川芎嗪對膿毒癥小鼠肝組織鐵調(diào)素的表達(dá)調(diào)控及機制研究

張益維 王玨 朱浩 黃長順 楊秋紅

膿毒癥是由于感染或創(chuàng)傷引起的全身進行性免疫炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重威脅患者生命[1-2]。膿毒癥所導(dǎo)致的全身炎癥因子分泌對肝功能影響較為嚴(yán)重，使得肝臟分泌鐵調(diào)素，從而出現(xiàn)鐵負(fù)荷，加重炎癥反應(yīng)[3-4]。臨床上關(guān)于膿毒癥治療的藥物種類繁多，且不同藥物的有效性和安全性評價仍存在爭議。近年來，有動物試驗將川芎嗪應(yīng)用于膿毒癥抗炎治療，取得一定成果。川芎嗪已被證實具有調(diào)節(jié)免疫、抵抗炎癥、清除氧自由基等功能[5]，常被用于閉塞性腦血管疾病的治療，但其在膿毒癥小鼠中的抗炎作用及與調(diào)控鐵調(diào)素表達(dá)之間的關(guān)系尚不清楚。因此，筆者采用腸穿孔手術(shù)（CLP）制備膿毒癥小鼠模型，并采用鹽酸川芎嗪和鐵調(diào)素抑制劑進行治療，探索川芎嗪對膿毒癥小鼠鐵調(diào)素表達(dá)的調(diào)控機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 雄性8周齡野生型C57BL/6J小鼠44只[上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，許可證號：SCXK（滬）2017-0005，合格證號：20170005013227]，體重19～22 g。高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；超聲波細(xì)胞破碎儀[冠森生物科技（上海）有限公司，型號LCD150N]；鹽酸川芎嗪注射液（河南福森藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字：H20056061，10 ml∶40 mg）；鐵調(diào)素抑制劑（DS28120313）（中國 MCE 公司，批號：HY-107980）；ELISA試劑盒（中國聯(lián)科生物）；磷酸化JAK（p-JAK）試劑（美國 CST 公司，批號：3230s），磷酸化 STAT（p-STAT）試劑（英國 Abcam 公司，批號：ab68153）。本研究經(jīng)寧波市第一醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 分組 按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、CLP組、CLP+鐵調(diào)素抑制劑組和CLP+川芎嗪組，每組各11只。

1.2.2 模型制備 各組小鼠術(shù)前12 h禁食、禁水，采用4%水合氯醛麻醉后于腹中線處切開1 cm左右，游離盲腸并進行末端結(jié)扎，用16號針在盲腸末端0.5 cm處穿刺并擠出少許糞便后縫合。假手術(shù)組小鼠只開腹不結(jié)扎盲腸。

1.2.3 模型評價[6]術(shù)后12 h取1只CLP小鼠測定血液載菌量和腹腔液載菌量進行模型評價。血液載菌量：在麻醉條件下取眼眶血0.2 ml，EDTA抗凝處理后取50 μl加入0.9%氯化鈉注射液中進行倍比稀釋10、100、1 000倍（50 μl血液加入 0.9%氯化鈉注射液中進行10倍比稀釋至500 μl，再取其中50 μl進行10倍比稀釋至500 μl，再取其中50 μl進行10倍比稀釋至500 μl），分別取1 ml均勻涂在兩個胰蛋白酶血平皿上；將平皿置于37℃恒溫培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，12 h后計算平板上菌落數(shù)。每毫升血液中載菌量=同一稀釋度兩個血平皿上菌落的平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×10。腹腔液載菌量：麻醉條件下消毒小鼠腹部皮膚，將2 ml無菌純水緩緩注入小鼠腹腔，輕輕按摩1 min后，緩慢抽出，所得腹腔灌洗液取100 μl加入0.9%氯化鈉注射液中進行倍比稀釋 103、104、105倍（先取 100 μl腹腔液加入0.9%氯化鈉注射液中進行103倍比稀釋至100 ml，再取其中100 μl進行10倍比稀釋至10 ml，再取其中100 μl進行10倍比稀釋至10 ml），然后取 1 ml均勻涂布在兩個胰蛋白酶血平皿上，將平皿置于37℃恒溫培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，12 h后計算平皿上菌落數(shù)，計算方法同血液載菌量。

1.2.4 干預(yù)措施 造模術(shù)后12 h CLP+鐵調(diào)素抑制劑組小鼠腹腔注射30 mg/kg DS28120313（溶于0.9%氯化鈉注射液共2 ml）；CLP+川芎嗪組小鼠腹腔注射20 mg/kg鹽酸川芎嗪注射液（溶于0.9%氯化鈉注射液共2 ml）；假手術(shù)組和CLP組小鼠腹腔注射0.9%氯化鈉注射液2 ml。觀察各組小鼠術(shù)后4 d的生存情況。

1.2.5 血液生化指標(biāo)、炎癥因子水平檢測 選取各組小鼠5只（除假手術(shù)組），于術(shù)后48 h取眼眶血0.2 ml，EDTA抗凝處理后，4℃，5 000 r/min離心 10 min，離心半徑10 cm。取血清用血生化儀檢測ALT、AST；采用ELISA法檢測小鼠血清TNF-α、IL-1、IL-6和鐵調(diào)素水平。

1.2.6 肝組織JAK/STAT通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blot法。于造模術(shù)后48 h，每組選取3只小鼠，采用頸椎脫臼法處死后取肝組織2 mg，加入 350 μl RIPA 裂解液（每 100 μl裂解液中加入 1 μl PMSF和2 μl磷酸化抑制劑），置于超聲波細(xì)胞破碎儀進行組織裂解，離心后提取目的蛋白，BCA法進行蛋白定量后加入SDS loading buffer高溫變性。肝組織蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉60 min后，分別加入鐵調(diào)素（稀釋度1∶1 000），p-JAK、JAK（稀釋度 1∶1 000）和 p-STAT、STAT（稀釋度 1∶1 000），4℃冰箱中孵育過夜。次日，加入 HRP標(biāo)記的二抗（1∶5 000）室溫孵育 2h，洗膜 3次后行 ECL顯色，并于暗室內(nèi)曝光。采用Image J軟件分析條帶灰度值，以鐵調(diào)素條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比較和p-JAK/JAK，p-STAT/STAT比值反映目的蛋白的相對表達(dá)水平和磷酸化水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型建立評估 假手術(shù)組小鼠術(shù)后12 h精神良好，活動輕微減少，肛溫正常，飲食、飲水正常。CLP小鼠術(shù)后12 h時精神萎靡，行動遲緩，活動減少，肛溫下降，飲食飲水減少，背部毛發(fā)豎立，尿液渾濁。假手術(shù)組小鼠術(shù)后12 h在血液和腹腔液中均未檢測到細(xì)菌。CLP小鼠術(shù)后12 h血液和腹腔液載菌量分別為（15.0±1.3）×103/ml和（8.6±1.0）×103CFU/ml，提示CLP模型建立成功。

2.2 4組小鼠術(shù)后4 d內(nèi)生存率的比較 假手術(shù)組小鼠術(shù)后4 d內(nèi)無死亡，生存率為100%；CLP+鐵調(diào)素抑制劑組和CLP+川芎嗪組小鼠CLP術(shù)后4 d生存率分別為 75.0%（6/8）和 87.5%（7/8），高于 CLP 組的0.0%（0/8），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。死亡小鼠解剖發(fā)現(xiàn)腹腔充滿渾濁滲出液。

2.3 3組小鼠血清生化指標(biāo)及炎癥因子水平的比較 CLP+鐵調(diào)素抑制劑組與CLP+川芎嗪組小鼠術(shù)后48 h ALT、AST、TNF-α、IL-1、IL-6 和鐵調(diào)素水平均顯著低于CLP組，且CLP+川芎嗪組小鼠血清TNF-α、IL-1、IL-6水平顯著低于CLP+鐵調(diào)素抑制劑組，CLP+川芎嗪組鐵調(diào)素水平高于CLP+鐵調(diào)素抑制劑組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見表1。

表1 3組小鼠血清生化及炎癥因子水平的比較

2.4 3組小鼠肝組織JAK/STAT通路相關(guān)蛋白水平的比較 CLP+鐵調(diào)素抑制劑組和CLP+川芎嗪組術(shù)后48 h鐵調(diào)素蛋白表達(dá)水平表達(dá)量顯著低于CLP組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；而CLP+鐵調(diào)素抑制劑組p-STAT和p-JAK蛋白表達(dá)水平與CLP組相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；CLP+川芎嗪組p-STAT和p-JAK蛋白表達(dá)水平顯著低于CLP+鐵調(diào)素抑制劑組和CLP組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見表 2。

表2 3組小鼠肝組織JAK/STAT通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較（%）

3 討論

膿毒癥多是由感染或創(chuàng)傷引起的全身系統(tǒng)彌漫性炎癥反應(yīng)，炎癥反應(yīng)嚴(yán)重者可伴發(fā)器官功能障礙或衰竭，發(fā)病率和死亡率較高。機體的鐵平衡能夠顯著影響患者對感染性疾病的易感性及預(yù)后。臨床研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者血清和尿液鐵調(diào)素水平較對照組明顯升高[7]。肝源性鐵調(diào)素通過調(diào)節(jié)鐵代謝在小鼠膿毒癥中發(fā)揮重要作用，在鐵調(diào)素低表達(dá)的肝臟疾病中，存在潛在治療作用[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)和合適的鐵調(diào)素水平與膿毒癥患者預(yù)后密切相關(guān)[9]。目前研究表明，機體調(diào)控鐵調(diào)素表達(dá)的主要有以下兩條信號通路：正常生理情況下，鐵幼素通過BMP/SMAD信號通路上調(diào)鐵調(diào)素，而感染和炎癥等病理等情況下，炎癥因子IL-6通過JAK/STAT信號通路上調(diào)鐵調(diào)素[10-11]。

川芎嗪具有活血通脈作用[12]，且現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已經(jīng)從多方面證實了川芎嗪能夠調(diào)節(jié)免疫功能，抵抗炎癥，清除氧自由基。陳玉熹等[13]、繆心軍等[14]在研究中發(fā)現(xiàn)，依達(dá)拉奉聯(lián)合川芎嗪能夠顯著保護大鼠肝功能，治療組大鼠術(shù)后ALT、TNF-α均顯著低于假手術(shù)組，有抑制炎癥反應(yīng)和保護肝功能的作用，與本研究結(jié)果相似。本研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪能夠有效提高CLP小鼠術(shù)后4 d生存率。采集3組小鼠術(shù)后12 h時眼眶血進行生化分析，發(fā)現(xiàn)川芎嗪能夠有效保護小鼠肝功能，調(diào)節(jié)小鼠全身免疫反應(yīng)。這些藥理作用均可阻斷或減輕膿毒癥的病理生理過程，有利于膿毒癥的防治。筆者推測可能是通過抗炎和調(diào)節(jié)免疫功能來提高膿毒癥小鼠術(shù)后生存率的，并推測川芎嗪抑制IL-6的釋放影響JAK/STAT通路蛋白磷酸化，從而抑制鐵調(diào)素的表達(dá)，改善膿毒癥小鼠預(yù)后。

鐵調(diào)素是肝臟合成的具有廣譜抗菌作用的蛋白，其升高或降低均會導(dǎo)致機體內(nèi)鐵的穩(wěn)態(tài)失衡，當(dāng)膿毒血癥患者全身炎癥反應(yīng)加重時，肝臟功能受損，從而分泌鐵調(diào)素，進而導(dǎo)致鐵穩(wěn)態(tài)失衡，鐵負(fù)荷增加，從而加重機體的脂質(zhì)過氧化[15]。有效降低鐵調(diào)素的表達(dá)是防治膿毒癥進行性加重的關(guān)鍵。本研究結(jié)果顯示，川芎嗪能夠有效降低小鼠CLP術(shù)后48 h血清鐵調(diào)素水平。為了進一步證明川芎嗪的抗炎作用與鐵調(diào)素相關(guān)，本研究分析了3組小鼠血清生化指標(biāo)及炎癥因子水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CLP+鐵調(diào)素抑制劑組小鼠術(shù)后48 h血清 ALT、AST、TNF-α、IL-1、IL-6 和鐵調(diào)素水平均顯著低于CLP組，且CLP+川芎嗪組小鼠血清TNF-α、IL-1、IL-6水平顯著低于CLP+鐵調(diào)素抑制劑組，CLP+川芎嗪組鐵調(diào)素水平高于CLP+鐵調(diào)素抑制劑組，提示川芎嗪可能通過抑制炎癥因子表達(dá)保護肝功能。為了進一步探究川芎嗪對鐵調(diào)素調(diào)控在抗炎中的作用機制，本研究觀察了3組小鼠肝組織中相應(yīng)通路蛋白表達(dá)情況，川芎嗪能夠顯著降低CLP術(shù)后48 h小鼠肝組織中p-JAK和p-STAT蛋白的表達(dá)水平，而鐵調(diào)素抑制劑則無法達(dá)到此效果，提示川芎嗪能夠通過抑制鐵調(diào)素上游p-JAK和p-STAT的表達(dá)，以達(dá)到抑制鐵調(diào)素表達(dá)從而減輕炎癥因子表達(dá)引起的炎癥反應(yīng)。而鐵調(diào)素抑制劑僅通過抑制鐵調(diào)素表達(dá)來減輕鐵調(diào)素所引起后續(xù)肝組織氧化損傷，而無法對炎癥通路進行直接抑制。這可能是川芎嗪對膿毒癥治療有效性的關(guān)鍵機制之一。

綜上所述，川芎嗪能夠通過抑制JAK/STAT磷酸化而減少鐵調(diào)素在小鼠肝組織中的表達(dá)，從而減輕肝臟損傷及全身炎性損傷。