加載PEDF的多聚體超聲微泡研制及其特性

胡劼，焦明克，劉立潔，張鵬，牛盈盈

1.新疆醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院心臟超聲科，新疆烏魯木齊 830000；2.重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院超聲科，重慶 400000；3.新疆軍區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)工程科，新疆烏魯木齊 830000

前言

作為一種新興藥物載體，攜載藥物的靶向超聲微泡相對(duì)其他載體具有不具免疫性、可實(shí)現(xiàn)靶向爆破、穩(wěn)定、減少藥物副作用等優(yōu)勢(shì)，能夠?qū)崿F(xiàn)在超聲波輔助下進(jìn)行藥物靶向無(wú)創(chuàng)治療［1-2］。血管新生類(lèi)疾病，如癌癥、動(dòng)脈斑塊等對(duì)機(jī)體造成病理侵蝕的疾病，是損害健康的無(wú)形殺手［3-4］，采用抑制血管形成因子、打破血管形成等血管新生阻斷療法是治療血管新生類(lèi)疾病的研究熱點(diǎn)［5-6］。色素上皮源因子（Pigm Entepithelium-Derived Factor,PEDF）被證實(shí)在所有抗新生血管因子中作用最強(qiáng)，且能在體內(nèi)拮抗多種血管新生因子, 并完全抑制它們活性的發(fā)揮［7-8］，但PEDF無(wú)法直接有效地作用于病灶［9］。為實(shí)現(xiàn)新生血管抑制因子PEDF 在有效直達(dá)病灶治療血管新生類(lèi)疾病的同時(shí)，降低其不良反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)首次將多聚體超聲微泡與PEDF 相結(jié)合，制備最大藥物結(jié)合率的靶向超聲微泡，并進(jìn)一步研究該超聲微泡的理化特性，以期為新生血管類(lèi)疾病的治療提供合適的藥物載體，為形成靶向、無(wú)創(chuàng)、有效的新治療方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要材料及設(shè)備

本實(shí)驗(yàn)主要材料包括表面活性劑Span 60、Tween 80、PBS、PEG、HPC、六氟化硫氣體（SF6）、PED抗體（C1224MSDS,Sigma-Aldrich,USA）、氯仿、膽固醇和（NH4）2SO4緩沖液。設(shè)備包括高強(qiáng)度超聲處理器（VCX-750, Sonix, USA）、分光光度計(jì)（AquaMate 8000, Thermo-Fisher, USA）、庫(kù)爾特粒度儀（Multisizer III, Bechman-Coulter, USA）、流式細(xì)胞儀及熒光顯微鏡等。

1.2 多聚體微泡的制備及保存

將Span 60 和Tween 80 混合表面活性劑與不同聚合度的PEG 溶于PBS 中，在磁力攪拌器上加熱至60 ℃，待完全溶解后，將所得溶液置于高壓蒸氣內(nèi)進(jìn)行消毒，進(jìn)而再置于磁力攪拌器上持續(xù)攪拌，冷卻至室溫。設(shè)定高強(qiáng)度超聲處理器功率為400 W，采用聲振法處理上述冷卻后的非離子表面活性劑溶液1 min，同時(shí)在溶液上方通入SF6，最終得到乳白色微泡懸浮液。用50 mL的PBS稀釋10 mL的原始微泡，將微泡稀釋液移入分液漏斗中靜置20 min，然后采用上浮法對(duì)微泡稀釋液進(jìn)行分級(jí)分離。在零下4 ℃及室溫下的不同時(shí)間段對(duì)微泡進(jìn)行觀察，并將制得的微泡在4 ℃下分裝于不同玻璃小瓶進(jìn)行恒溫保存。

1.3 包裹不同濃度PEDF脂質(zhì)體的制備

以3：1的質(zhì)量比將膽固醇與HSPC（氫化卵磷脂）混合溶于氯仿中，制得20 mg/mL 濃度的混合液。氯仿在容器底部形成一層脂質(zhì)膜，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除；然后用300 mmol/L 的（NH4）2SO4緩沖液進(jìn)行水合得到脂質(zhì)乳狀液，進(jìn)而依次用800、400、200 和100 nm的擠出膜對(duì)乳狀液進(jìn)行擠出；最后將脂質(zhì)體通過(guò)葡聚糖凝膠柱層析，得到跨膜銨梯度脂質(zhì)體。將濃度分別為0.4、2.0、10.0 和50.0 μg/mL 的PEDF 與跨膜銨梯度脂質(zhì)體以8：5 的體積比進(jìn)行混合，在65 ℃進(jìn)行孵育25 min，冰浴45 min。

1.4 多聚體超聲微泡-藥物復(fù)合體的制備及最大結(jié)合率檢測(cè)

分別將熒光和生物素標(biāo)記的包裹不同濃度PEDF 的脂質(zhì)體與制備好的微泡進(jìn)行混合，因微泡表面活性物質(zhì)中含有具有一定粘附作用的PEG，因此可以將脂質(zhì)體黏附在其表面，從而形成多聚體超聲微泡-藥物復(fù)合體。采用Multisizer III 對(duì)復(fù)合體的粒徑進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量使用30 μm 的小孔管和300 通道。通過(guò)Photoshop 圖像分析軟件對(duì)復(fù)合體濃度進(jìn)行測(cè)定。應(yīng)用熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀檢測(cè)測(cè)定藥物的有效加載情況，并確定藥物與微泡的結(jié)合率。

1.5 脂質(zhì)體對(duì)PEDF的包封率測(cè)定

針對(duì)測(cè)得具有最大超聲微泡結(jié)合率的PEDF 脂質(zhì)體，取其混合液200 μL 直接進(jìn)行破乳，采用AquaMate 8000 分光光度計(jì)進(jìn)行吸光度檢測(cè)，測(cè)得吸光度為A0；同時(shí)再取200 μL上述混合液上樣置于G-50離心柱上，離心洗脫得到包裹有PEDF 的脂質(zhì)體，收集洗脫液破乳，測(cè)得吸光度為A1；最后通過(guò)式（1）得到脂質(zhì)體對(duì)藥物PEDF的包封率。

1.6 PEDF多聚體超聲微泡體外釋藥特性

精密稱(chēng)取50 mg 載藥多聚體微泡懸浮于10 mL 0.1 mol/L的PBS 中，并將該溶液置于透析袋內(nèi)密封，在保持37 ℃的情況下，應(yīng)用超聲體外擊破微泡，在預(yù)定時(shí)間間隔15、30、45、60、75、90、105 s及5、7、10 min，取出1 mL 溶液，通過(guò)分光光度法測(cè)定PEDF 的含量，同時(shí)補(bǔ)加等量的PBS。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析和SNK-Q 檢驗(yàn)，以P<0.05作為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 多聚體超聲微泡-藥物復(fù)合體的粒徑

應(yīng)用Multisizer III 和Photoshop 圖像分析軟件得到該新型多聚體微泡的平均直徑為（3.17±0.13）μm，濃度為（3.00±0.11）×109/mL。

2.2 不同濃度PEDF在多聚體超聲微泡上的加載及結(jié)合率

在熒光顯微鏡下觀察各組不同濃度PEDF 與微泡結(jié)合情況，初步明確結(jié)合率與藥物濃度的相關(guān)性。由圖1可觀察到0.4 μg/mL 濃度實(shí)驗(yàn)組PEDF 與超聲微泡未見(jiàn)明顯結(jié)合，2.0 μg/mL 濃度實(shí)驗(yàn)組可觀察到少量PEDF 與微泡結(jié)合，10.0 μg/mL 濃度實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)中量PEDF 與微泡結(jié)合，50.0 μg/mL 實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)大量密集PEDF與微泡結(jié)合。因此可基本判斷PEDF與超聲微泡的結(jié)合率隨PEDF濃度的增加而逐漸增大。

圖1 熒光顯微鏡觀察不同濃度PEDF與超聲微泡結(jié)合情況Fig.1 The binding of different concentrations of PEDF to ultrasound microbubbles was observed by fluorescence microscope

進(jìn)而，為定量描述PEDF 與超聲微泡的結(jié)合特性，本研究采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)多聚體超聲微泡-藥物復(fù)合體的載藥量結(jié)合率。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果的分布統(tǒng)計(jì)以單參數(shù)直方圖的方式自動(dòng)顯示（圖2）。0.4 μg/mL 濃度實(shí)驗(yàn)組PEDF 與微泡的結(jié)合率為0%，2.0 μg/mL 濃度實(shí)驗(yàn)組PEDF 與微泡的結(jié)合率為（10.58±0.61）%，10.0 μg/mL濃度實(shí)驗(yàn)組PEDF與微泡的結(jié)合率為（54.94±0.83）%，50.0 μg/mL 濃度實(shí)驗(yàn)組PEDF 與微泡的結(jié)合率達(dá)到（96.14±1.21）%。隨著PEDF 濃度的繼續(xù)升高，藥物將不再與超聲微泡相結(jié)合，藥物濃度已達(dá)到飽和狀態(tài)。

圖2 不同濃度PEDF與微泡結(jié)合情況單參數(shù)直方圖Fig.2 Single parameter histogram of different concentrations of PEDF binding to ultrasound microbubbles

2.3 脂質(zhì)體對(duì)PEDF的包封率及體外釋藥特性

根據(jù)吸光度A0與A1以及包封率計(jì)算公式，測(cè)得PEDF 多聚體超聲微泡的包封率為（79.20±2.31）%。表明該P(yáng)EDF 超聲微泡具有良好的載藥包封特性，可以作為載藥系統(tǒng)運(yùn)載PEDF。超聲作用下，在預(yù)定時(shí)間間隔15、30、45、60、75、90、105 s 及5、7、10 min，對(duì)取出的等份PEDF 多聚體微泡懸浮溶液，通過(guò)分光光度法測(cè)定PEDF 的含量，繪制其體外釋藥特性曲線（圖3）。從圖中可以看到從微泡被超聲擊破后第15 s開(kāi)始觀察到PEDF 釋放，在45～60 s 藥物濃度達(dá)到峰值（65±3）%，而在剩余的時(shí)間內(nèi)，藥物濃度略有升高，持續(xù)觀察10 min 后濃度開(kāi)始顯著降低，該結(jié)果說(shuō)明PEDF超聲微泡在短時(shí)間內(nèi)具有連續(xù)釋藥特性。

圖3 PEDF多聚體超聲微泡藥物釋放率Fig.3 In vitro drug release rate of PEDF-loaded polymer ultrasound microbubbles

3 討論

針對(duì)癌癥、頸部動(dòng)脈斑塊等血管新生類(lèi)疾病，研究表明直接在病變部位注射可以使藥物表達(dá)效率提高，但該方法具有有創(chuàng)性，應(yīng)用受到一定的局限［10-11］。病毒載體是公認(rèn)的高效轉(zhuǎn)染的載體，但有免疫原性和潛在藥物突變的危險(xiǎn)［12-13］。本實(shí)驗(yàn)首次將PEDF對(duì)新生血管因子的有效抑制作用與多聚體超聲微泡載藥靶向治療的特性相結(jié)合，研制性能優(yōu)異的PEDF 多聚體超聲微泡，利用微泡在超聲介導(dǎo)下的空化效應(yīng)，靶向傳輸藥物，達(dá)到安全有效治療的目的［14-15］。

多聚體超聲微泡與其他載體相比，其構(gòu)成成分多為脂類(lèi)、糖類(lèi)以及可生物降解的多聚體，不具有免疫原性，體積小且較穩(wěn)定，在不經(jīng)受一定強(qiáng)度的超聲聲能照射的情況下可以在體內(nèi)保持穩(wěn)定，僅在超聲照射區(qū)域內(nèi)，即觀測(cè)的病變部位破裂，從而可實(shí)現(xiàn)靶向釋藥，同時(shí)，超聲介導(dǎo)微泡破壞還可促進(jìn)其攜帶藥物通過(guò)血管內(nèi)膜屏障，釋放到靶向組織和器官的血管外間質(zhì)，增加靶細(xì)胞的藥物濃度［16-17］。本實(shí)驗(yàn)研制的多聚體微泡為人工合成醫(yī)用多聚體高分子材料，其生物相容性好，在體內(nèi)能自然降解成水和二氧化碳，對(duì)人體無(wú)任何毒副作用，免疫原性低，可通過(guò)腎臟排出體外，在體內(nèi)不會(huì)有積累。

PEDF是重要的新生血管抑制因子［18］，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)多項(xiàng)疾病由于新生血管形成影響疾病轉(zhuǎn)歸的問(wèn)題，首次提出應(yīng)用超聲微泡作為載體，并結(jié)合新生血管抑制因子制備形成一個(gè)新型的藥物復(fù)合體，且明確了PEDF與新型超聲微泡載體的結(jié)合特性，并研制了具有最大藥物結(jié)合率的超聲微泡。對(duì)PEDF超聲微泡包封率和釋藥特性的檢測(cè)結(jié)果表明，PEDF超聲微泡與其他已知性能優(yōu)異的載藥微泡具有相似的理化特性，如HCPT超聲微泡、舒尼替尼超聲微泡等［19-20］。本研究雖然為實(shí)現(xiàn)采用多聚體微泡攜帶藥物靶向治療血管新生類(lèi)疾病的研究奠定了基礎(chǔ)，然而現(xiàn)仍處于基礎(chǔ)階段，多聚體微泡到達(dá)病灶部位在超聲輔助下釋放藥物的療效、作用機(jī)理以及相應(yīng)的其他不可預(yù)知作用尚需進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。