王祎祎，汪沙，段華*

作為“基底膜內(nèi)陷”致病學說的直接證據(jù)[1-2]，目前普遍認為子宮腺肌病(adenomyosis,ADS)發(fā)生與有活性的在位內(nèi)膜向子宮肌層內(nèi)陷、生長，并異位增生、存活有關，尤其凸顯在位子宮內(nèi)膜細胞異常增殖與凋亡、黏附、侵襲等在ADS發(fā)生發(fā)展中的影響。環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)的異常表達可誘導腫瘤、心血管、神經(jīng)內(nèi)分泌等多種人類良惡性疾病發(fā)生[3]。Hsa_circ_PVT1(circPVT1)是位于癌癥易感基因座8q24的circRNA，已有眾多研究揭示其在胃癌、非小細胞肺癌、頭頸部鱗癌及急性淋巴細胞白血病等多種惡性腫瘤組織和細胞中過表達，以“癌基因”形式介導細胞增殖、侵襲、遷移等生物學行為，與腫瘤生長及轉(zhuǎn)移等過程密切相關[4]。然而，ADS在位內(nèi)膜在一定程度上呈現(xiàn)類似惡性腫瘤細胞的生物學特征，而circPVT1與ADS發(fā)生是否存在關聯(lián)，以及能否通過介導ADS內(nèi)膜細胞異常增殖、侵襲進而影響ADS的致病和表現(xiàn)，目前尚不清楚。本研究擬通過檢測circPVT1在ADS內(nèi)膜組織和細胞中的表達，分析其與ADS臨床特征的相關性，評價干擾circPVT1后ADS內(nèi)膜細胞增殖與侵襲力的變化，探討其在ADS發(fā)生發(fā)展中可能的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2018年6月至2019年2月于首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦科微創(chuàng)中心因ADS行全子宮切除術的45例患者入ADS組，ADS確診采用美國生育協(xié)會的病理診斷標準：據(jù)基底層子宮內(nèi)膜下至少一個低倍鏡(100倍)視野深處，可見子宮內(nèi)膜腺體與間質(zhì)。同期宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅲ級(cervical intraepithelial neoplasia Ⅲ，CINⅢ)或?qū)m頸癌IA1～IB1期行全子宮切除的患者45例入對照組。排除內(nèi)膜病變、絕經(jīng)和(或)年齡≥50歲、術前3個月激素類藥物應用史或?qū)m內(nèi)節(jié)育器置入史、合并嚴重內(nèi)外科疾病及盆腔炎癥性疾病、臨床病歷資料不完整者。入組病例均知情同意，本研究獲醫(yī)院倫理委員會批準。兩組一般情況比較詳見下頁表1。

1.2 實驗試劑

RNAisoPlusRNA提取試劑盒(TaKaRa,日本),PrimeScript RT試劑盒和SYBR Green PCR試劑盒(TaKaRa,日本)，DMEM/F12培養(yǎng)基(Hyclone,美國)、胎牛血清FBS(BD，美國)，CCK-8(Dojindo,日本)，transwell侵襲小室(Costar,美國)，慢病毒載體目的質(zhì)粒(吉凱基因，中國上海)，lipofectamine 3000(Invitrogen，美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 組織取材 手術室中離體子宮立即由專人無菌操作“Y”形剖開，刮取宮腔內(nèi)暴露的子宮內(nèi)膜組織5～10 g至無菌培養(yǎng)管(內(nèi)容5 mL的1%青鏈霉素的生理鹽水)用作原代子宮內(nèi)膜細胞分離培養(yǎng)，另留取內(nèi)膜組織于-80°C凍存，用于后續(xù)總RNA提取。

1.3.2 原代子宮內(nèi)膜上皮及間質(zhì)細胞分離培養(yǎng) 無菌PBS清洗離體子宮內(nèi)膜組織2～3遍后，組織剪剪碎至肉末狀，3～5倍體積的0.2%膠原酶I和0.005% DNA 酶振蕩消化45～60 min，100 um濾網(wǎng)過濾棄去殘渣，低速離心(760 rpm,3 min),40 um濾網(wǎng)過濾并收集濾液A，原沉淀以含10% FBS的DMEM/F12重懸獲得細胞懸液B，再次離心A和B(1 200 rpm，3 min)后棄去上清，B管沉淀重懸接種至6 cm2細胞培養(yǎng)皿；A管再次離心后沉淀重懸接種。置于37°C/5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞融合80%以上，1∶2消化傳代。對P1代細胞進行電鏡或免疫熒光鑒定，確定A、B來源細胞分別為子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞(endometrial stromal cells,ESC)和子宮內(nèi)膜上皮細胞(endometrium epithelial cell,EEC)。

表1 兩組患者臨床特征比較

1.3.3 qRT-PCR檢測circPVT1表達 按照試劑盒說明提取內(nèi)膜組織和細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,并進行PCR反應擴增。引物設計和合成由中國上海生工生物科技公司完成。相應引物序列如下：目的基因circPVT1上游序列：5′-CGACTCTTCCTGGTGAAGCATCGAT-3′，目的基因circPVT1下游序列：5′-TACTTGAACGAAGCTCCATGCAGC-3′；內(nèi)參基因GAPDH上游序列：5′-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3′,內(nèi)參基因GAPDH下游序列:5′-TAGCCCAGGATGCCCTTGAG-3′。采用2-ΔΔCT法計算相對表達量，獨立重復3次實驗。

1.3.4 細胞轉(zhuǎn)染和篩選 原代培養(yǎng)人ADS在位內(nèi)膜上皮細胞(ADS_EEC)及間質(zhì)細胞(ADS_ESC)并傳代培養(yǎng)至P2。向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染慢病毒載體目的質(zhì)粒sh-circPVT1及干擾陰性對照Sramble,同時每組設置正常培養(yǎng)未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞作為完全陰性對照組NC。轉(zhuǎn)染過程為：接種ADS_EEC和ADS_ESC于不同6 cm2細胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至細胞融合度達50%～60%時，按照lipofectamine 3000說明書操作，次日更換培養(yǎng)基，72 h后加入1μg/μL嘌呤霉素篩選并利用qRT-PCR技術對轉(zhuǎn)染效率進行驗證。

1.3.5 CCK-8細胞增殖實驗 細胞轉(zhuǎn)染72 h經(jīng)篩選后以4 000個/孔密度接種于96孔板，每孔設3個復孔，置于37°C/5% CO2的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h/48 h/72 h/96 h,更換培養(yǎng)基后每孔加入CCK-8試劑10 μL，培養(yǎng)箱中孵育1 h，酶標儀檢測每孔于450 nm處吸光度(OD值)。獨立重復實驗3次。

1.3.6 Transwell侵襲實驗 以無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基按1∶8稀釋基質(zhì)膠后，加入50 uL/孔于transwell上室，置于37°C培養(yǎng)箱鋪板30 min。轉(zhuǎn)染后的細胞以5×105個/孔密度接種至上室，并加入200 μL無血清DMEM/F12。下室加入600 μL含10% FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，以4%多聚甲醛固定下室細胞、并以0.1%結(jié)晶紫染色。倒置顯微鏡下隨機選擇5個視野觀察拍照。

1.4 視覺模擬評分及月經(jīng)失血評分圖評分標準

視覺模擬評分(visual analog scale，VAS)：0分為無痛；3分以下為輕度疼痛；4～6 分為中度疼痛；7～10 分為重度疼痛。月經(jīng)失血評分圖(Pictorial blood loss assessment chart,PBAC)：根據(jù)每條衛(wèi)生巾月經(jīng)血染面積及使用衛(wèi)生巾數(shù)量來計算，面積≤整個衛(wèi)生巾1/3計為1分，1/3～3/5計為5分，大于3/5計為10分。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 circPVT1在子宮腺肌病內(nèi)膜組織和細胞中的表達檢測

qRT-PCR結(jié)果顯示：與正常子宮內(nèi)膜組織(Con_En)相比，circPVT1的相對mRNA水平在ADS在位內(nèi)膜(ADS_Euc)及異位內(nèi)膜組織(ADS_Ec)中均顯著升高(P<0.001)，但ADS在位與異位內(nèi)膜組織相比，circPVT1表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見下頁圖1A；circPVT1在ADS_EEC及ADS_ESC中表達水平均高于正常內(nèi)膜上皮(Con_EEC)及間質(zhì)細胞(Con_ESC)(P<0.001)，并且其在ADS_ESC中的相對表達量要高于ADS_EEC(P<0.001)，見下頁圖1B。

2.2 circPVT1表達水平與子宮腺肌病患者痛經(jīng)程度及月經(jīng)量的關系

Pearson相關性分析結(jié)果顯示：circPVT1在ADS在位內(nèi)膜組織中的表達水平與患者PBAC評分呈中等程度正相關(r=0.539,P=0.017)；circPVT1在ADS異位內(nèi)膜的表達水平與患者痛經(jīng)程度VAS評分呈強正相關(r=0.614,P=0.009)。

2.3 干擾circPVT1表達后對子宮腺肌病內(nèi)膜上皮和間質(zhì)細胞增殖力的影響

在ADS內(nèi)膜上皮和間質(zhì)細胞中轉(zhuǎn)染sh-circPVT1后利用qRT-PCR作干擾效率驗證。結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染組(NC組)及轉(zhuǎn)染陰性對照組(Scramble組)相比，轉(zhuǎn)染sh-circPVT1后細胞內(nèi)circPVT1表達水平顯著下降，差異均有統(tǒng)計學意義，見圖2A。隨后CCK-8細胞增殖實驗結(jié)果顯示，干擾circPVT1表達(sh-circPVT1組)后的ADS_EEC和ADS_ESC增殖能力顯著低于未轉(zhuǎn)染組(NC組)和轉(zhuǎn)染陰性對照組(Scramble組)；NC組和Scramble組間比較，ADS_EEC及ADS_ESC細胞增殖活性均無明顯差異，見圖2B，2C；培養(yǎng)96 h后測得細胞活力百分比值在sh-circPVT1組顯著降低，見圖2D。

A．circPVT1在ADS和正常子宮內(nèi)膜組織中的表達；B.circPVT1在ADS和正常子宮內(nèi)膜上皮及間質(zhì)細胞中的表達。****P<0.0001;***P<0.001;**P<0.01;NSP>0.05。圖1 circPVT1在子宮腺肌病內(nèi)膜組織和細胞中的mRNA表達水平

A.qRT-PCR檢測ADS_EEC及ADS_ESC細胞轉(zhuǎn)染Sh-circPVT1后circPVT1表達水平，行轉(zhuǎn)染效率驗證；B．干擾circPVT1表達后ADS_EEC增殖OD值；C.干擾circPVT1表達后ADS_ESC增殖OD值；****P<0.0001;***P<0.001;**P<0.01;NSP>0.05。圖2 干擾circPVT1后子宮腺肌病內(nèi)膜細胞體外培養(yǎng)不同時間OD值(CCK8)及 96 h后細胞活力檢測

2.4 干擾circPVT1表達后對子宮腺肌病內(nèi)膜上皮和間質(zhì)細胞侵襲力的影響

Transwell侵襲小室實驗結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染circPVT1陰性對照組(Scramble組)相比，干擾組(sh-circPVT1組)侵襲穿透至下室的ADS_EEC顯著減少，提示干擾circPVT1表達后ADS_EEC侵襲能力減弱，見圖3A、3B(見彩插1)；類似地，干擾circPVT1表達后，ADS_ESC在sh-circPVT1組的侵襲能力較Scramble組亦顯著降低，見圖3C、3D(見彩插1)。

3 討論

3.1 子宮腺肌病發(fā)生與在位內(nèi)膜組織和細胞異常生物學行為改變

ADS的發(fā)生機制至今尚未完全闡明，目前普遍支持由有活性的在位子宮內(nèi)膜向肌層內(nèi)陷、侵襲生長，并異位增殖導致腺肌病發(fā)生，是為ADS本質(zhì)。近年來，隨著對ADS在位內(nèi)膜參與ADS致病機理研究的拓展和深入，發(fā)現(xiàn)ADS在位內(nèi)膜存在諸多分子和代謝異常，尤其突出表現(xiàn)為內(nèi)膜細胞增殖力強化、凋亡抵抗明顯，即認為在位內(nèi)膜細胞異常的增殖、凋亡是后續(xù)諸多生物學行為改變的基礎和前提[5-6]。大量研究證實，促進ADS在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞增殖、抑制其凋亡，可能誘導子宮內(nèi)膜向肌層異位種植的發(fā)生，并且細胞中呈現(xiàn)低表達的凋亡相關基因GRIM-19可通過抑制STAT3磷酸化誘導血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)合成，促進內(nèi)膜組織中生成新生血管，進一步為ADS病灶的異位存活、生長提供物質(zhì)基礎[7]。另一方面，在位內(nèi)膜細胞的局部黏附、遷移、侵襲能力增強則是ADS內(nèi)膜向子宮肌層浸潤生長的關鍵環(huán)節(jié)。本課題組前期研究顯示局部黏著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)在ADS內(nèi)膜組織和細胞中表達均上調(diào)，并進一步揭示其可能通過增強在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞的侵襲力參與ADS發(fā)生[8-9]。

3.2 環(huán)狀RNA介導子宮腺肌病在位內(nèi)膜致病機理的潛在可能

circRNA為缺乏5’3’末端的連續(xù)共價閉環(huán)，80%以上來源于基因反向剪接的外顯子。由于其環(huán)狀閉合結(jié)構的可靠穩(wěn)定性、豐度高、種類多、時空特異性表達、序列高度保守等特性[10-11]，使其在RNA研究領域顯出獨有優(yōu)勢。在婦科領域，circRNA與多種女性生殖系統(tǒng)疾病關聯(lián)密切[12]，包括：與宮頸癌HPV感染致病相關、通過miRNA-靶基因軸調(diào)節(jié)宮頸癌細胞的生物學行為、影響宮頸癌細胞的放療抵抗過程；介導卵巢癌發(fā)生發(fā)展的生物學調(diào)控、作為卵巢癌預后的評估指標；參與子宮內(nèi)膜癌的早期診斷；以及作用子宮內(nèi)膜蛻膜化過程、改變內(nèi)膜容受性、介導女性不孕癥發(fā)生等。近年來，國內(nèi)外學者在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosos,EMs)中初步構建了circRNA差異化表達模式及相關調(diào)控網(wǎng)絡，并分析EMs內(nèi)膜中表達失調(diào)的circ_103470、circ_101102等通過mTOR 、Hippo、HIF-1等多條信號通路影響EMs發(fā)生[13-15]。ADS在發(fā)病機制和疾病特點等方面與EMs存在共通之處，但circRNA與ADS病因病機的相關研究罕有報道。本研究利用qRT-PCR技術揭示了circPVT1在ADS與正常子宮內(nèi)膜組織和細胞中的差異化表達模式，并進一步分析提示ADS內(nèi)膜中高表達的circPVT1與患者典型臨床特征痛經(jīng)程度、月經(jīng)量異常密切相關，結(jié)果初步表明環(huán)狀RNA這一類非編碼家族新成員可能介導ADS的致病機理，并影響疾病進展或轉(zhuǎn)歸的潛在可能。

3.3 干擾circPVT1表達可抑制子宮腺肌病在位內(nèi)膜細胞異常增殖與侵襲

CircPVT1是源自漿細胞瘤多樣異位基因1(plasmacytoma variant translocation,PVT1)的外顯子-2剪接形成的環(huán)狀RNA，在胃癌、肝細胞癌、非小細胞肺癌、骨肉瘤、頭頸部鱗癌、淋巴細胞白血病等多種人類惡性腫瘤組織中表達升高，發(fā)揮“癌基因”作用，通過靶向多種miRNA介導腫瘤細胞異常增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過程，其本身的轉(zhuǎn)錄合成可受經(jīng)典的TP53-YAP-TEAD復合體靶向正調(diào)節(jié)[16-18]。此外，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在ADS中呈現(xiàn)異常表達的miR-let7b也被證實可受circPVT1負調(diào)控，介導衰老抑制因子表達，延緩細胞衰老與凋亡[19-20]。本研究在對circPVT1組織表達水平檢測的基礎上，進一步利用體外培養(yǎng)的人ADS在位內(nèi)膜上皮和間質(zhì)細胞，對細胞內(nèi)的circPVT1表達進行干預，結(jié)果顯示ADS內(nèi)膜細胞的增殖明顯受抑，侵襲力也顯著降低，提示circPVT1可在體外調(diào)控ADS在位內(nèi)膜細胞異常增殖與侵襲，這可能是其介導子宮內(nèi)膜向肌層浸潤、增生及異位存活的關鍵環(huán)節(jié)之一。

綜上所述，環(huán)狀RNA circPVT1在ADS內(nèi)膜組織和細胞中的表達水平均升高，可能通過介導ADS在位內(nèi)膜上皮及間質(zhì)細胞異常增殖、侵襲參與ADS致病機制，并與ADS患者的痛經(jīng)程度和月經(jīng)量改變等臨床特征密切相關，因而有可能成為ADS診斷的新型標志物和潛在干預靶標。但是，ADS的發(fā)生是涉及多因素、多環(huán)節(jié)的復雜過程，有關circPVT1在ADS疾病進程中的確切作用和具體機制仍需更多的后續(xù)研究闡明。