毛玉梅，楊 琴，蘭長駿，廖 萱

0引言

視黃醇脫氫酶5(retinol dehydrogenase 5，RDH5)又稱11-順式視黃醇脫氫酶，屬于短鏈脫氫酶/還原酶家族，是視覺周期中一種關(guān)鍵的NAD(H)依賴氧化酶。在高等動物的視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細(xì)胞中，RDH5作為視黃醇脫氫酶家族的重要一員，以NAD(H)為輔助因子，主要參與氧化形成11-順式視黃醛(11-cisretinal，11cRAL)，最后與視蛋白結(jié)合形成視色素發(fā)色團(tuán)，從而在視覺周期中扮演重要角色[1]。RDH5基因發(fā)生突變后導(dǎo)致酶的活性大幅下降，從而產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)，甚至造成嚴(yán)重的視網(wǎng)膜病變。本文對RDH5基因及其編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，以及近年來RDH5在視覺周期和遺傳性視網(wǎng)膜疾病方面相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行簡要綜述。

1 RDH5的結(jié)構(gòu)和功能

在脊椎動物視覺周期過程中，11cRAL發(fā)色團(tuán)通過質(zhì)子化的schiff-堿基與視紫紅質(zhì)共價結(jié)合后，被運輸?shù)礁泄饧?xì)胞。一旦接受光刺激，11cRAL與視紫紅質(zhì)分離并異構(gòu)化為全反式視黃醛(all-transretinal，atRAL)，激發(fā)視覺信號級聯(lián)反應(yīng)[2]。RDH5可以催化11-順式視黃醇(11-cisretinol，11cROL)形成11cRAL[3]，參與眼內(nèi)發(fā)色團(tuán)的形成，也能作為主要的限速酶在其他部位將9cROL氧化為9cRAL，在第一步的限速反應(yīng)中發(fā)揮作用[4]。RDH5可以在視覺周期不同種類的視黃醇氧化過程中發(fā)揮重要作用，既有助于11cROL氧化成為視覺周期的發(fā)色團(tuán)，進(jìn)一步誘發(fā)光電信號的轉(zhuǎn)化，也可以促進(jìn)視黃酸的形成。了解此酶的結(jié)構(gòu)以及與其他周期蛋白之間的相互作用可以加深對視循環(huán)過程的理解。

1.1 RDH5的結(jié)構(gòu)RDH5作為短鏈脫氫酶/還原酶(short-chain dehydrogenases/reductases，SDRs)家族中首個被鑒定和克隆的視黃醇脫氫酶，主要分布在眼的RPE層[5]。視黃醇脫氫酶類代表了SDRs家族結(jié)構(gòu)特征，具有典型的Rossmann折疊(3～4條α螺旋位于中心，被平行的6～7條β折疊包圍)，也包括兩個保守區(qū)域：(1)N末端的輔因子結(jié)合位點，富含甘氨酸的序列(G-X-X-X-G-X-G)；(2)位于C端的具有催化活性中心的四分體N-S-Y-K[6-7]。不同類型的視黃醇脫氫酶所處的細(xì)胞器位置、N末端和/或C末端的結(jié)構(gòu)域并不完全一致。

1.2 RDH5的功能RDH5是一種膜蛋白酶，通過氨基末端信號錨定肽和羧基末端跨膜段錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和微粒體膜，催化結(jié)構(gòu)域面向管腔內(nèi)側(cè)。近年來發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜內(nèi)側(cè)腔隙中的NAD(H)是RDH5的輔助因子，是其有效氧化視黃醇的必要條件[7]。除了輔助因子NAD(H)，還應(yīng)考慮底物(9/11cROL、類維生素A)的生理濃度，二者從細(xì)胞質(zhì)到管腔的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)運必須通過跨膜，才能最終實現(xiàn)酶促反應(yīng)，但是如何介導(dǎo)該過程的動力學(xué)還需要進(jìn)一步探索。也有研究表明RDH5是一個膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，是由18個氨基酸殘基組成的N端疏水螺旋、蛋白中部疏水螺旋-環(huán)螺旋跨膜區(qū)以及靠近C端的23個氨基酸殘基的疏水螺旋體構(gòu)成，形成膜錨定蛋白[8]。目前對于RDH5的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)仍存在爭議。

2 RDH5與視周期蛋白的相互作用

RDH5在細(xì)胞中的流動性以及與其他視周期蛋白之間的交互作用提示酶之間和酶與蛋白之間并不是獨立發(fā)揮作用，而是相互聯(lián)系來共同促進(jìn)視覺循環(huán)。

Sahu等[7]最初通過免疫共沉淀的方法發(fā)現(xiàn)RDH5與RPE65之間存在交互，二者可以耦合形成復(fù)合物。RPE65蛋白在RPE細(xì)胞中高表達(dá)，分布在胞質(zhì)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜胞漿一側(cè)[9]，主要參與類維生素A的代謝過程，如視黃醇攝取、代謝和異構(gòu)化。也有研究表明這種異構(gòu)酶可以將全反式視黃醇酯轉(zhuǎn)化為11cROL。人類RPE65基因的突變會導(dǎo)致萊伯氏先天性黑朦，在嬰兒期出現(xiàn)致盲[9-10]。但目前二者間交互作用的機(jī)制仍然是未知的。

Chen等[11]發(fā)現(xiàn)了與RDH5相互作用的另一種蛋白，視網(wǎng)膜G蛋白偶聯(lián)受體(retinal G protein-coupled receptor，RGR)，其結(jié)構(gòu)類似于視覺色素以及其他G蛋白偶聯(lián)受體的蛋白質(zhì)，與視色素主要集中在錐體外段，提示這些視色素之間可能存在相互作用[12]。作為光異構(gòu)酶，RGR在視覺色素的通用發(fā)色團(tuán)11cRAL產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用，主要是通過與atRAL生色團(tuán)結(jié)合，使其光異構(gòu)化為11cRAL[13-14]。此外，研究發(fā)現(xiàn)在穆勒膠質(zhì)細(xì)胞中的RGR視蛋白也參與視色素的再生，可以和RDH10在可見光下將所有atROL轉(zhuǎn)化為11cROL[15]。RDH5將11cROL氧化為11cRAL，增強(qiáng)了RGR結(jié)合的atRAL的凈光異構(gòu)化[11]。同時有研究證明RGR的作用不僅可以防止9c/13cRAL異構(gòu)化，也可以直接或間接地除去這些同分異構(gòu)體[15]。RDH5與RGR的相互作用有可能僅表現(xiàn)在視循環(huán)中。

Ward等[13]和Saari等[16]發(fā)現(xiàn)在11cRAL再生過程中，細(xì)胞視黃醛脫氫酶結(jié)合蛋白(cellular retinaldehyde-binding protein，CRALBP)和RDH5關(guān)系密切。CRALBP是一種可溶性的胞漿蛋白，可以作為關(guān)鍵的底物載體，介導(dǎo)11cROL從異構(gòu)酶中轉(zhuǎn)移到RDH5，并催化11cROL氧化為11cRAL，從而促進(jìn)11cRAL的生成[17]。此外，研究揭示了CRALBP與RDH5和磷酸化蛋白50(ERM-binding phosphoprotein 50，EBP50)/鈉氫交換調(diào)節(jié)因子1(sodium-hydrogen exchanger regulatory factor type 1，NHERF1)的相互關(guān)系[16,18]。RDH5催化反應(yīng)發(fā)生在RPE細(xì)胞頂端突起中視覺周期蛋白復(fù)合體[18-19]。該復(fù)合物由CRALBP和EBP50/NHERF1兩種蛋白構(gòu)成，有助于靶蛋白的頂端定位，為類維生素A加工提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[20]。EBP50/NHERF1又與埃茲蛋白(ezrin)相互作用，后者與各種胞質(zhì)膜成分結(jié)合，并與肌動蛋白細(xì)胞骨架物理連接[21]。提示該復(fù)合物與RDH5結(jié)合可能有助于RPE頂端的11cRAL局部合成和釋放。

在視覺周期過程中，RDH5作為一種關(guān)鍵限速酶，參與形成發(fā)色團(tuán)，促進(jìn)光化學(xué)信號的轉(zhuǎn)變。同時，不同的酶和蛋白也參與了該反應(yīng)，協(xié)同RDH5催化氧化，在時間和空間上都大大增加了酶促反應(yīng)，這也是從暗適應(yīng)快速轉(zhuǎn)換到明適應(yīng)的重要基礎(chǔ)。但RDH5與其他視蛋白或酶之間如何相互作用調(diào)控類維生素A的儲存和轉(zhuǎn)換還有待進(jìn)一步研究。

3 RDH5突變與遺傳性視網(wǎng)膜病變

RDH5基因位于染色體12q13.2，包含5個外顯子，編碼含318個氨基酸的蛋白，分子量約為32kDa。大部分RDH5基因的突變會改變內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔室的催化結(jié)構(gòu)、N末端或C末端的膜錨定蛋白和活化區(qū)域等主要功能區(qū)，進(jìn)而嚴(yán)重影響RDH5的功能，延遲視錐細(xì)胞和視桿細(xì)胞感光色素的再生，導(dǎo)致眼部尤其是遺傳性視網(wǎng)膜疾病的發(fā)生，如白點狀眼底(fundus albipunctatus，F(xiàn)A)、視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)、白點狀視網(wǎng)膜炎(retinitis punctata albescens，RPA)。

3.1 RDH5突變與白點狀眼底多數(shù)FA病例是由RDH5基因突變引起的。FA是一種靜止型先天性夜盲癥，主要遺傳方式是常染色體隱性遺傳，其主要特征是除黃斑區(qū)以外，視網(wǎng)膜中周部彌散分布典型的淡黃色斑點。RDH5突變的FA患者突變點主要集中在編碼區(qū)，這類患者主要表現(xiàn)為視桿功能異常，部分RDH5基因突變的FA患者還出現(xiàn)黃斑萎縮或視錐細(xì)胞營養(yǎng)不良等臨床表現(xiàn)，特別是老年患者[22-23]。Sergouniotis等[24]在8個先天性夜盲癥家系的9例FA患者中，檢測出9個RDH5純合突變或復(fù)合雜合突變，其中錯義突變33 Ile→Thr、19 Arg→Gly、116 Gly→Arg、139 Gly→Val、237 Tyr→Ser以及插入突變p.Arg54_55ValinsAla均會改變內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔室的催化胞外域，而錯義突變319 X→Arg是翻譯終止位點突變，導(dǎo)致原本短小的胞漿序列延長；剪接突變c.320+1G>A以及移碼突變p.Arg275fsX60突變點位于C段跨膜結(jié)構(gòu)域的序列，改變了跨膜蛋白的長度。這些外顯子編碼區(qū)的突變位點影響了蛋白轉(zhuǎn)錄和翻譯，對FA患者眼部形態(tài)和功能均產(chǎn)生了不同程度的影響。全視野視網(wǎng)膜電流圖(full-field electroretinography，ffERG)結(jié)果顯示全部患者視桿反應(yīng)減少，其中6例患者出現(xiàn)視錐反應(yīng)異常；而隨著暗適應(yīng)時間延長，部分患者視桿反應(yīng)恢復(fù)正常，提示著一種替代現(xiàn)象。此外，基因敲除的動物模型[25]驗證了RDH10也能低效率地促進(jìn)11cROL氧化成11cRAL，與視紫紅質(zhì)結(jié)合從而參與明暗適應(yīng)的轉(zhuǎn)換。Makiyama等[26]通過自適應(yīng)光學(xué)掃描激光眼底鏡也證實FA患者的視錐功能下降，伴隨著黃斑周圍的視錐細(xì)胞密度減少、空間排列紊亂。

Ajmal等[23]研究了巴基斯坦2個FA家系的潛在遺傳分子機(jī)制，在其中一個家系中發(fā)現(xiàn)位于最后一個外顯子突變?nèi)笔?個堿基，導(dǎo)致RDH5基因開放閱讀框的移碼(p.Val305Hisfs*29)，將第305位的纈氨酸替換為組氨酸，終止密碼的位置變?yōu)榈?9位，最終使蛋白的C端跨膜結(jié)構(gòu)域縮短；在另一家系中發(fā)現(xiàn)新的錯義突變253 Met→Arg，該位點在正常人高度保守，突變后導(dǎo)致核心蛋白錯誤折疊，蛋白與蛋白之間的疏水作用喪失。4例FA患者因RDH5突變位點不同而表現(xiàn)出眼底白點伴或不伴有黃斑萎縮、RPE變性和錐桿反應(yīng)降低的臨床癥狀，顯示同一家系內(nèi)相同突變點出現(xiàn)表型異質(zhì)性。青少年患者黃斑功能正常，而較年長患者均出現(xiàn)了黃斑萎縮，提示黃斑變性可能是FA患者一種進(jìn)行性的并發(fā)癥。表型異質(zhì)性是一個不確定因素，突變類型本身不是決定是否出現(xiàn)并發(fā)癥的唯一因素，仍需要進(jìn)一步探究基因型-表型之間的關(guān)系。

另有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A的RDH5基因突變位點c.928delCinsGAAG在日本人群中長期存在。Katagiri等[27]在22個日本家系的25例FA患者中檢測到RDH5基因突變以c.928delCinsGAAG最多見，其中12例患者因c.928delCinsGAAG純合突變致病，推測是遺傳漂變作用的奠基者效應(yīng)。92%患者的年齡均為40～78歲，67%患者的視錐反應(yīng)下降，50%患者有黃斑病變。攜帶該奠基者效應(yīng)突變的FA患者中，年輕患者的視錐功能和視桿功能尚存；一旦患者的年齡超過40歲，黃斑功能會逐漸喪失，這也是導(dǎo)致該突變位點的表型不穩(wěn)定的重要因素。Yang等[28]和Liu等[29]對中國人群RDH5基因突變導(dǎo)致FA的研究發(fā)現(xiàn)，RDH5基因的熱點突變c.928delCinsGAAG(310 Leu→GluVal)導(dǎo)致幼齡患者視桿功能尚存、視錐功能正常，其他患者出現(xiàn)了表型異質(zhì)性。根據(jù)人類基因突變數(shù)據(jù)庫(The Human Gene Mutation Database，HGMD)數(shù)據(jù)顯示，該突變位點突變頻率高達(dá)75%，該變異的編碼蛋白第310位非極性亮氨酸突變?yōu)闃O性谷氨酸和非極性纈氨酸，二級結(jié)構(gòu)由α螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)棣抡郫B，這使得原來的膜錨定結(jié)構(gòu)無法正常固定在膜上[30]。

3.2 RDH5突變與視網(wǎng)膜色素變性研究也發(fā)現(xiàn)RDH5編碼區(qū)的突變與RP相關(guān)。一項6代大家系的研究鑒定出了一種新的RDH5突變位點(201 Ser→Phe)，該突變改變了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的催化區(qū)域，導(dǎo)致了感光細(xì)胞變性或凋亡，臨床主要表現(xiàn)為眼底色素沉著、視盤蠟樣蒼白、外核層厚度減少，進(jìn)行性夜盲，最終導(dǎo)致視野狹窄和失明[31-32]。目前國內(nèi)僅報道過1例RDH5基因突變導(dǎo)致RP。王春霞等[33]鑒定1個FA與RP共存家系，發(fā)現(xiàn)新突變(c.689_690CT>CG)位于第4外顯子，發(fā)生突變后的CG因失去限制性內(nèi)切酶的識別位點導(dǎo)致無法被切斷，翻譯后的結(jié)構(gòu)蛋白喪失了完整的催化結(jié)構(gòu)域，最后導(dǎo)致眼底出現(xiàn)骨細(xì)胞樣色素沉積，ffERG的a波和b波振幅均顯著性下降，且不會隨著暗適應(yīng)時間變化而改善，視錐和視桿功能嚴(yán)重喪失，為典型的RP表現(xiàn)。當(dāng)RDH5基因突變位點改變酶的催化結(jié)構(gòu)域或活化中心時，將會大大降低酶的活性，這類患者的表型會更加嚴(yán)重。

3.3 RDH5突變與白點狀視網(wǎng)膜炎RPA是一種更為嚴(yán)重的廣泛性視網(wǎng)膜變性疾病，主要是視網(wǎng)膜多個白點沉積、小動脈進(jìn)行性衰減和視野縮小、ffERG嚴(yán)重降低，且不會隨著暗適應(yīng)時間的延長而恢復(fù)。RPA是一種罕見的先天性進(jìn)行型夜盲癥，目前RDH5基因突變與RPA的報道較少。最近，Khan等[34]報道2個近親家庭中發(fā)現(xiàn)了RDH5突變導(dǎo)致RPA。2個家系所有RPA患者的全外顯子測序發(fā)現(xiàn)位于RDH5第1外顯子/內(nèi)含子邊界的一個新的剪接變異體(c.-33+2dup)，該突變點導(dǎo)致第1內(nèi)含子被保留而改變了第1外顯子的開放閱讀框序列，影響了N末端膜錨定蛋白片段的功能，最終該蛋白無法介導(dǎo)其他酶的轉(zhuǎn)運。2個家系中7例純合突變患者均表現(xiàn)出典型的RPA特征，ffERG結(jié)果顯示出視桿反應(yīng)完全喪失，視錐功能嚴(yán)重減弱；攜帶1個雜合子的患者眼底也出現(xiàn)少量白點沉積。需重視RDH5突變的RPA患者的表型評估和鑒別診斷，對于癥狀較輕和體征不明顯的攜帶者也不容忽視。

4結(jié)論和展望

RDH5作為一個關(guān)鍵酶在視覺周期中發(fā)揮著重要作用，不僅可以協(xié)同其他周期蛋白參與視覺周期中視色素的形成，也促進(jìn)生成視黃酸進(jìn)而調(diào)控靶細(xì)胞的增殖和分化等。RDH5蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域、催化結(jié)構(gòu)域、活化區(qū)域等主要功能區(qū)域均已發(fā)現(xiàn)突變位點，并導(dǎo)致了不同的遺傳性視網(wǎng)膜疾病表型。目前研究對RDH5基因突變位點的識別和補充，擴(kuò)展了遺傳性視網(wǎng)膜病變的基因診斷譜系，有助于疾病早期篩查和風(fēng)險評估等。隨著研究的不斷深入，有望開發(fā)出用于治療RDH5突變相關(guān)遺傳性視網(wǎng)膜疾病的基因替代和靶向分子藥物，進(jìn)行精準(zhǔn)的生物治療和靶向治療，從而控制疾病發(fā)展和改善預(yù)后，最終達(dá)到治愈相關(guān)疾病和提高生存質(zhì)量的目的。