何葉梅綜述,歐三桃審校

0 引 言

血管鈣化并非鈣磷結晶在血管壁的被動沉積，而是經(jīng)過多種分子信號傳導途徑啟動和調(diào)節(jié)的主動過程，類似于骨的礦化，是慢性腎病(chronic kidney disease,CKD)、衰老、動脈粥樣硬化、糖尿病等疾病中的普遍病理現(xiàn)象，與增高的心血管疾病發(fā)病率和死亡率密切相關[1-2]。而CKD患者發(fā)生血管鈣化的病理生理機制十分復雜，目前尚未完全明確。而近年來研究發(fā)現(xiàn)，硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate,IS)可通過誘導血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)表型轉化、誘導細胞凋亡、自噬、破壞鈣化平衡等機制參與血管鈣化的發(fā)生，而降低血中IS水平，有望改善CKD患者并發(fā)心血管疾病不良事件的結局。因此，本文就IS與血管鈣化的關系的研究進展作一綜述。

1 IS概述

腸道菌群是人體重要的組成部分，在調(diào)節(jié)機體免疫和代謝方面發(fā)揮重要的作用，正常的腸道菌群可保護腎功能，清除體內(nèi)毒素。而CKD患者由于存在飲食變化、高尿酸水平、磷結合劑等藥物的使用等因素，易出現(xiàn)腸道菌群失調(diào)，從而導致尿毒癥毒素的蓄積[3]。尿毒癥毒素的積累被認為是CKD嚴重后果的關鍵因素，目前已發(fā)現(xiàn)的尿毒癥毒素有 130 多種[4]，其中由腸道細菌的代謝產(chǎn)物生成的毒素稱為腸源性尿毒癥毒素，主要包括IS、吲哚-3乙酸、三甲胺-N-氧化物(TMAO)和對甲酚硫酸鹽(PCS)等，IS是當前研究最多的腸源性尿毒癥毒素之一[5]。研究表明，IS是食物中色氨酸被腸道菌群分解并經(jīng)過肝代謝后生成的，90%以上的IS 與血漿白蛋白結合，然后通過有機陰離子轉運蛋白 (organic anion transporter,OAT) OAT-1和OAT-3被腎小管細胞攝取, 由腎小管分泌，隨尿液排出[6]。CKD患者隨著腎功能進展，腎小球濾過率下降，IS排泄減少，從而在體內(nèi)蓄積。有研究顯示，在CKD2 期和3期即可出現(xiàn)循環(huán)IS水平的增加，CKD患者的游離型IS平均濃度可高達3. 22 mg/L[7]。IS 的毒性作用目前已得到廣泛證實，有研究發(fā)現(xiàn)IS的血清水平與腎功能呈負相關，與主動脈鈣化和心血管死亡率呈正相關[8]。IS可通過氧化應激、加速細胞衰老和激活炎癥反應等機制參與腎損傷，并參與CKD患者腎性骨病、血管鈣化、腎性貧血等并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。

2 血管鈣化概述

血管鈣化是鈣、磷以羥基磷灰石的形式在血管壁發(fā)生異位沉積的病理現(xiàn)象，類似于骨的形成過程，是造成CKD患者心血管損害的一個關鍵環(huán)節(jié)[9]。臨床上VC分為內(nèi)膜鈣化及中膜鈣化。內(nèi)膜鈣化是內(nèi)膜增生伴富含脂質的巨噬細胞浸潤所致的一種動脈粥樣硬化性病變。而中膜鈣化主要表現(xiàn)為羥基磷灰石晶體鈣在動脈中膜的彈力層連續(xù)線樣沉積[10-11]。 中膜鈣化在CKD患者中最常見，其患病率和嚴重程度與腎衰竭的進展平行。當CKD患者合并存在血管和(或)心臟瓣膜鈣化時，其心血管疾病風險將被列為最高級別，這表明血管鈣化危害巨大。VC發(fā)生機制復雜，VSMC表型轉化、氧化應激反應、炎癥反應、細胞凋亡、基質囊泡產(chǎn)生、鈣化抑制因子減少等因素都可促使細胞外基質發(fā)生礦物質沉積，導致VC的發(fā)生。而研究發(fā)現(xiàn)腸道微生物群衍生的尿毒癥毒素如IS等非傳統(tǒng)因素在促進血管鈣化的發(fā)生發(fā)展中有重要作用。

3 IS通過多種機制促進血管鈣化

3.1 促進VSMC發(fā)生表型轉化目前認為血管鈣化的核心環(huán)節(jié)是VSMC向成骨樣細胞轉化[12]。當VSMC發(fā)生成骨型或軟骨型分化時,其收縮型標志蛋白α-平滑肌肌動蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA)表達降低,而骨相關因子runt相關轉錄因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)、骨橋蛋白(osteopontin,OPN)和骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)等成骨相關蛋白表達增加[13]。

有研究證實，IS可通過誘導人主動脈平滑肌細胞 (human aortic smooth muscle cell,HASMC)中NF-κB活性增加發(fā)揮促血管鈣化作用，使用PI3K/Akt 通路的特異性抑制劑后可觀察到NF-κB 的激活明顯減弱，同時抑制了HASMC 的成骨轉分化，這些結果表明 PI3K/Akt/NF-κB信號通路在IS誘導的成骨轉分化的發(fā)病機制中起重要作用[14]。在IS處理的高血壓大鼠模型中也發(fā)現(xiàn)相似的變化[15]，表明IS可直接誘導VSMC發(fā)生表型轉化，從而促進血管鈣化的發(fā)生。高磷也是促進VSMC轉分化為成骨樣細胞的重要因子，抑制PiT-1(磷轉運蛋白)會同時阻斷高磷誘導的VSMC表型轉變和鈣化作用。而IS可通過激活JNK途徑，上調(diào)PiT-1表達促進VSMC鈣化[16]。值得注意的是，IS聯(lián)合高劑量的磷可顯著增強促鈣化作用[17]。這表明IS不僅可直接促進VSMC發(fā)生表型轉化，也可通過增強VC強誘導劑(例如高磷)等機制誘導VSMC的表型轉化，從而產(chǎn)生促血管鈣化作用。

3.2誘導VSMC過早衰老和凋亡研究發(fā)現(xiàn)，IS處理的高血壓大鼠可觀察到主動脈鈣化區(qū)域VSMC衰老標志物p53、細胞周期抑制劑p21以及A型核纖層蛋白前體(prelamin A)的表達上調(diào)，并伴有VSMC成骨細胞轉化增強及主動脈鈣化的發(fā)生[18]。此外，凋亡也與血管鈣化發(fā)生密切，IS可通過干擾Notch信號傳導通路，顯著激活caspase3 / 7活性，并以劑量和時間依賴性增加TUNEL陽性細胞比例，促進成骨細胞分化和凋亡，最終促進血管鈣化的發(fā)生[15]。

3.3促進細胞外囊泡(Extracellular Vesicles,EVs)的釋放EVs是細胞主動釋放的納米級膜囊泡[19]。在內(nèi)皮細胞和VSMC之間發(fā)揮重要作用。在IS介導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷的體外模型中，由IS誘導產(chǎn)生的內(nèi)皮微囊泡(endothelial microvesicles,EMV)可誘導內(nèi)皮祖細胞(Endothelial Progenitor Cells,EPC)功能障礙，使EPC維持內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)的功能降低[20]。此外，由IS誘導產(chǎn)生的EMV還可通過促進HASMC促鈣化基因Runx2和BMP2表達，使VSMC中鈣的累積水平逐漸升高以及改變VSMC中TWEAK(腫瘤壞死因子樣凋亡弱誘導物)，趨化因子CCL2、CCL5 ，TNF-α，IL-6等促炎基因水平變化，發(fā)揮其誘導血管鈣化的作用[21]。最近有研究證實，IS刺激內(nèi)皮細胞釋放的EV可增強VSMC中PiT- 1的表達，并誘導AKT和ERK的磷酸化，促進VSMC的成骨轉分化[22]。

3.4介導炎癥反應及促進氧化應激炎癥反應在血管鈣化的發(fā)生發(fā)展中有重要作用[23-24]，在 Opdebeeck等人[25]的動物模型中，慢性腎病大鼠分別接受IS[150mg/(kg.d)]喂養(yǎng)4 d和7周，結果顯示給藥4 d的大鼠主動脈鈣化發(fā)生前急性炎癥反應和凝血信號通路已被激活，而給藥7周的IS的大鼠顯示明顯的主動脈和外周動脈的鈣化，證明炎癥反應在血管鈣化早期已經(jīng)存在。在Ito等[26]人的實驗中，內(nèi)皮細胞特異性 AhR 敲除的小鼠持續(xù)皮下注入0.79 mmol/L的IS，2 周后再注射 TNF-α，可觀察到IS顯著增強TNF-α誘導的白細胞向血管壁的募集，從而參與CKD血管炎癥的發(fā)生。此外，促炎性巨噬細胞在IS誘導的血管鈣化進展中的作用突出[27]。最近的一項實驗研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞可通過SLCO2B1基因編碼的大鼠有機陰離子轉運肽加速對IS的攝取，隨后IS誘導巨噬細胞中的配體Dll4的表達，并觸發(fā)Notch信號傳導，從而加速動脈粥樣硬化形成[28]。

有學者發(fā)現(xiàn)經(jīng)IS處理的HASMC中，NADPH氧化酶Nox4的mRNA表達明顯增加，進而采用siRNA的方法抑制了Nox4后，由IS誘導的Runx2、ALP和骨橋蛋白mRNA表達下調(diào)，表明IS可通過上調(diào)NADPH氧化酶Nox4刺激活性氧生成，促進成骨細胞特異性蛋白的表達，進而導致血管鈣化的發(fā)生[30]。此外，在IS處理的高血壓大鼠主動脈鈣化區(qū)域可見氧化應激標志物8-羥基-2'-脫氧鳥苷和丙二醛的表達增強?？梢娧趸瘧ひ矃⑴cIS誘導的血管鈣化的發(fā)生[15]。

3.5下調(diào)鈣化抑制劑血管鈣化是一個主動調(diào)節(jié)的過程，涉及血管壁和循環(huán)中的鈣化激活劑和抑制劑之間的平衡[13]。鈣化抑制劑主要包括骨保護素、基質Gla蛋白、OPN、胎球蛋白A、Klotho蛋白等，它們可以抑制VSMC發(fā)生鈣化。

Klotho蛋白被視為預防CKD患者心血管并發(fā)癥的保護因子[32]。有研究證實，分別用濃度為0、200、500和1000 μmol/L的IS培養(yǎng)HASMC，6d后可觀察到IS濃度為500和1000 μmol/L組HASMC的Klotho表達顯著降低，細胞發(fā)生顯著的成骨表型轉變。給切除5/6 腎的大鼠腹腔注射IS[100mg/(kg.48h)]持續(xù)24周后，其主動脈鈣化也比未進行IS腹腔注射的大鼠更顯著。并且氮雜脫氧胞苷(5-Aza2dc)可在一定程度上通過增加Klotho表達從而抑制血管鈣化的發(fā)生[33-34]。此外，IS可通過激活活性氧 /NF-κB信號傳導通路抑制HASMC中的基質Gla蛋白的表達，從而抑制血管鈣化[35]。OPN可以防止異位鈣沉積，是一種有效且可誘導的VC抑制劑。磷酸鹽和IS共同培養(yǎng)下，人臍靜脈內(nèi)皮細胞分泌的白細胞介素-8(Interleukin-8, IL-8)可抑制HASMC中OPN的表達并發(fā)揮促鈣化作用[17]。這表明IS可通過下調(diào)多種鈣化抑制劑促進血管鈣化。

3.6其他途徑目前發(fā)現(xiàn)多種miRNA與CKD血管鈣化和動脈粥樣硬化的血管損傷有關[34]。各項體內(nèi)外及臨床研究證實，IS可下調(diào)miR-126、miR-21-3p、miR-214水平，上調(diào)miR-210、miR-92a表達水平，從而參與內(nèi)皮功能調(diào)節(jié)，增加心血管疾病患病率[35-36]。miR-29b為VSMC鈣化的重要保護因子，IS通過下調(diào)HASMC中miR-29b的表達，激活Wnt /β-catenin信號，提高Runx2和OPN的蛋白表達水平，參與血管鈣化的發(fā)生發(fā)展[37]。

自噬是參與CKD血管鈣化的重要機制，有研究發(fā)現(xiàn)，IS可通過激活自噬引起SET7/9表達下降，從而使成骨特異性蛋白Runx2和OPN表達上調(diào)，發(fā)揮其誘導血管鈣化的作用，且該作用可被自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤顯著減弱[38]，因此認為自噬會加劇IS誘導的HASMC的血管鈣化。但自噬在鈣化中的作用尚有爭議，今后需進一步的研究確定其在IS誘導的血管鈣化中的作用。

4 結 語

當前的研究已發(fā)現(xiàn)IS可通過多種途徑直接或間接參與VSMC成骨樣轉分化及血管鈣化的發(fā)生發(fā)展，有望成為血管鈣化的預測指標及防治新靶點。目前臨床上針對IS的產(chǎn)生及清除的治療策略非常有限。各種改良透析方式可增加IS的透析清除率，但仍需要大樣本的臨床數(shù)據(jù)驗證其有效性[39-40]。今后仍需要進一步探索IS參與血管鈣化的機制，進一步尋找拮抗其作用的新藥及干預靶點。