食品加工環(huán)境脅迫因素對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌生物膜形成的影響研究進(jìn)展

王 園，孫琳珺，程 穎，王 翔，劉陽泰，林玉海，董慶利,*

（1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；2.上海中僑職業(yè)技術(shù)大學(xué)食品藥品學(xué)院，上海 201514；3.荷美爾食品公司，上海 200436）

單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）（以下簡(jiǎn)稱單增李斯特菌）是一種兼性厭氧、無芽孢的革蘭氏陽性短桿菌，廣泛分布于自然環(huán)境中，被世界衛(wèi)生組織列為20世紀(jì)90年代食品中四大致病菌之一[1]。食物是單增李斯特菌傳播的主要載體，肉類、蛋類、禽類、海產(chǎn)品、乳制品、蔬菜等都是單增李斯特菌污染較高的食物[2]。攝入被單增李斯特菌污染的食物可使人患李斯特菌病，甚至引起疾病暴發(fā)，致死率高達(dá)20%～30%[3]。

生物膜是細(xì)菌在生長(zhǎng)過程中為了適應(yīng)生存環(huán)境，分泌黏性胞外聚合物吸附于物質(zhì)表面，并增殖而形成的具有一定結(jié)構(gòu)的細(xì)胞群體[4]。據(jù)調(diào)查，約80%的細(xì)菌感染均與生物膜的形成有關(guān)[5]，60%的食源性食物中毒暴發(fā)事件是由食源性致病菌生物膜引起[6]。單增李斯特菌可黏附在各種接觸物表面上并形成生物膜，從而導(dǎo)致產(chǎn)品的持續(xù)污染。

細(xì)菌生物膜形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)演變過程，生物膜形成能力會(huì)因許多因素而變化。在食品加工儲(chǔ)藏過程中，微生物所處的環(huán)境復(fù)雜多變，諸多因素均會(huì)對(duì)生物膜的形成產(chǎn)生影響，生物膜的成熟也可能因環(huán)境條件而異[7]，例如短期的營養(yǎng)缺乏可增強(qiáng)單增李斯特菌的菌體黏附，而長(zhǎng)期營養(yǎng)缺乏時(shí)則會(huì)阻礙生物膜成熟[8]。當(dāng)胰蛋白胨大豆肉湯（tryptone soy broth，TSB）培養(yǎng)基中NaCl含量增加時(shí)，單增李斯特菌生物量顯著增加[9]。單增李斯特菌在惡劣環(huán)境中能長(zhǎng)時(shí)間生存（持久性）也可能與生物膜的形成有關(guān)，形成生物膜可能是對(duì)脅迫環(huán)境的適應(yīng)性反應(yīng)[10]。實(shí)際上，在食品加工及儲(chǔ)藏過程中，冷藏、高鹽度、干燥、酸處理以及消毒劑等處理使微生物長(zhǎng)期處于脅迫環(huán)境下。環(huán)境脅迫是指在自然界或食品加工和保藏過程中，環(huán)境條件對(duì)微生物的生長(zhǎng)和存在產(chǎn)生了一定程度的威脅和制約[11]。值得注意的是，經(jīng)各種處理后，生物膜仍可在設(shè)備表面殘留，并在環(huán)境適宜時(shí)脫落出細(xì)菌菌體，成為潛在污染源，進(jìn)一步造成交叉污染，引發(fā)嚴(yán)重的食品安全問題。環(huán)境條件對(duì)生物膜的影響極其復(fù)雜，不同的環(huán)境因子組合下形成的生物膜差異較大。此外，細(xì)菌暴露于脅迫條件下，可能提高其對(duì)其他脅迫條件的抗性[12]。生物膜的形成使細(xì)菌菌體對(duì)環(huán)境壓力的抵抗能力大大增強(qiáng)，常規(guī)方法難以清除生物膜，殘留的生物膜可發(fā)展形成新的生物膜，生物膜形成處成為交叉污染的中心，進(jìn)而對(duì)食品安全產(chǎn)生極大威脅。因此十分有必要研究不利條件下單增李斯特菌在設(shè)備表面附著和生物膜形成的情況。

本文針對(duì)不同脅迫條件對(duì)單增李斯特菌生物膜形成的影響進(jìn)行全面綜述，同時(shí)深入探討脅迫環(huán)境下生物膜的變化機(jī)制，并對(duì)未來的研究方向作出展望，有助于針對(duì)性地制定預(yù)防和控制生物膜的策略。

1 單增李斯特菌生物膜形成能力

不同分離源、不同譜系以及血清型的單增李斯特菌生物膜形成能力有所不同。根據(jù)遺傳指紋圖譜和致病潛力，單增李斯特菌可分為4 個(gè)不同的譜系?；诰w/鞭毛抗原（O/H）血清學(xué)反應(yīng)，單增李斯特菌被分為13 種血清型，其中血清型1/2a、1/2b、1/2c和4b經(jīng)常分離于食品及患者標(biāo)本中。血清型或譜系與生物膜形成能力之間的關(guān)聯(lián)一直存在爭(zhēng)議。已報(bào)道的我國食源性單增李斯特菌中，1/2c血清型居多，且不同壓力條件下1/2c血清型生物膜形成能力強(qiáng)于其他血清型[13]，這可能是1/2c血清型在我國分離率較高的原因。1/2a和/或1/2c菌株（譜系II）的生物膜形成能力強(qiáng)于4b菌株（譜系I）[14-15]，然而Djordjevic等[16]研究發(fā)現(xiàn)譜系I菌株的生物膜形成能力強(qiáng)于譜系II。研究結(jié)果的差異性可能是由于菌株差異、研究條件以及培養(yǎng)介質(zhì)不同。Kadam等[17]研究了143 株不同血清型、不同分離源的單增李斯特菌生物膜的形成情況，結(jié)果顯示，血清型對(duì)生物膜的形成有顯著影響，而菌株的分離源對(duì)生物膜的形成水平?jīng)]有顯著影響。目前，評(píng)估生物膜表型的種內(nèi)多樣性的研究集中于將表型與菌株的譜系、血清型或來源相關(guān)聯(lián)，而這些評(píng)估方式可能無法反映生物膜形成的種內(nèi)多樣性。

基于特定基因型的研究，如多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST）定義的基因型，可能揭示出與生物膜表型更緊密的聯(lián)系。近來，Maury等[18]發(fā)現(xiàn)低毒力型單增李斯特菌克隆CC121和CC9在亞致死濃度苯扎氯銨處理下的生物膜生成量更高；10 ℃下，CC26型菌株的生物膜形成能力明顯高于其他CC型，低溫能增強(qiáng)CC26菌株的生物膜形成能力，而CC7型的菌株在所有條件下均表現(xiàn)出較弱的生物膜形成能力[8]，這意味著某些基因型在特定條件下具有適應(yīng)性優(yōu)勢(shì)。MLST分型與生物膜形成能力和生物膜結(jié)構(gòu)相關(guān)性仍需進(jìn)一步研究。

單增李斯特菌的生物膜形成能力具有較強(qiáng)的菌株特異性。Weiler等[19]研究表明單增李斯特菌生物膜的形成和附著與血清型無關(guān)，而是具有菌株特異性。純培養(yǎng)條件下，單增李斯特菌菌株之間生物膜形成能力差異很大[20]，且形成生物膜的結(jié)構(gòu)也因菌株而異。一些系統(tǒng)發(fā)育密切相關(guān)的菌株（包括相同基因型的分離株）之間生物膜形成能力存在較大差異，較小的遺傳變異可能會(huì)影響生物膜表型。有些菌株能更有效地附著在表面，而隨后不一定形成更多的生物膜，甚至相似來源的菌株也表現(xiàn)出不同的生物膜行為[21]。屬于同一脈沖電泳型的分離株生物膜形成能力不同，這表明生物膜形成能力取決于菌株[22]。而同一株單增李斯特菌在不同條件下的生物膜形成量顯著不同，表明菌株的表型變化可能取決于環(huán)境條件[23]。為更準(zhǔn)確地開展生物膜形成的種內(nèi)多樣性研究，應(yīng)充分掌握單增李斯特菌的種內(nèi)變異性和環(huán)境因素對(duì)種內(nèi)變異性影響的信息。

2 食品加工環(huán)境脅迫因子對(duì)單增李斯特菌生物膜形成的影響

單增李斯特菌生物膜的形成除受以上微生物內(nèi)在因素的影響，還受食品加工儲(chǔ)藏過程中冷藏、干燥、酸處理、消毒劑等環(huán)境因素的影響。

2.1 冷脅迫

冷脅迫包括0～12 ℃之間的冷脅迫和0 ℃以下的冷凍脅迫。4 ℃下單增李斯特菌可在3 h內(nèi)附著在食物接觸物表面[24]，并在24 h后形成稀疏細(xì)胞簇組成的生物膜[25]。研究表明單增李斯特菌在玻璃表面的生物膜形成顯著依賴于培養(yǎng)溫度和時(shí)間，4 ℃下單增李斯特菌在不銹鋼、玻璃表面均可形成生物膜，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，生物膜數(shù)量逐漸增加[26]。I?iguez-Moreno等[27]也得到了同樣的研究結(jié)果，9 ℃下單增李斯特菌數(shù)量在生物膜形成的過程中呈線性增長(zhǎng)，細(xì)胞間相互作用形成復(fù)雜且高度結(jié)構(gòu)化的生物膜。然而，di Bonaventura等[25]研究表明，4、12 ℃下單增李斯特菌僅形成由稀疏細(xì)胞簇和少量胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS）組成的基礎(chǔ)生物膜結(jié)構(gòu)，可能是低溫下細(xì)菌存活率降低導(dǎo)致的。當(dāng)前研究主要比較了常見溫度范圍4～37 ℃對(duì)單增李斯特菌生物膜形成的影響，盡管研究結(jié)果存在爭(zhēng)議，但均表明單增李斯特菌可在低溫下存活并形成生物膜。

單增李斯特菌是一種嗜冷菌，不僅能在0～4 ℃的低溫環(huán)境下生存，甚至當(dāng)溫度低于0 ℃條件下仍可繁殖。研究表明冷應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致單增李斯特菌對(duì)食品接觸表面的黏附力增強(qiáng)，增加了食品污染的幾率[28]。Miladi等[29]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過-20 ℃的冷凍脅迫后，單增李斯特菌的黏附能力增強(qiáng)，并能夠產(chǎn)生黏液。單增李斯特菌生物膜存在的時(shí)間與其低溫環(huán)境下的生長(zhǎng)繁殖能力有關(guān)。低溫下單增李斯特菌仍可形成生物膜黏附在各種表面，降低各種殺菌清洗手段的效率，其可在食品工業(yè)設(shè)備和環(huán)境中持續(xù)存在數(shù)月甚至數(shù)年。

2.2 營養(yǎng)脅迫

饑餓生存被定義為“微生物在產(chǎn)能底物缺乏時(shí)的生存過程”[30]。在加工處理食品的過程中，通常會(huì)按照特定的程序?qū)κ称吩匣虍a(chǎn)品進(jìn)行數(shù)次清洗、消毒，使微生物暴露于消毒劑、脫水及營養(yǎng)物質(zhì)缺乏的條件下。

黏附是生物膜形成的第一步，Lee等[28]觀察到無論培養(yǎng)溫度如何，營養(yǎng)缺乏都會(huì)對(duì)單增李斯特菌的黏附產(chǎn)生積極影響，然而并未促進(jìn)生物膜的成熟，營養(yǎng)水平對(duì)不同階段生物膜的影響可能不同[30]。如細(xì)菌與基質(zhì)之間的疏水性和界面力等理化特性會(huì)影響細(xì)胞附著，且營養(yǎng)脅迫可能會(huì)引發(fā)細(xì)胞表面特性改變，從而導(dǎo)致黏附力增加。營養(yǎng)缺乏可能刺激單增李斯特菌和沙門氏菌形成生物膜[31-32]。Folsom等[33]研究了營養(yǎng)水平對(duì)不同菌株生物膜形成能力的影響，11 種菌株在TSB培養(yǎng)基和稀釋的TSB（diluted TSB，DTSB）培養(yǎng)基中具有相同的生物膜形成能力，14 種菌株在TSB培養(yǎng)基中比在DTSB培養(yǎng)基中形成更多的生物膜，5 種菌株在DTSB培養(yǎng)基中比在TSB培養(yǎng)基中形成更多生物膜，可見營養(yǎng)水平和菌株的交互作用對(duì)生物膜的形成有顯著影響。營養(yǎng)缺乏脅迫時(shí)，常觀察到細(xì)菌尺寸減小，同時(shí)細(xì)胞形狀從桿狀變?yōu)榍驙頪30]，這種形態(tài)上的收縮變圓可能增加細(xì)胞吸收營養(yǎng)的能力。實(shí)際上，細(xì)菌適應(yīng)惡劣環(huán)境的一種常見方法是其形態(tài)發(fā)生改變。

2.3 酸脅迫

食品加工過程中常形成低pH值環(huán)境，如使用酸性洗液和酸性食品添加劑等。單增李斯特菌生物膜形成能力也受pH值的影響，其疏水性和表面黏附力隨著環(huán)境pH值降低而增加[34]。然而Barbosa等[35]研究發(fā)現(xiàn)單增李斯特菌1592/2暴露于酸性亞致死條件后，其在37 ℃條件下形成生物膜的能力下降。不同來源單增李斯特菌在pH 4.2、5.5、6.5下均可形成生物膜，然而隨著pH值的降低，生物膜的生成量逐漸減少[36]。研究表明短期弱酸脅迫可以增強(qiáng)腸炎沙門氏菌的附著力，而長(zhǎng)期強(qiáng)酸脅迫能夠顯著降低細(xì)胞的附著力；與對(duì)照組相比，長(zhǎng)期弱酸和強(qiáng)酸脅迫均顯著抑制了腸炎沙門氏菌生物膜的形成[37]。王嫻靜等[38]的研究表明，酸性條件對(duì)大腸桿菌O157:H7的生物膜形成過程具有抑制作用。這一發(fā)現(xiàn)可通過細(xì)胞與環(huán)境pH值動(dòng)態(tài)作用來解釋，當(dāng)環(huán)境pH值降低時(shí)導(dǎo)致膜質(zhì)子泵活性增加，從而將H+從細(xì)胞質(zhì)中排出，因此細(xì)胞內(nèi)能量消耗主要是用于避免內(nèi)部酸化，進(jìn)而降低黏附和生物膜形成過程中涉及的生理過程的速率。

通過MOSA求解面向廣義能耗的調(diào)度優(yōu)化問題的初始解，包括采用隨機(jī)方式選取子批量的加工批量、工藝路線、工序選擇的加工機(jī)床、刀具和搬運(yùn)設(shè)備，以及通過先到先服務(wù)(First Come First Served, FCFS)規(guī)則選取工序選擇的夾具和安排子批量在機(jī)床上的加工順序。根據(jù)上述方式生成調(diào)度方案的初始解R0，并通過廣義能耗和完工時(shí)間目標(biāo)函數(shù)計(jì)算柔性作業(yè)車間廣義能耗F1(R0)和完工時(shí)間F2(R0)。

值得關(guān)注的是，當(dāng)微生物暴露于酸性應(yīng)激條件之后其對(duì)該脅迫條件或其他脅迫條件的抗性會(huì)提高，從而導(dǎo)致“交叉保護(hù)”。酸適應(yīng)增強(qiáng)了單增李斯特菌對(duì)不銹鋼表面的附著能力，同時(shí)還能提高附著細(xì)胞對(duì)極端酸處理[39]和次氯酸鈉[40]的抵抗力。因此，在應(yīng)用酸性去污劑清除單增李斯特菌黏附體時(shí)應(yīng)考慮“脅迫強(qiáng)化”。

2.4 滲透脅迫

鹽是使用最廣泛的天然防腐劑，單增李斯特菌在許多食品中生存均必須克服由食鹽產(chǎn)生的滲透脅迫。單增李斯特菌能適應(yīng)周圍環(huán)境中水分活度的變化，NaCl能誘導(dǎo)生物膜的形成。在不同溫度[41]、不同培養(yǎng)基[42]條件下，當(dāng)培養(yǎng)基中補(bǔ)充NaCl時(shí)，可促進(jìn)生物膜的形成，并導(dǎo)致單增李斯特菌聚集程度急劇增加。Lee等[28]的研究結(jié)果表明在營養(yǎng)豐富或營養(yǎng)缺乏條件下增加鹽濃度均能導(dǎo)致生物膜形成量顯著增加，表明鹽分添加和營養(yǎng)缺乏可促進(jìn)生物的膜形成，且營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏會(huì)增強(qiáng)氯化鈉對(duì)生物膜成熟的積極作用。而在Barbosa等[35]研究發(fā)現(xiàn)，5 株單增李斯特菌菌株在遭遇亞致死滲透壓脅迫后，生物膜形成能力沒有發(fā)生顯著變化，研究結(jié)果的不同可能是由于所使用的NaCl濃度差別以及所選擇的菌株差異性較大。

在高鹽條件下，單增李斯特菌的生物膜中細(xì)胞呈長(zhǎng)鏈狀[43]。當(dāng)單增李斯特菌培養(yǎng)液中NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于5%時(shí)，觀察到菌體細(xì)胞在較低水分活度脅迫下不能分裂，這些伸長(zhǎng)的細(xì)胞實(shí)際上接近分裂狀態(tài)，當(dāng)轉(zhuǎn)移到更有利的條件下，就會(huì)分裂成單個(gè)細(xì)胞并開始生長(zhǎng)[44]。對(duì)于食品加工環(huán)境中的滲透脅迫，單增李斯特菌已進(jìn)化出多種應(yīng)對(duì)機(jī)制，包括拉伸激活或由拉伸激活介導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)溶質(zhì)和水由細(xì)胞膜通道流出，可避免在滲透脅迫下大量水流入細(xì)胞質(zhì)而引起的細(xì)胞裂解。

2.5 干燥脅迫

在食品工業(yè)中，在日常清潔消毒后常伴隨風(fēng)干處理，其目的是干燥食品表面，避免由于食品接觸表面水凝結(jié)導(dǎo)致微生物凝聚而引起污染。單增李斯特菌在可在相對(duì)濕度43%的條件下存活長(zhǎng)達(dá)3 個(gè)月[45]，食鹽、有機(jī)物質(zhì)殘留和相對(duì)濕度的增加可提高單增李斯特菌在干燥條件下的存活率。生物膜可經(jīng)受一段時(shí)間的干燥并適應(yīng)周圍環(huán)境。

干燥對(duì)不同生長(zhǎng)階段單增李斯特菌生物膜的影響不同。成熟生物膜細(xì)胞與未成熟生物膜細(xì)胞相比在干燥環(huán)境中的存活率顯著提高，且當(dāng)生物膜發(fā)育至一定階段后，進(jìn)一步成熟導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性增加并不會(huì)提高單增李斯特菌的存活率[43]。此外，單增李斯特菌的抗干燥性受遺傳因素的影響。對(duì)分離自水、食品和血液的不同單增李斯特菌生物膜形成能力及其干燥抗性進(jìn)行研究時(shí)，依據(jù)干燥后菌株生物膜的活菌數(shù)減少量，將菌株分為干燥敏感型菌株、中等敏感型菌株以及耐干燥菌株[46]。生物膜細(xì)胞干燥抗性的提高可能是通過細(xì)胞代謝、細(xì)胞膜組成改變、生物膜基質(zhì)的保護(hù)作用實(shí)現(xiàn)。

2.6 消毒劑脅迫

在食品加工環(huán)境中，不同的消毒劑，例如季銨化合物、過氧化氫、過氧乙酸和次氯酸鈉廣泛用于食品接觸表面清潔。生物膜對(duì)消毒劑抗性的評(píng)估是當(dāng)下研究者廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)。

另一方面，消毒劑對(duì)細(xì)菌生物膜作用效果受其他環(huán)境因素的影響（表1）。Moorman等[50]研究了應(yīng)激處理后英諾克李斯特菌對(duì)季銨鹽消毒劑敏感性的變化，結(jié)果表明酸脅迫和饑餓脅迫提高了該菌的存活率，而熱脅迫和冷脅迫降低了其存活率。饑餓的單增李斯特菌對(duì)季銨鹽類消毒劑的敏感性降低[51]。饑餓脅迫使細(xì)胞膜的流動(dòng)性和滲透性降低，增加了表面疏水性。細(xì)胞疏水性等表面特性與細(xì)胞黏附特性及生物膜的形成有密切關(guān)系。生物膜態(tài)的細(xì)胞對(duì)殺菌劑的響應(yīng)不僅與胞外多糖和周圍營養(yǎng)物質(zhì)的機(jī)械保護(hù)作用有關(guān)，同時(shí)與生物膜細(xì)胞對(duì)脅迫適應(yīng)性等內(nèi)在生理因素有關(guān)。Belessi等[52]發(fā)現(xiàn)低溫下形成的單增李斯特菌生物膜對(duì)過氧乙酸更敏感，Barroso等[53]也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。然而Pang Xinyi等[54]發(fā)現(xiàn)單增李斯特菌在4 ℃下培養(yǎng)14 d時(shí)產(chǎn)生的生物膜對(duì)消毒劑的抗性與15 ℃下無顯著差異，上述研究結(jié)果的差異可能是不同溫度下附著的細(xì)胞數(shù)量不同所引起的。然而目前消毒劑的功效通常取決于對(duì)理想條件下培養(yǎng)的浮游微生物的殺滅效果。因此，食品生產(chǎn)者在制定清潔消毒方案時(shí)，不僅需要構(gòu)建消毒劑對(duì)浮游細(xì)菌和相關(guān)生物膜清除的綜合控制方案，還應(yīng)充分考慮環(huán)境因素設(shè)定清潔、消毒標(biāo)準(zhǔn)。

表1 不同條件下消毒劑對(duì)單增李斯特菌的作用效果Table 1 Effect of disinfectants on Listeria monocytogenes under different conditions

3 環(huán)境脅迫條件對(duì)單增李斯特菌生物膜形成影響的機(jī)制

細(xì)菌生物膜的抗脅迫機(jī)制不同于游離態(tài)細(xì)菌的抗脅迫機(jī)制。研究生物膜的形成機(jī)制須與其環(huán)境因子密切聯(lián)系起來，不同環(huán)境條件下生物膜形成的機(jī)制與途徑不相同[57]。單增李斯特菌生物膜的形成是一個(gè)復(fù)雜的過程，為了適應(yīng)外界環(huán)境變化，單增李斯特菌可通過膜流動(dòng)性改變、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控、鞭毛及胞外分泌物合成等途徑使其在不利條件下仍可存活。當(dāng)微生物應(yīng)對(duì)不良或壓力條件時(shí)，多種遺傳和生理機(jī)制改變。

3.1 膜流動(dòng)性相關(guān)的適應(yīng)機(jī)制

當(dāng)微生物暴露于各種環(huán)境壓力時(shí)，包括細(xì)胞膜流動(dòng)性、細(xì)胞疏水性在內(nèi)的細(xì)胞表面特性會(huì)發(fā)生改變。細(xì)胞膜流動(dòng)性在營養(yǎng)運(yùn)輸、細(xì)胞形態(tài)、抵御外部不利環(huán)境侵害等多種細(xì)胞生理功能中發(fā)揮重要作用。此外，細(xì)胞膜流動(dòng)性與其適應(yīng)各種環(huán)境壓力密切相關(guān)[58]，細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層流動(dòng)性主要通過調(diào)節(jié)膜脂肪酸組成來改變。在不利環(huán)境下，革蘭氏陰性菌主要通過調(diào)節(jié)不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例、環(huán)丙烷脂肪酸合成或通過順/反異構(gòu)化來改變其膜流動(dòng)性；革蘭氏陽性菌通過改變脂肪?；滈L(zhǎng)度或形成支鏈脂肪酸（branched chain fatty acid，BCFAs）、改變不飽和/飽和脂肪酸比例來改變其膜流動(dòng)性[59]。在不利條件下微生物能夠通過膜流動(dòng)性相關(guān)的適應(yīng)性策略繼續(xù)生存。

單增李斯特菌細(xì)胞膜由不常見的脂肪酸組成，尤其支鏈脂肪酸的比例較高[60]。當(dāng)單增李斯特菌在低于10 ℃下生長(zhǎng)時(shí)，細(xì)胞中的反異-支鏈脂肪酸（anteiso-BCFAs）尤其是anteiso-C15:0含量增加，從而保證適當(dāng)?shù)哪ち鲃?dòng)性[61]。同樣，在堿性條件下，主要是由于BCFAs含量增加導(dǎo)致膜流動(dòng)性提高，從而有助于菌體存活。相反，在酸性條件下，BCFAs含量下降，膜流動(dòng)性降低，從而產(chǎn)生對(duì)酸脅迫的抗性[62]。而當(dāng)病原體反復(fù)暴露于亞致死水平的消毒劑時(shí)，膜脂肪酸中飽和脂肪酸含量增加，使膜的流動(dòng)性下降，導(dǎo)致單增李斯特菌在消毒劑存在時(shí)得以生長(zhǎng)[63]，盡管流動(dòng)性降低會(huì)減少初始表面附著量，但在后期仍有較多生物膜形成。最新研究表明，生物膜內(nèi)細(xì)胞的脂肪酸含量與浮游細(xì)胞的脂肪酸含量不同，生物膜細(xì)胞中飽和脂肪酸含量比浮游細(xì)胞高，而BCFAs含量明顯低于浮游細(xì)胞，從而導(dǎo)致更高的相變溫度、堆積密度和雙層穩(wěn)定性[64]。生物膜的這些生理變化使其能適應(yīng)各種應(yīng)激條件，從而提高細(xì)菌存活率和對(duì)抗菌藥物的抵抗力。

3.2 生物膜相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)控機(jī)制

分泌蛋白作為連接細(xì)胞與周圍環(huán)境的功能決定因子，可參與單增李斯特菌在非生物和生物表面的定植過程。Combrouse等[65]定量分析了單增李斯特菌生物膜胞外成分，發(fā)現(xiàn)胞外物質(zhì)中蛋白質(zhì)的含量最高。采用蛋白酶處理生物膜能夠抑制生物膜的發(fā)育或誘導(dǎo)細(xì)胞的擴(kuò)散[66-67]，表明蛋白質(zhì)在生物膜發(fā)育和維持中具有重要作用。

生物膜內(nèi)部蛋白——內(nèi)化素A（internalin A，InlA）和生物膜相關(guān)蛋白L（biofilm-associated protein L，BapL）都是細(xì)胞外基質(zhì)的一部分[68]。InlA是細(xì)胞壁結(jié)合蛋白，也是參與宿主細(xì)胞黏附和侵襲的主要成分之一。一些單增李斯特菌菌株分泌截短的非功能形式的InlA。與表達(dá)全長(zhǎng)InlA的菌株相比，表達(dá)截短InlA的菌株生物膜形成能力顯著增強(qiáng)[68]。這種截短的分子完全釋放在細(xì)胞外介質(zhì)中，可能成為生物膜基質(zhì)的一部分。生物膜相關(guān)蛋白Bap在金黃色葡萄球菌的生物膜形成中具有重要作用，BapL是一種細(xì)胞壁錨定蛋白，與Bap相似，可促進(jìn)一些單增李斯特菌菌株的黏附，參與其生物膜形成過程[69]。BapL可促進(jìn)某些單增李斯特菌的附著，但其在生物膜形成過程中的作用尚未明確。最近又發(fā)現(xiàn)了一類內(nèi)部蛋白——內(nèi)化素L（internalin L，InlL）參與了單增李斯特菌EGD-e的初始細(xì)菌黏附和固著發(fā)育[70]?？紤]到生物膜形成受多因素影響，當(dāng)對(duì)編碼結(jié)構(gòu)蛋白的單個(gè)基因進(jìn)行突變時(shí)，通常可引起一定的表型變化，因此，在對(duì)單增李斯特菌中負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)生物膜形成的基因決定簇的特性分析仍然是一個(gè)關(guān)鍵的挑戰(zhàn)。

3.3 基于基因調(diào)控表達(dá)的機(jī)制

單增李斯特菌的環(huán)境適應(yīng)能力依賴于其具有的環(huán)境適應(yīng)因子和環(huán)境適應(yīng)調(diào)節(jié)因子[71]。表2總結(jié)了單增李斯特菌生物膜形成過程中相關(guān)功能基因。

表2 單增李斯特菌生物膜形成過程中相關(guān)功能基因/蛋白Table 2 Functional genes/proteins related to the formation of Listeria monocytogenes biofilm

在單增李斯特菌中已鑒定出許多對(duì)應(yīng)激反應(yīng)和毒力基因調(diào)控很重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，如SigB、HrcA、PrfA等。已有研究表明在單增李斯特菌中，SigB介導(dǎo)特定基因的表達(dá)，使其能在低pH值、氧化、乙醇、高滲透壓、高溫、低溫等環(huán)境脅迫壓力下生存[81]。Becker等[82]研究表明轉(zhuǎn)錄因子SigB參與了單增李斯特菌在低溫環(huán)境下的適應(yīng)過程。研究表明在相同的培養(yǎng)條件下，sigB缺失菌株生物膜的形成能力低于EGD株，添加0.3%膽汁酸鹽可以在一定程度上促進(jìn)EGD株生物被膜形成，而使sigB缺失菌株生物被膜形成能力略有降低[72]。應(yīng)激反應(yīng)基因ltrC也參與了單增李斯特菌在低溫下的生長(zhǎng)和適應(yīng)過程，ltrC受SigB調(diào)控，其在1/2a血清型的單增李斯特菌中轉(zhuǎn)錄水平高于ΔsigB突變株[73]。低溫等脅迫因素可誘導(dǎo)SigB產(chǎn)生活性。SigB在單增李斯特菌環(huán)境適應(yīng)和生物膜形成過程中具有重要作用。

SigB正調(diào)控II類應(yīng)激反應(yīng)基因，而HrcA負(fù)調(diào)控I類應(yīng)激反應(yīng)基因[83]。hrcA及dnaK對(duì)于單增李斯特菌靜態(tài)生物膜形成以及消毒劑抗性具有重要作用[74]，與野生型菌株相比，ΔhrcA突變株生物膜形成量增加，提示此突變體中I類熱休克反應(yīng)的激活對(duì)靜態(tài)生物膜的形成有利。

此外，細(xì)菌的毒力和環(huán)境適應(yīng)能力密切相關(guān)。SigB對(duì)眾多的毒力因子具有調(diào)節(jié)作用，并且與重要的毒力調(diào)節(jié)因子PrfA關(guān)系密切[84]。研究表明ΔprfA突變菌株的生物膜形成能力變?nèi)鮗75]，表明毒力調(diào)節(jié)因子PrfA對(duì)單增李斯特菌生物膜的形成具有促進(jìn)作用。prfA及受其控制的其他毒力基因，如hly、mpl、plcA、plcB和actA等在37 ℃條件下轉(zhuǎn)錄更加高效[76]。然而，prfA也可在低溫下轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄因子PrfA可以根據(jù)生長(zhǎng)溫度在活性和非活性之間切換[85]。溶血素基因hly是單增李斯特菌所必需的毒力基因，其在7 ℃和37 ℃下培養(yǎng)的不同血清型單增李斯特菌中均可很好地轉(zhuǎn)錄[86]。sigB和prfA會(huì)根據(jù)環(huán)境條件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，其活性受pH值、溫度和細(xì)菌生長(zhǎng)條件的影響。

鞭毛對(duì)單增李斯特菌的初始黏附具有重要作用。參與單增李斯特菌附著的主要基因包括鞭毛合成和運(yùn)動(dòng)相關(guān)的基因flaA、fliP、fliG、flgE、motA、motB和mogR[87]。一旦細(xì)菌細(xì)胞附著后，生物膜的進(jìn)一步成熟需要依靠細(xì)菌細(xì)胞之間的群體感應(yīng)效應(yīng)。有兩部分系統(tǒng)參與細(xì)菌的群體感應(yīng)和生物膜形成的調(diào)控[88]，一部分為多效響應(yīng)調(diào)節(jié)因子DegU，可以調(diào)節(jié)單增李斯特菌生物膜的形成。單增李斯特菌鞭毛合成及細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性都受到DegU的調(diào)控，DegU可以使細(xì)菌在高溫下黏附于塑料表面生長(zhǎng)繁殖并形成生物膜[78]，此外，DegU與單增李斯特菌致病性、耐藥性以及持久性有關(guān)；另一部分為依賴Agr調(diào)節(jié)的群體感應(yīng)系統(tǒng)，其在單增李斯特菌生物膜的發(fā)展過程中也起關(guān)鍵作用[89]。Agr操縱子可以調(diào)控毒力因子的表達(dá)，正向調(diào)控單增李斯特菌生物被膜的形成，并參與早期生物膜形成的黏附過程。與野生菌株相比，ΔagrA和ΔagrD突變菌株在聚苯乙烯表面上形成生物被膜的能力明顯降低[79]。Agr可以直接調(diào)控單增李斯特菌生物膜形成，還可通過調(diào)控單增李斯特菌毒力因子的表達(dá)間接調(diào)控生物膜的形成。

EPS包括蛋白質(zhì)、多糖及核酸等物質(zhì)，是生物膜的主要組成成分，在生物膜形成過程中EPS參與細(xì)菌的黏附過程，其形成量和性質(zhì)與生物膜結(jié)構(gòu)有重要的關(guān)系[90]。磷壁酸是李斯特菌生物膜基質(zhì)的主要成分。革蘭氏陽性菌的dlt操縱子包括dltA、dltB、dltC、dltD4 個(gè)基因，它們催化D-丙氨酸殘基并入細(xì)胞外脂磷壁酸[91]。研究表明dltA、dltB、dltC、dltD和phoPR突變體的生物膜形成能力降低，脂磷壁酸的D-丙氨酸化作用的喪失會(huì)改變細(xì)菌細(xì)胞表面電荷，減少單增李斯特菌的附著和生物膜形成[80]。環(huán)境中營養(yǎng)缺乏時(shí)，低濃度的無機(jī)磷酸鹽信號(hào)可被雙組分系統(tǒng)phoPR感應(yīng)，從而調(diào)節(jié)生物膜形成。

綜上所述，以往的研究多集中在與單增李斯特菌生物膜形成有關(guān)的已知功能的單個(gè)或多個(gè)基因上。然而，功能未知基因通常代表生物膜中30%～50%的差異表達(dá)基因[92]，而與生物膜相關(guān)的全新功能基因的解析仍較少。Stanley等[93]研究發(fā)現(xiàn)生物膜和浮游培養(yǎng)物中55%以上差異表達(dá)基因僅在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)。上述機(jī)制突出了參與生物膜細(xì)胞形成因素的多樣性?？偠灾?，微生物在壓力條件下能夠激活多種遺傳機(jī)制，使其可在不利環(huán)境中保持活力和致病性。

4 結(jié) 語

單增李斯特菌可在脅迫條件下形成生物膜黏附于物體表面，抵抗不利環(huán)境，從而引起食品持續(xù)污染。單增李斯特菌生物膜的形成受菌體自身和外界環(huán)境因素的雙重影響。然而隨著對(duì)脅迫反應(yīng)逐漸深入了解，發(fā)現(xiàn)其具有復(fù)雜性，因此，研究各種條件下單增李斯特菌生物膜的形成和變化機(jī)制對(duì)于食品加工中微生物的安全控制具有重要意義，將來可從以下3 個(gè)方面開展。

第一，從整個(gè)系統(tǒng)的角度開展分析單增李斯特菌與共存微生物間相互作用對(duì)菌群動(dòng)態(tài)及脅迫耐受性影響的研究。食品加工環(huán)境影響食品相關(guān)的微生物群落組成，在真實(shí)環(huán)境條件下，單增李斯特菌往往以多菌株?duì)顟B(tài)形成混合生物膜，僅研究某一種菌在脅迫條件下的變化不能真實(shí)地反映其在食品加工環(huán)境中所處狀態(tài)。

第二，在了解生物膜空間復(fù)雜性的同時(shí)，對(duì)生物膜內(nèi)基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的動(dòng)態(tài)維度研究有助于揭示生物膜形成及變化的真實(shí)規(guī)律。對(duì)功能未知基因以及轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行研究將有助于破譯生物膜形成的復(fù)雜機(jī)制。

第三，多重脅迫通常發(fā)生在食品加工和儲(chǔ)藏過程中，例如低pH值和高鹽濃度的處理組合，充分研究各種脅迫在時(shí)空上的綜合效應(yīng)，設(shè)計(jì)更為嚴(yán)格的綜合控制方案將是未來控制單增李斯特菌污染的主要研究方向。此外，開發(fā)環(huán)境友好型抗菌方法，包括利用酶溶液、噬菌體或微生物分泌的抗菌化合物來進(jìn)行微生物控制，仍然是一個(gè)有吸引力的挑戰(zhàn)。對(duì)脅迫反應(yīng)的研究有助于全面了解微生物生理活性以及開發(fā)新的抗微生物制劑和制定新的食品安全措施。