牛病毒性腹瀉病例的血清學(xué)診斷

連小麗

（甘肅省定西市安定區(qū)畜牧獸醫(yī)局高峰畜牧獸醫(yī)站 743000）

牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）隸屬于黃病毒科，是瘟病毒屬成員之一，主要引發(fā)病毒性腹瀉-黏膜病，以致病牛免疫耐受能力降低、屢次出現(xiàn)感染、母牛流產(chǎn)風(fēng)險明顯增高、奶牛產(chǎn)奶量下降，對牛只健康生長造成嚴(yán)重影響。病畜分泌物、排泄物及血液等均可能成為本病的傳染源，既往調(diào)查發(fā)現(xiàn)[1]，牛病毒性腹瀉在全國范圍中均可發(fā)生，有廣泛流行性特征，對牛養(yǎng)殖戶經(jīng)濟(jì)效益形成較明顯的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 被檢血清

2019 年在內(nèi)蒙古某奶牛場隨機(jī)選擇300 頭牛，采集尾靜脈血液，常規(guī)離心、分離血清后待檢。已知本牛場所有牛既往均沒有接種過BVDV 疫苗。

1.1.2 檢測試劑

牛病毒性腹瀉抗體（BVDV-Ab）、抗原（BVDV-Ag）檢測試劑盒。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

高速臺式離心機(jī)（5810）、恒溫培養(yǎng)箱（INE 500）以及酶標(biāo)儀（Elx808IU）等。

1.2 檢測方法

采用酶聯(lián)免疫試驗（ELISA）方法檢測BVDV-Ab、BVDVAg，嚴(yán)格依照試劑盒說明書上指示內(nèi)容進(jìn)行操作。

（1）把試樣對應(yīng)的微孔按序編號，各板均要設(shè)置陰性、陽性對照孔，空白對照孔，其中空白對照孔不添加試樣于酶標(biāo)試劑，其他各步操作一致。

（2）將50μl 陰性、陽性對照分別添加到陰、陽性對照孔，而后先把樣品稀釋液40μl 添加到待測樣品孔，而后再加入10μl 待測樣品。通過加樣把試樣添加到酶標(biāo)板孔底，盡量做到不觸碰孔壁，輕搖使其混合均勻。

（3）采用封板膜進(jìn)行封板處理后，將其安放在37℃恒溫箱內(nèi)，連續(xù)孵育30min。

（4）小心撕掉封板膜，棄除液體，甩干，各孔加滿洗滌液，靜置30s 后棄除，以上操作反復(fù)進(jìn)行5 次，拍干。

（5）朝各孔添加50μl 酶標(biāo)試劑（空白孔除外），孵育及洗滌反復(fù)同上。

（6）每孔各添加50μl 顯色劑A，隨后添加50μl 顯色劑B，輕搖混勻，37℃避光條件顯色15min。

（7）各孔均添加50μl 終止液，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立即轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色）。

1.3 指標(biāo)觀察與判斷

把空白孔調(diào)零，采用450nm 波長依次檢測各孔的吸光度（OD 值），檢測要在添加終止液15min 之內(nèi)進(jìn)行。

試驗有效性判斷標(biāo)準(zhǔn)為：陽性、陰性對照平均值分別≥1.00、≤0.10[2]。

臨界值（CUT OFF)=陰性對照孔均值=0.15，若試樣OD值≥臨界值（CUT OFF) 則被診斷為BVDV 陽性，否則為BVDV 陰性。

2 結(jié)果

2.1 統(tǒng)計牛病毒性腹瀉抗體/抗原感染情況

300 份牛血樣均順利完成牛病毒性腹瀉抗體與抗原檢測，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，BVDV-Ab、BVDV-Ag 陽性率分別是7.00%（21/300）、0.67%（2/300）。表明該牛場中存在牛病毒性腹瀉感染情況，和全國既往報道的數(shù)據(jù)相比較，感染率相對較低。

2.2 陽性牛群內(nèi)牛病毒性腹瀉抗體/抗原的轉(zhuǎn)換值

參照試劑盒說明書，BVDV-Ab 轉(zhuǎn)換值≥0.300 與BVDVAg 轉(zhuǎn)換值＞0.300 時分別被判斷為陽性。參照以上情況，進(jìn)一步分析BVDV-Ab、BVDV-Ag 顯陽性的試樣發(fā)現(xiàn)，BVDV-Ab、BVDV-Ag 轉(zhuǎn)換值的平均值分別為0.900 與3.302，明顯高于判定陽性的臨界值，表明本牛場確實存在牛病毒性腹瀉感染情況。

3 討論

牛病毒性腹瀉是由BVDV 引起的一種牛群接觸性傳染疾病，其臨床癥狀多樣，且時常變化，如體溫升高、黏膜發(fā)炎、糜爛、壞死、腹瀉、流產(chǎn)等。本病在全國各地均有發(fā)生，感染對象以黃牛、水牛與牦牛等為主，冬末與春天是本病高發(fā)期，新發(fā)病牛只呈現(xiàn)出爆發(fā)流行，發(fā)病后能獲得較長期的強(qiáng)免疫，呈現(xiàn)出零星散發(fā)[3]?；疾∨Ｅc帶毒牛是本病主要傳染源，患病牛只的鼻汁、唾液、糞尿等分泌物與排泄物中均可含有大量BVDV，一般會通過消化道與呼吸道感染傳播本病。各年齡段的牛只均可能會感染本病，其中6～18 月齡的牛感染率相對較高，山羊與豬等可能會自然感染，形成抗體，但基本不會出現(xiàn)明顯的癥狀表現(xiàn)，呈現(xiàn)出隱性感染，牛群內(nèi)存在較高的感染率。

針對畜病的發(fā)病原因，可能是牛種引進(jìn)前沒有進(jìn)行嚴(yán)格的隔離、檢疫，以致帶進(jìn)BVDV；病牛自身攜帶病毒、處理不規(guī)范、消毒不徹底，飼養(yǎng)管理欠缺規(guī)范性等。針對本病癥的獸醫(yī)診斷要點(diǎn)有：幼齡牛與青年牛染病后體溫上升，達(dá)到41～42℃，持續(xù)高熱4～7d，食欲減退或廢食，反芻暫停，口周流涎，流眼淚，奶牛泌乳性能下降，口腔黏膜出現(xiàn)不同程度潰爛及消化道出血與潰瘍等，特別是食道黏膜腐爛，結(jié)合病畜以上癥狀表現(xiàn)，通常能初步作出診斷。而若要作出最后診斷，需要病原學(xué)和血清學(xué)檢查。其中血清學(xué)診斷過程需要提取疑似病例的血液標(biāo)本，檢測時可供選擇的方法較多，如ELISA 方法、中和試驗等[4]。相關(guān)人員要認(rèn)真觀察試驗結(jié)果，采集病畜相應(yīng)情況，疾病一經(jīng)確診后應(yīng)立即采取對癥治療方法。在本次檢測中，采用ELISA 方法檢查300 份牛血樣，牛病毒性腹瀉抗體與抗原陽性率分別是7.00%、0.67%，表明該牛場中存在牛病毒性腹瀉感染情況。計算陽性牛群內(nèi)牛病毒性腹瀉抗體/抗原的轉(zhuǎn)換值，平均值分別是0.900 與3.302，明顯高于判定陽性臨界值，表明本牛場確實存在牛病毒性腹瀉感染情況。

當(dāng)下，獸醫(yī)臨床上針對牛病毒性腹瀉尚沒有根治手段與免疫方法，針對患病牛只，只有在加強(qiáng)監(jiān)測、照護(hù)、飼養(yǎng)管理來增強(qiáng)牛只機(jī)體抵抗力，結(jié)合癥狀表現(xiàn)采用對癥治療手段。針對病情相對較嚴(yán)重的養(yǎng)牛場，可以應(yīng)用注射本病弱毒疫苗的方法，該種方法不適用于健康牛與妊娠牛只。通過加強(qiáng)各種規(guī)范化的飼養(yǎng)管理措施去增強(qiáng)牛的抵抗能力。養(yǎng)殖戶自覺樹立定期消毒意識，可以選擇過氧乙酸、3.0%火堿、聚維碘等對養(yǎng)殖環(huán)境進(jìn)行消毒處理。有報道指出[5]，豬瘟弱毒疫苗在防治本病黏膜型病畜方面表現(xiàn)出良好的效能，具體在公牛配種前30d，母牛臨產(chǎn)前30d 各頭均肌肉注射10 頭份，而后每間隔10～12 個月注射1 次，小牛犢在1～3 月首免（3 頭份），6～8 月后再進(jìn)行免疫1 次。針對無病癥的養(yǎng)殖場，要定期采用血清學(xué)監(jiān)測方法進(jìn)行凈化，針對發(fā)病牛群及時進(jìn)行隔離治療，最好應(yīng)用撲殺方法，并且要予以無害化處置。在購置種牛、飼料過程中要加大檢查力度，尤其是跨區(qū)域、跨省運(yùn)調(diào)牛種，規(guī)避養(yǎng)殖區(qū)中出血病?；驇в蠦VDV 的牛。