成良強(qiáng)， 饒慶琳， 呂建偉， 胡廷會(huì)，黃 莉， 姜 敏， 王金花， 劉 念，王 軍*，姜慧芳

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 油料研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 油料作物研究所/農(nóng)業(yè)部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430062)

0 引言

花生是我國(guó)重要的油料和經(jīng)濟(jì)作物，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年我國(guó)花生種植面積463.3萬(wàn)hm2，僅次于印度，占世界種植面積的17%；莢果平均單產(chǎn)250.1 kg/667m2，約為世界平均單產(chǎn)的2.3倍；總產(chǎn)1 733.2萬(wàn)t，居世界首位，約占全世界花生總產(chǎn)的40%[1-3]?；ㄉN植區(qū)域廣泛，我國(guó)大部分地區(qū)均有種植。根據(jù)播種時(shí)節(jié)的不同可以分為春播花生和夏播花生，我國(guó)春播花生種植分布在東北三省、西北地區(qū)、西南地區(qū)和華南地區(qū)；黃淮海地區(qū)主要種植夏播花生。研究顯示，春播花生播種期受倒春寒等低溫冷害后花生生長(zhǎng)變緩、干物質(zhì)積累減少，輕則導(dǎo)致花生生長(zhǎng)出苗慢、根系活力降低、主根側(cè)根減少、出苗期變長(zhǎng)，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致花生爛種、喪失發(fā)芽力從而降低出苗率，進(jìn)而影響產(chǎn)量[4-8]。耐低溫性成為花生種植考慮的關(guān)鍵因子。為花生耐低溫性鑒定方法的選擇及其耐低溫花生種質(zhì)的篩選提供參考，從花生種質(zhì)耐低溫表型鑒定研究方法、花生種質(zhì)耐低溫相關(guān)的生理生化指標(biāo)變化、花生種質(zhì)耐低溫相關(guān)的分子生物學(xué)研究進(jìn)展和耐低溫花生種質(zhì)資源等方面進(jìn)行綜述，并提出下一步研究方向。

1 花生種質(zhì)耐低溫表型鑒定方法

1.1 種子吸脹期耐低溫鑒定

封海勝[9]對(duì)380份花生資源采用冷浸處理、溫水浸種和半冷浸處理3種方式模擬低溫處理，以種子發(fā)芽率和胚根長(zhǎng)度為指標(biāo)考察花生耐低溫性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：同一品種花生種子吸脹期間遇6℃持續(xù)24 h低溫，發(fā)芽率明顯降低，胚根伸長(zhǎng)長(zhǎng)度均受影響，種子活力下降；而所有經(jīng)溫水預(yù)浸后再受2℃、72 h低溫脅迫的種子發(fā)芽率、出苗率與對(duì)照無(wú)異，說(shuō)明溫水可以起到良好的防護(hù)作用；不同品種類(lèi)型差異較大，多粒型和中間型品種吸脹期間較抗低溫，該研究得出花生吸脹期耐低溫種質(zhì)鑒定參考低溫為2℃。劉海龍等[10]對(duì)94份花生種子采用2℃冷浸48 h后置于25℃恒溫層析柜進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，以未進(jìn)行冷浸的種子為對(duì)照，并以相對(duì)發(fā)芽率(冷浸種子發(fā)芽率/正常種子發(fā)芽率)為指標(biāo)判斷花生耐低溫性，即相對(duì)發(fā)芽率≥85%為耐低溫，相對(duì)發(fā)芽率<50%為敏感型，相對(duì)發(fā)芽率在50%～85%為中間型，該結(jié)論在花生耐低溫實(shí)驗(yàn)室鑒定方面建立了以相對(duì)發(fā)芽率為指標(biāo)的具體判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 種子出苗期耐低溫鑒定

呂建偉等[11]利用157份花生種質(zhì)資源連續(xù)2年采用低溫期(氣溫10～12℃)和正常期(氣溫≥13℃)分期播種，以出苗率、相對(duì)出苗率(低溫期播種出苗率/正常期播種出苗率)為耐低溫種質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行苗期耐低溫鑒定，相對(duì)出苗率能夠區(qū)分不同花生資源的出苗率，并建立了相對(duì)出苗率為80%的花生種質(zhì)資源耐低溫4級(jí)鑒定標(biāo)準(zhǔn)，即不耐低溫、耐低溫、中耐低溫和高耐低溫，其中相對(duì)出苗率≤80%的為不耐低溫，80%<相對(duì)出苗率≤90%的為低耐低溫，90%<相對(duì)出苗率≤95%的為中耐低溫，相對(duì)出苗率>95%的為高耐低溫。王傳堂等[12-13]對(duì)18份高油酸花生品系采用春季分期(4月13日、4月16日、4月19日)播種方式，通過(guò)生育期積溫、出苗指數(shù)(出苗數(shù)/播種后天數(shù))、子仁產(chǎn)量、品質(zhì)等指標(biāo)綜合篩選耐低溫高油酸花生種質(zhì)資源，初步建立了在田間自然條件不間斷低溫高濕條件下耐低溫高油酸花生的篩選方法，將出苗率比對(duì)照普通油酸花生高且達(dá)60%、始苗積溫比普通油酸花生低的高油酸種質(zhì)篩選出來(lái)，間接證實(shí)了春播花生低溫地區(qū)種植高油酸花生可行，生產(chǎn)上在考慮日均溫度同時(shí)要兼顧最低溫度。王晶珊等[14]利用519份材料進(jìn)行分期播種試驗(yàn)，分析花生吸脹萌動(dòng)期對(duì)低溫的響應(yīng)結(jié)果表明，參試花生種質(zhì)對(duì)低溫的反應(yīng)分為4種類(lèi)型，其中低溫傷害型占3.5%，多為珍珠豆型、龍生型和普通型，這類(lèi)花生種子吸脹萌動(dòng)期遇到低溫容易喪失活力造成爛種；低溫延遲型占60%，多為普通型，種子吸脹萌動(dòng)期低溫會(huì)延遲其出苗，有活力；中間型占29.5%，多為普通型和龍生型，介于上述兩種類(lèi)型之間；抗低溫型約占5%，涵蓋多粒型、珍珠豆型、龍生型和普通型。

2 花生種質(zhì)耐低溫生理生化指標(biāo)測(cè)定

2.1 耐低溫生理生化指標(biāo)

作物本身就有一套防御系統(tǒng)，當(dāng)受到低溫脅迫時(shí)，作物大量積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和激素物質(zhì)，以減少低溫對(duì)其傷害[15-18]。有研究[4,6,19]表明，花生種質(zhì)經(jīng)低溫脅迫后，會(huì)發(fā)生一系列生理生化指標(biāo)變化，其中光合作用因葉片光反應(yīng)中心關(guān)閉受阻，重要的逆境生理抗氧化物歧化酶SOD活性升高，膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物丙二醛MDA和葉片電導(dǎo)率增加，膜透性增加，逆境脅迫下細(xì)胞中積累最多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸大量積累。 陳小姝等[4]以11個(gè)花生品種為材料,5℃低溫脅迫72 h,測(cè)定脅迫前后花生幼苗葉綠素(SPAD)、光和參數(shù)等15個(gè)生理指標(biāo)，通過(guò)單一指標(biāo)進(jìn)行主成分分析等方法篩選出凈光合速率、實(shí)際光化學(xué)效率、最大光化學(xué)效率、光化學(xué)淬滅系數(shù)、可溶性蛋白、過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫酶7個(gè)與耐低溫鑒定密切相關(guān)的指標(biāo)，在相同低溫處理時(shí)可通過(guò)測(cè)定7個(gè)指標(biāo)對(duì)花生品種耐低溫能力進(jìn)行快速鑒定和預(yù)測(cè)。鐘鵬等[6]對(duì)4個(gè)花生品種種子萌發(fā)期和3葉期耐低溫性測(cè)定，測(cè)定不同溫度處理下花生葉片相對(duì)膜透性(RMP)、游離脯氨酸(Pro)、可溶性糖(SS)和可溶性蛋白(SP)、丙二醛(MDA)含量，超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低溫9℃脅迫時(shí)，與抗寒性相關(guān)的指標(biāo)電解質(zhì)滲透率(RMP)、可溶性物質(zhì)(Pro、SS、SP)以及抗氧化酶活性(SOD、POD、CAT)均上升；MDA活性在低溫9～15℃脅迫時(shí)增加，說(shuō)明低溫脅迫下這些物質(zhì)對(duì)種子起保護(hù)作用。

2.2 萌發(fā)期測(cè)定

姜玉晴[20]利用2個(gè)花生種質(zhì)資源進(jìn)行種子萌發(fā)期低溫脅迫試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，花生種子萌發(fā)期受低溫脅迫后其露白率、發(fā)芽勢(shì)等種子活力明顯下降，丙二醛(MDA)和脯氨酸含量上升；經(jīng)1%濃度過(guò)氧化氫(H2O2)浸種8 h后，MDA和脯氨酸含量下降，說(shuō)明1%過(guò)氧化氫浸種8 h處理能夠顯著增強(qiáng)花生種子耐低溫能力，從而抵御低溫脅迫。朱利君等[21-22]研究證實(shí)，黃瓜和黑豆遭受溫脅迫后經(jīng)過(guò)氧化氫處理可增強(qiáng)其耐低溫能力。

2.3 苗期測(cè)定

VACU等[23]進(jìn)行18個(gè)基因型花生種質(zhì)資源苗期低溫脅迫試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫處理后所有基因型的脯氨酸、丙二醛(MDA)和過(guò)氧化物酶(POD)含量均增加，而葉綠素含量均減少，且花生對(duì)低溫脅迫的反應(yīng)隨植物生長(zhǎng)階段的不同而有所區(qū)別。常博文等[24]利用30個(gè)花生品種進(jìn)行苗期低溫脅迫試驗(yàn)，在3片真葉全展開(kāi)后進(jìn)行4℃低溫處理和不同濃度赤霉素GA3處理，測(cè)定其發(fā)芽指數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GA3能普遍性顯著緩解低溫對(duì)花生幼苗生長(zhǎng)抑制。

3 花生種質(zhì)耐低溫分子生物學(xué)研究

3.1 花生耐低溫分子標(biāo)記

白冬梅等[18]用多態(tài)性好的 90對(duì) SSR引物評(píng)價(jià)不同耐寒性花生品種發(fā)現(xiàn),參試品種遺傳多樣性存在較大差異,在遺傳距離為 0.4時(shí),被聚類(lèi)為三大類(lèi)群，說(shuō)明SSR標(biāo)記在花生耐寒性狀評(píng)價(jià)中具有較好的多態(tài)性。劉海龍等[25]利用耐低溫程度差異較大的“花3號(hào)×中花6號(hào)”構(gòu)建的187個(gè)雜交后代RIL群體，成功構(gòu)建一張包含325個(gè)標(biāo)記、覆蓋20個(gè)連鎖群、總長(zhǎng)度為1493.79cM、標(biāo)記間平均距離4.60 cM的栽培種花生遺傳圖譜，并利用WinQTLcart2.0軟件共檢測(cè)出10個(gè)與耐低溫相關(guān)的數(shù)量性狀基因座位(QTL)；在2個(gè)耐低溫表型鑒定環(huán)境中重復(fù)檢測(cè)到4個(gè)主效QTL，分別為QTqLTTLG1-1、qLTTLG1-2、qLTTLG6-1和qLTTLG7-1，可用于耐低溫標(biāo)記輔助育種。

3.2 花生耐低溫基因

王秀貞等[26]利用差異表達(dá)基因檢測(cè)方法研究花育44號(hào)常溫和低溫下差異表達(dá)基因，獲得芽期耐低溫相關(guān)特異表達(dá)基因2個(gè)及其中之一的基因片段ACP20及完整編碼區(qū)，ACP20基因與花生油質(zhì)蛋白基因同源性達(dá)99%，與SHIMADA 等[27-28]在擬南芥上研究發(fā)現(xiàn)的油質(zhì)蛋白具有保持核結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的分子功能，使得種子在低溫脅迫下正常萌發(fā)，從而抵御寒冷傷害的研究結(jié)果類(lèi)似；而第2個(gè)基因ACP2基因與花生耐低溫相關(guān)是首次發(fā)現(xiàn)。薛曉夢(mèng)等[29]探究與高油酸性狀密切相關(guān)的2對(duì)Δ12脂肪酸脫氫酶基因(fattyaciddesaturase2,FAD2)在花生低溫響應(yīng)中的作用，從普通油酸花生中花16和高油酸花生中花413中克隆得到花生AhFAD2基因家族的全部基因，共7個(gè)，發(fā)現(xiàn)在低溫脅迫種子萌發(fā)過(guò)程中，AhFAD2-1A/B和AhFAD2-4A/B基因均受低溫誘導(dǎo)表達(dá)，而在高油酸材料中，基因AhFAD2-1A/B和基因AhFAD2-4A/B的響應(yīng)速度均快于普通油酸材料，表達(dá)量上調(diào)的倍數(shù)也比在普通油酸材料中多，特別AhFAD2-4A/B基因在高油酸材料受到低溫脅迫時(shí)始終維持在高水平表達(dá)，推測(cè)其高水平的表達(dá)部分彌補(bǔ)了突變的AhFAD2-1A/B基因的功能。

4 耐低溫花生種質(zhì)資源篩選

國(guó)內(nèi)研究者在花生萌發(fā)期與苗期篩選鑒定了多個(gè)耐低溫花生種質(zhì)資源。封海勝[9]利用種子吸脹期間耐低溫鑒定方法篩選出花37和花32等耐低溫材料。王傳堂等[12]篩選出花生高油酸種質(zhì)資源18S14、18L64和 18L46、18S5等耐低溫材料。劉海龍等[10,25]篩選出花生資源山花8號(hào)、豫花1號(hào)、開(kāi)農(nóng)30、白沙1016、油4、泉花646共6個(gè)耐低溫材料及QT1737、QT1838、QT185、QT1862、QT1770、QT1836、QT1848、QT1856、QT1857、QT1859共10份花生群體材料。呂建偉等[11]通過(guò)苗期鑒定篩選出臺(tái)山珍珠、鄂花3號(hào)、山花9號(hào)、開(kāi)農(nóng)8598、桂花17、海花1號(hào)、豫花9號(hào)、黔花生1號(hào)、豫花10號(hào)、濮科花1號(hào)、桂花836、開(kāi)農(nóng)白2號(hào)共12個(gè)花生耐低溫種質(zhì)資源。這些耐低溫花生種質(zhì)為高產(chǎn)、耐逆新品種的選育提供了良好的材料基礎(chǔ)，有的品種如黔花生1號(hào)、豫花9號(hào)[30-31]已在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)廣泛推廣。

花生耐低溫性狀是重要的性狀，目前，研究者建立了花生種子吸脹期和苗期耐低溫鑒定方法，同時(shí)篩選出較多耐低溫種質(zhì)，為花生產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了基礎(chǔ)種質(zhì)保障。但在花生吸脹期及苗期耐低溫鑒定中，重復(fù)鑒定一致的材料較少，可能與不同研究者利用花生資源有關(guān)。因此，減少環(huán)境因素干擾而篩選快速穩(wěn)定有效的分子標(biāo)記進(jìn)行高通量鑒定耐低溫花生種質(zhì)資源是將來(lái)重要手段，并且近年來(lái)花生栽培種、野生種的全基因組測(cè)序取得的重要進(jìn)展[32-34]，為耐低溫基因定位、關(guān)鍵分子標(biāo)記的篩選提供了便利。今后可根據(jù)成熟的表型、生理生化和功能分子標(biāo)記相結(jié)合的鑒定方法對(duì)花生耐低溫性進(jìn)行更深入的研究，從而對(duì)春花生種植區(qū)的耐低溫育種奠定基礎(chǔ)。