋白以及多種酶類，底物的多樣性決定了功能的多樣性，這些底物在基因表達、酶代謝、離子和水分的跨膜運輸、細胞骨架的動態(tài)變化等方面均發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[35]，因而CDPKs在植物生長發(fā)育以及脅迫響應等過程中具有重要的生理功能（見表1）.

表1 高等植物中部分CDPKs的作用底物及功能Tab 1 Substrates of some CDPKs and its functions in higher plants

3.1.2 互作的實質(zhì)及生物學意義

CDPKs通過磷酸化調(diào)節(jié)不同底物蛋白的活性，進而調(diào)控基因表達、維持離子平衡和ROS穩(wěn)態(tài)[74].磷酸化是一種普遍的翻譯后修飾，其可直接或間接激活胞質(zhì)內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)位進入細胞核發(fā)揮作用[55].BZR1（brassinazole resistant1）是BR（brassinolide）信號轉(zhuǎn)導途徑中重要的轉(zhuǎn)錄因子，其定位與磷酸化狀態(tài)緊密相關.GSK3-like蛋白激酶（glycogen synthase kinase-3-like kinase）BIN2通過調(diào)節(jié)BZR1與14-3-3蛋白的相互作用，誘導BZR1從細胞核進入細胞質(zhì)，且隨后保留在細胞質(zhì)中，這一過程受BIN2磷酸化的直接調(diào)節(jié)[75].BR處理或BZR1的磷酸化位點和14-3-3蛋白的識別位點發(fā)生突變后促使BZR1轉(zhuǎn)位至細胞核，進而調(diào)控下游BR響應基因的表達[75].煙草NtCDPK1磷酸化轉(zhuǎn)錄因子RSG第114位絲氨酸，促進14-3-3蛋白結合RSG[76]，這種相互作用負調(diào)控RSG，將其限制在細胞質(zhì)而不能進入細胞核調(diào)控靶基因.當NtCDPK1表達被抑制后，其磷酸化作用以及從細胞核到細胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位均受到影響[77?78].AtCPK32能夠在體外磷酸化ABF4，其磷酸化位點（110S）對二者之間的相互作用是必需的，過表達AtCPK32能通過影響ABF4進而調(diào)控ABA響應基因的表達[63].灰綠藜CgCDPK與轉(zhuǎn)錄因子CgbHLH001能在細胞膜上發(fā)生相互作用，且體外條件下前者使后者發(fā)生磷酸化，當CgbHLH001上預測的磷酸化位點（96S）發(fā)生突變后二者相互作用消失，推測CgCDPK可能通過對CgbHLH001的磷酸化促使其轉(zhuǎn)位到細胞核，從而調(diào)控下游基因的表達[67?68].以上研究表明，CDPKs的磷酸化對其相互作用及發(fā)揮生物學功能具有重要意義，因此深入研究CDPKs底物的特異性及互作的分子機制對于闡明CDPK信號途徑十分必要.

3.2 互作組分的生物學功能

3.2.1 參與非生物脅迫的響應

CDPKs在響應鹽、旱、冷等非生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用，常涉及ABA信號途徑以及ROS清除等過程[36].ABA作為植物中的主要激素之一，廣泛參與植物生長發(fā)育及各種脅迫響應過程.植物細胞在不利環(huán)境下ABA含量增多，促使植物感知并應對外界刺激.干旱脅迫下ABA依賴的氣孔關閉是防止水分損失的重要機制，許多CDPKs參與調(diào)節(jié)氣孔運動.AtCPK10與HSP1相互作用，參與ABA/Ca2+信號對氣孔保衛(wèi)細胞內(nèi)向整流型K+通道的調(diào)控[47].AtCPK8通過AtCAT3抑制保衛(wèi)細胞的內(nèi)向整流型K+通道而參與ABA/Ca2+調(diào)控的氣孔關閉作用[73].AtCPK13通過調(diào)節(jié)保衛(wèi)細胞通道蛋白KAT1和KAT2的表達減小氣孔開度[79].過表達AtCPK32后植株對ABA信號更加敏感，導致種子萌發(fā)率降低[63].當植物受到脅迫后會誘導ROS產(chǎn)生，低濃度的ROS能夠作為信號分子介導多種反應，而過量的ROS則會對細胞造成氧化損傷.NADPH氧化酶廣泛參與ABA誘導的ROS產(chǎn)生和ABA誘導的氣孔關閉[48].馬鈴薯StCDPK4/5通過磷酸化NADPH氧化酶促進ROS的產(chǎn)生[80]，擬南芥AtCPK5/6以及AtCPK4/11也具有類似的功能[81].油菜BnaCPK2與NADPH氧化酶RbohD相互作用，共同參與ROS產(chǎn)生并調(diào)控細胞死亡過程，過表達BnaCPK2導致ROS過量積累和細胞死亡[82].在擬南芥中過表達AtCPK1后導致NADPH氧化酶Rboh的活性升高[83]，其轉(zhuǎn)基因株系對鹽、旱脅迫的耐受性增強[84]，并通過對底物ORE1（oresara1，衰老的主要調(diào)控因子）的直接磷酸化作用調(diào)控細胞死亡[85].

3.2.2 參與生物脅迫的響應

植物除了應對多種非生物脅迫，還要防御病蟲害等生物脅迫侵害.大量研究表明，在各種植物/病原體互作系統(tǒng)中胞質(zhì)Ca2+流入是病原菌誘導信號轉(zhuǎn)導途徑的關鍵早期步驟.植物對病原體的響應通常受病原體編碼的激發(fā)子（如枝孢霉Avr9）和植物編碼的受體（如番茄Cf-9抗性蛋白）之間的相互識別所激活.Romeis等[38,86]在Cf-9轉(zhuǎn)基因煙草中發(fā)現(xiàn)，當Cf-9與Avr9互作后激活了CDPK的表達，并作為抗原誘導反應中重要的鈣傳感器發(fā)揮功能.將CDPK基因沉默后發(fā)現(xiàn)植物喪失Cf-Avr誘導的特異性超敏反應，表明CDPK對于介導Cf-9/Avr9誘導的植物防御體系不可或缺[38].AtCPK5/6還通過調(diào)控乙烯生物合成酶ACS基因的表達來調(diào)節(jié)乙烯的產(chǎn)生，從而應對灰霉病感染[87?88].在擬南芥葉細胞中，細菌激發(fā)子flg22（a 22 amino acid peptide of flagellin）能夠瞬時激活多個CDPKs的活性，如AtCPK4、AtCPK5、AtCPK6 和AtCPK11，它們可作為早期轉(zhuǎn)錄過程的信號調(diào)節(jié)器[81].突變其中某些基因后（如cpk5 cpk6雙突變體；cpk5 cpk6 cpk11三突變體；cpk4 cpk5 cpk6 cpk11四突變體），早期ROS產(chǎn)生減少，表明這4個基因共同調(diào)控flg22介導的ROS損傷及對病原菌的防御，提示CDPKs在PAMP（pathogenassociated molecular patterns）信號途徑中起重要作用[81].對17個擬南芥CPK單突變體進行遺傳篩選發(fā)現(xiàn)，cpk3和cpk13突變體中草食動物誘導的植物防御素基因PDF1.2的表達量顯著降低；CPK3/13在體外能夠磷酸化轉(zhuǎn)錄因子HSFB2a，且在煙草葉片中瞬時表達后能進一步激活PDF1.2的表達[65].不僅如此，AtCPK3還參與多種防御途徑，是植物響應真菌及其他病害的必需組分[89]，如激活狀態(tài)下的AtCPK3通過磷酸化Rem1.3（Remorins）上的74S/86T/91S位點抑制病毒PVX（potato virus X）的細胞增殖[90].

4 展望

CDPKs作為植物中重要的蛋白激酶，在識別Ca2+信號后通過對底物的磷酸化參與多種信號途徑的調(diào)節(jié)，從而發(fā)揮重要的生物學功能.本文從CDPKs對Ca2+信號的敏感性、結構和分類、表達模式和亞細胞定位以及互作蛋白的功能等不同方面，綜述了CDPKs通過蛋白磷酸化傳遞Ca2+信號從而調(diào)控植物細胞代謝并響應環(huán)境脅迫的機制.盡管很多CDPKs在體外能磷酸化各種蛋白底物，但CDPKs磷酸化作用的具體機制，包括CDPKs與其底物相互作用的實質(zhì)及生物學意義、磷酸化與信號轉(zhuǎn)導的相關性等方面還有待深入探索.鑒定植物CDPKs的內(nèi)源底物并分析其特異的調(diào)控功能將為研究CDPKs信號途徑的作用機制提供新的證據(jù)，并為改良農(nóng)作物奠定科學理論基礎.