史艷艷

（天津市農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)中心 300402）

酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是基于抗原抗體反應(yīng)的一種新型、快速的免疫測(cè)定技術(shù)。由于ELISA 檢測(cè)技術(shù)的靈敏度高、特異性強(qiáng)、選擇性好、實(shí)用性強(qiáng)，且不需要大型儀器設(shè)備，對(duì)工作人員的專業(yè)技能要求不高，被廣泛應(yīng)用于分析化學(xué)、生物藥學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)和食品安全等領(lǐng)域的檢測(cè)。ELISA 檢測(cè)技術(shù)不僅可以對(duì)飼料和食品中的藥物殘留、有害微生物和生物毒素等物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析，還能應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因食品的安全檢查，為飼料及食品安全提供參考依據(jù)。

1 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)概述

1.1 技術(shù)原理

ELISA 是基于抗原-抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)建立起來(lái)的一種快速檢測(cè)技術(shù)，即首先通過(guò)固相狀態(tài)的載體吸附已知的抗原或抗體，待測(cè)樣本中對(duì)應(yīng)的抗體或抗原與之結(jié)合形成特異性的抗原抗體復(fù)合物，通過(guò)洗滌的方法區(qū)分固相載體上的抗原抗體復(fù)合物和其他物質(zhì)，再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也會(huì)出現(xiàn)抗原和抗體特異性結(jié)合反應(yīng)結(jié)合在固相載體上，加入酶反應(yīng)的底物后，底物由酶催化為帶顏色的產(chǎn)物（顏色變化為定性檢測(cè)），通過(guò)吸光度值計(jì)算待測(cè)樣本的抗原（或抗體）量。由于產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，ELISA 還可以進(jìn)行定量分析。

1.2 試驗(yàn)類型

ELISA 檢測(cè)技術(shù)根據(jù)待檢物質(zhì)類型和檢測(cè)條件主要分為間接法、競(jìng)爭(zhēng)法和夾心法。間接法主要應(yīng)用于抗體檢測(cè)，即將已知抗原和固相載體結(jié)合，加入待檢樣本，其特異性抗體和固相抗原結(jié)合形成固相抗原抗體復(fù)合物，洗滌后固相載體上只留下特異性抗體，再加入酶標(biāo)抗抗體與其結(jié)合，間接對(duì)抗體標(biāo)記上酶，加入酶的底物進(jìn)行顯色即可?？乖潭鹊母叩椭苯佑绊戦g接法的特異性。競(jìng)爭(zhēng)法主要用于小分子抗原的檢測(cè)，即待檢樣本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)與固相抗原結(jié)合，若待檢樣本中的抗體含量多，其結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體會(huì)減少，因此，陰性反應(yīng)顏色比陽(yáng)性反應(yīng)顏色更深更明顯。夾心法主要用于大分子抗原檢測(cè)，即通過(guò)固相抗體去檢測(cè)待檢樣本中的抗原，該方法更適合測(cè)定二價(jià)或二價(jià)以上的分子，可以形成兩位點(diǎn)夾心。

1.3 試驗(yàn)優(yōu)缺點(diǎn)

（1）優(yōu)點(diǎn)：ELISA 檢測(cè)技術(shù)既可以檢測(cè)抗原，也可以檢測(cè)抗體，其反應(yīng)特異性高、靈敏度強(qiáng)、試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短，不需要大型儀器設(shè)備，結(jié)果可讀性高，分析簡(jiǎn)單且成本低，是當(dāng)下較為理想的飼料和食品安全檢測(cè)技術(shù)之一。

（2）缺點(diǎn)：ELISA 檢測(cè)技術(shù)對(duì)試劑的選擇性高，對(duì)相對(duì)分子量小的化合物檢測(cè)難度大，且結(jié)構(gòu)相似的化合物還會(huì)出現(xiàn)不同程度的交叉反應(yīng)，因此，未來(lái)需要從單克隆抗體研發(fā)入手，加速不同檢測(cè)ELISA 試劑盒的開(kāi)發(fā)，更好地普及和推廣ELISA檢測(cè)技術(shù)。

2 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)在飼料及食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1 農(nóng)藥殘留的檢測(cè)

農(nóng)藥殘留是威脅飼料和食品安全的重要因素之一，還會(huì)降低我國(guó)副產(chǎn)品的出口率，目前農(nóng)業(yè)殘留種類主要包括有機(jī)磷、有機(jī)氯和擬除蟲(chóng)菊酯類等，有機(jī)磷農(nóng)藥殺蟲(chóng)范圍廣，應(yīng)用范圍大，對(duì)人畜的危害性較高，高效液相色譜法、氣相色譜法和薄層層析法檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留，樣品處理操作負(fù)責(zé)，而ELISA檢測(cè)技術(shù)。邢瑋瑋和陳燕敏（2018）通過(guò)ELISA 技術(shù)測(cè)定食品中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留，同時(shí)對(duì)比氣相色譜法和高效液相色譜法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ELISA 測(cè)定結(jié)果的可靠性更高，且操作更為方便[1]。

2.2 違禁藥物的檢測(cè)

鹽酸克倫特羅（CL）是一種腎上腺類神經(jīng)興奮劑，CL 非獸藥也非飼料添加劑，常用于支氣管哮喘的治療；萊克多巴胺（RAC）是一種人工合成的克侖巴安β 腎上腺受體激動(dòng)劑，常用于治療充血性心力衰竭癥。但CL 和RAC 人畜食用后會(huì)產(chǎn)生副作用，我國(guó)境內(nèi)分別于2002 年9 月和2011 年12 月在飼料和飲用水中食用。但仍有部分養(yǎng)殖戶私用“瘦肉精”來(lái)抑制脂肪的合成，提高動(dòng)物產(chǎn)品瘦肉率。賀健強(qiáng)等（2019）用ELISA試劑盒和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MSMS）同時(shí)測(cè)定動(dòng)物飼料中的CL 和RAC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼料樣品殘留量在0.1ug/kg 水平以上時(shí)，ELISA 檢測(cè)方法是一種快速篩查方法，且定性和定量結(jié)果可以作為初步快速篩查依據(jù)，而LC-MSMS 可用于精準(zhǔn)定量[2]。

2.3 有害微生物的檢測(cè)

飼料中的有害微生物不僅會(huì)降低飼料品質(zhì)，畜禽食用后還會(huì)擾亂腸胃微生物菌群，對(duì)畜禽是一種危害性較大的內(nèi)源性污染，可直接威脅畜禽生命健康。沙門(mén)氏菌和大腸桿菌都是飼料中常見(jiàn)的有害微生物，飼喂時(shí)必須除去病原微生物污染的飼料，提高飼料安全性。韓志輝和張紅見(jiàn)（2011）通過(guò)Dot-ELISA 對(duì)西寧市某飼料廠飼料沙門(mén)氏菌進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Dot-ELISA 法與常規(guī)分離鑒定技術(shù)的符合率為82.23%，和常規(guī)分離鑒定技術(shù)相比，ELISA 檢測(cè)技術(shù)不僅縮短檢測(cè)時(shí)間，其較強(qiáng)的特異性和敏感性可以支撐ELISA 技術(shù)應(yīng)用于飼料中沙門(mén)氏菌檢測(cè)[3]。

2.4 生物毒素的檢測(cè)

真菌是造成飼料毒素產(chǎn)生的關(guān)鍵，飼料中常見(jiàn)的生物毒素有黃曲霉毒素、玉米赤烯酮和霉菌毒素等。姚靜靜等（2019）首先制備了高靈敏度的AFB1 單克隆抗體，并通過(guò)ELISA 檢測(cè)方法對(duì)糧食和飼料中的黃曲霉毒素B1進(jìn)行檢測(cè)，其AFB1 單克隆抗體的效價(jià)高達(dá)5.12×105，檢測(cè)范圍為0.014～1.920ng/ml，且與其他霉菌毒素?zé)o交叉反應(yīng)，成功建立了靈敏度高和特異性強(qiáng)的AFB1 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 檢測(cè)方法[4]。張?jiān)埽?018）通過(guò)ELISA 檢測(cè)技術(shù)測(cè)定臨沂市5 個(gè)縣區(qū)150 份煎餅類食品中黃曲霉毒素含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，140 份樣本都檢出了黃曲霉毒素，其中102 份為黃曲霉毒素B1，含26 份黃曲霉毒素B1超標(biāo)樣本[5]。

2.5 轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)

轉(zhuǎn)基因食品是當(dāng)下發(fā)展最快的新型食品，可以通過(guò)基因工程人為改變生物形狀、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、產(chǎn)品品質(zhì)和數(shù)量等，但轉(zhuǎn)基因食品的安全性、倫理學(xué)和環(huán)境污染情況也一直困擾廣大消費(fèi)者的選擇，越來(lái)越多的國(guó)家采取強(qiáng)制性轉(zhuǎn)基因食品標(biāo)識(shí)讓消費(fèi)者享有知情權(quán)。轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)的常用方法有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、ELISA 檢測(cè)技術(shù)、側(cè)流技術(shù)和生物芯片技術(shù)，其中ELISA檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、成本低、穩(wěn)定好，因此被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因食品安全檢測(cè)當(dāng)中。李小宇等（2016）通過(guò)雙抗夾心ELISA檢測(cè)技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)Bar 基因抗除草劑大豆（膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶）進(jìn)行檢測(cè)，確定了最低檢測(cè)限為0.04ng/ml，ELISA 檢測(cè)技術(shù)的重復(fù)性變異系數(shù)小于3%，且根、莖、花、葉、種子不同部位都可檢測(cè)到該蛋白的表達(dá)[6]。

3 結(jié)語(yǔ)

隨著人們對(duì)動(dòng)物源性食品安全問(wèn)題的關(guān)注，操作簡(jiǎn)便、高靈敏度和特異性的ELISA 檢測(cè)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于飼料和食品安全檢測(cè)中，為我國(guó)畜牧業(yè)健康和食品安全提供重要保障，但要想真正解決飼料和食品安全問(wèn)題，還需要從源頭入手，加強(qiáng)對(duì)飼料生產(chǎn)、加工和農(nóng)獸藥銷售行業(yè)的管理，規(guī)范養(yǎng)殖戶的飼養(yǎng)方法和藥物使用，減少藥物殘留，為畜禽提供一個(gè)健康穩(wěn)定的環(huán)境，才能為廣大人民群眾提供安心安全的動(dòng)物源性食品。