植物微核技術(shù)監(jiān)測(cè)土壤農(nóng)藥污染研究

李文義，方睿霞，尹鵬宇，楊 志，高云濤，熊華斌，李曉芬，劉滿紅

(1.云南民族大學(xué) 民族藥資源化學(xué)國(guó)家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500；2.云南民族大學(xué) 云南省跨境民族地區(qū)生物質(zhì)資源清潔利用國(guó)際聯(lián)合研究中心，云南 昆明 650500)

土壤環(huán)境質(zhì)量與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量、人類健康及經(jīng)濟(jì)社會(huì)的可持續(xù)發(fā)展息息相關(guān)，是生態(tài)文明建設(shè)的重要內(nèi)容[1-3].土壤是農(nóng)藥在環(huán)境中的“儲(chǔ)存地”，使用在農(nóng)田中的農(nóng)藥絕大部分殘留在土壤環(huán)境介質(zhì)中，導(dǎo)致相關(guān)污染物在土壤環(huán)境中的逐步富集.農(nóng)藥殘留的增加不僅使病蟲(chóng)害的抗性增強(qiáng)，迫使農(nóng)藥的使用量愈來(lái)愈大，環(huán)境的污染也愈來(lái)愈嚴(yán)重，且使農(nóng)作物和食品中的殘留量劇增，對(duì)人類的健康造成威脅[4].

微核(micronucleus，MCN)是指大小小于主核1/3的圓形或橢圓形的核小體，其位于細(xì)胞質(zhì)中獨(dú)立于主核[5]，由于環(huán)境因子干擾使染色體發(fā)生斷裂或丟失，細(xì)胞進(jìn)入下一次分裂時(shí)斷裂的染色體沒(méi)有著絲點(diǎn)，游離在細(xì)胞質(zhì)中，不能隨有絲分裂進(jìn)入子細(xì)胞，從而形成大小不等的小核[6].可通過(guò)觀察并統(tǒng)計(jì)微核的數(shù)量，計(jì)算其微核率以此評(píng)估環(huán)境污染導(dǎo)致染色體畸變的程度，間接地體現(xiàn)環(huán)境污染的程度.該技術(shù)測(cè)定的是細(xì)胞染色體受損傷的程度，更接近于污染物對(duì)生物和人類的危害情況.以植物微核技術(shù)監(jiān)測(cè)環(huán)境污染, 具有操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性強(qiáng)，具有較強(qiáng)的實(shí)用性[7-8].微核的應(yīng)用近年來(lái)已有部分研究[9-13]，但目前微核技術(shù)技術(shù)尚未普及和發(fā)揮其應(yīng)有的作用，特別是監(jiān)測(cè)土壤污染的技術(shù)本身也待完善.

近年來(lái)，隨著土壤污染的加劇，國(guó)家對(duì)土壤環(huán)境保護(hù)、土壤環(huán)境監(jiān)測(cè)逐步加強(qiáng)[14].土壤污染通常具有復(fù)合污染的特點(diǎn),但現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中監(jiān)測(cè)污染物的數(shù)量不足，尤其有機(jī)污染物數(shù)量過(guò)少[15]，土壤環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測(cè)的評(píng)價(jià)及分析方法等技術(shù)體系尚不健全[16-17].利用微核土壤環(huán)境監(jiān)測(cè)的相關(guān)研究較少，且未對(duì)土壤中農(nóng)藥監(jiān)測(cè)形成較好的相關(guān)性分析及評(píng)價(jià)系統(tǒng)，本文擬利用植物微核技術(shù)監(jiān)測(cè)分析農(nóng)藥土壤污染，并將微核監(jiān)測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，以期為土壤污染監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)提供參考.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

可自動(dòng)拍照光學(xué)顯微鏡、分析天平、恒溫培養(yǎng)室.

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

蠶豆(昆明呈貢農(nóng)資市場(chǎng))、15 cm培養(yǎng)皿、70%啶蟲(chóng)脒(Acetamiprid)、甲醇、冰醋酸、濃HCl(均為分析純)、鹽酸(6 mol/L)、卡諾氏固定液、醋酸洋紅染色液、姬姆薩染液、改良苯酚品紅染液、卡諾氏固定液(甲醇和冰醋酸體積比為3∶1).

1.3 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.3.1 蠶豆浸種催芽

選擇大小均勻、無(wú)質(zhì)變的飽滿蠶豆，洗凈后用純水常規(guī)浸種、催芽 36 h，使蠶豆充分吸水膨脹，每間隔 12 h 換一次水.之后將蠶豆置于 16 ℃(蠶豆發(fā)芽的最適溫度)的恒溫培養(yǎng)室中培養(yǎng) 24 h，再繼續(xù)用蒸餾水培養(yǎng)使其長(zhǎng)出 1.0 cm 左右的初生根.

1.3.2 染毒液配制

根據(jù)啶蟲(chóng)脒(Acetamiprid)的使用方法(在50～100 mg/L 的濃度下，可有效地防治棉蚜，菜蚜、桃小食心蟲(chóng)等，以 500 mg/L 濃度施藥可防治光潛蛾、桔潛蛾以及梨小食心蟲(chóng)等，并可殺卵)，實(shí)驗(yàn)使用 200 mL 溶劑，稱取啶蟲(chóng)脒不同質(zhì)量并配制成5個(gè)不同質(zhì)量濃度的染毒液，即：0、35.71、71.43、285.71、714.29 mg/L，亦即：0、35.71、71.43、285.71、714.29 mg/300 g土,其中 0 mg/L 是使用蒸餾水作為陰性對(duì)照(CK).

1.3.3 土壤染毒

將各濃度的染毒液，定量、均勻地噴灑到經(jīng) 2 mm 過(guò)篩處理后的 300 g 土壤中，將濕團(tuán)與細(xì)土揉勻，置于 15 cm 培養(yǎng)皿中，平衡處理 12 h 以上待用.

1.3.4 蠶豆染毒及修復(fù)培養(yǎng)

分別選取胚芽發(fā)育良好(根尖長(zhǎng)短、粗細(xì)一致)的蠶豆栽種于培養(yǎng)皿中，染毒18、24、48和 72 h 后，然后用蒸餾水沖洗干凈，并用蒸餾水浸洗3次，每次 3 min，在室溫下用蒸餾水進(jìn)行修復(fù)培養(yǎng)12～24 h.

1.3.5 制片及鏡檢

1) 取材及固定 用剪刀剪下染毒后的蠶豆 1 cm 根尖，再用蒸餾水洗凈根尖，用新配卡諾氏固定液固定2～24 h，使細(xì)胞的分裂處于停滯狀態(tài).

2) 解離 用蒸餾水浸洗固定好的根尖2 次，然后根尖用 6 mol/L 的鹽酸解離15～30 min.

3) 制片 將解離后的蠶豆根尖用蒸餾水浸沒(méi)幼根3 次，每次 2 min，切取1～2 mm 蠶豆根尖置于載玻片上，加2滴醋酸洋紅染色液，染色 15 min，蓋上蓋玻片，覆一層吸水紙，常規(guī)壓片.

通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)可得，當(dāng)蠶豆染毒時(shí)間達(dá)到 72 h 時(shí)，蠶豆根尖出現(xiàn)萎蔫的情況.考慮此情況，染毒18、24和 48 h 時(shí)選取根尖和靠近根尖的部位制片觀察，而染毒 72 h 時(shí)均選取靠近根尖的部位制片觀察.

4) 鏡檢 首先在低倍鏡下找到分生組織細(xì)胞分散均勻，分裂相對(duì)較多的部位，再轉(zhuǎn)至高倍鏡觀察.

圖1 蠶豆根尖細(xì)胞微核

每個(gè)根尖計(jì)數(shù) 1 000 個(gè)細(xì)胞中的微核數(shù)并進(jìn)行記錄，測(cè)定其微核千分率MCN‰.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同染毒時(shí)間蠶豆根尖長(zhǎng)勢(shì)情況

在 23 ℃ 時(shí),蠶豆細(xì)胞周期為 18 h.將蠶豆染毒18、24、48和 72 h，由表1可知，18～48 h 蠶豆根尖長(zhǎng)勢(shì)良好，蠶豆染毒達(dá)到 72 h 時(shí)，蠶豆根尖出現(xiàn)萎蔫的情況.染毒作用對(duì)蠶豆根尖影響較影響.

表1 4個(gè)染毒時(shí)間蠶豆根尖長(zhǎng)勢(shì)情況

2.2 不同染毒時(shí)間采用不同部位制片的微核率

通過(guò)在同一濃度和時(shí)間培養(yǎng)蠶豆根尖采用根尖與靠近根尖部位制片，MCN‰產(chǎn)生基本相同.蠶豆經(jīng)啶蟲(chóng)脒同一濃度土壤染毒18、24和 48 h 后，MCN‰隨染毒時(shí)間的增長(zhǎng)而增大.在同一染毒時(shí)間下經(jīng)不同濃度的土壤染毒，MCN‰隨濃度的升高而增大，且MCN‰均有明顯的升高.

當(dāng)染毒時(shí)間達(dá)到 72 h 時(shí)，蠶豆根尖出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象，故使用靠近根尖部位制片觀察.由表2可知，蠶豆通過(guò)染毒 72 h 后微核率隨著啶蟲(chóng)脒在土壤中的濃度增大而逐漸增大.

表2 蠶豆染毒18、24、48、72 h微核率

圖2 啶蟲(chóng)脒不同濃度、不同染毒時(shí)間對(duì)蠶豆根尖的誘變效應(yīng)

綜上所述，蠶豆微核率隨染毒時(shí)間的增長(zhǎng)而增大.在同一染毒時(shí)間下經(jīng)不同濃度的土壤染毒，MCN‰隨濃度的升高而增大.染毒時(shí)間18～48 h 的蠶豆，使用根尖和靠近根尖部位制片觀察所得到的微核率差別不大，說(shuō)明經(jīng)過(guò)土壤染毒誘使根尖部位和最靠近根尖部位產(chǎn)生微核的機(jī)率基本相同.

3 結(jié)語(yǔ)

蠶豆隨農(nóng)藥土壤處理時(shí)間的增長(zhǎng)，蠶豆微核率呈增長(zhǎng)趨勢(shì).當(dāng)蠶豆染毒時(shí)間達(dá)到 72 h 時(shí)，蠶豆根尖出現(xiàn)萎蔫的情況.因此，監(jiān)測(cè)中蠶豆根尖染毒時(shí)間為18～72 h 為宜.蠶豆微核率隨染毒時(shí)間的增長(zhǎng)而增大.在同一染毒時(shí)間下經(jīng)不同濃度的土壤染毒，MCN‰隨濃度的升高而增大.因此，使用啶蟲(chóng)脒處理蠶豆產(chǎn)生的MCN‰隨著染毒液濃度的增大和染毒時(shí)間的增長(zhǎng)，MCN‰均有明顯的升高，表明啶蟲(chóng)脒對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞具有較強(qiáng)的誘變效應(yīng).經(jīng)過(guò)土壤染毒誘使根尖部位和最靠近根尖部位產(chǎn)生微核的機(jī)率基本相同.