菟絲子對(duì)幼齡大鼠慢性腹瀉中腸道炎癥、腸道菌群及腸黏膜微觀結(jié)構(gòu)變化的影響

雷 偉，黃彩虹，任賀莊，劉 娟，楊艷娥

0 引言

慢性腹瀉是指病程在2個(gè)月以上的腹瀉或間歇期在2～4周內(nèi)的復(fù)發(fā)性腹瀉。有報(bào)道，慢性腹瀉是兒童的第三大死亡原因[1]。研究發(fā)現(xiàn)，飲食、心理、基因、環(huán)境和炎癥等多種因素均與慢性腹瀉有關(guān)，這些因素可能會(huì)改變腦腸軸，誘發(fā)胃腸道蠕動(dòng)異常或損害腸黏膜屏障功能，隨后導(dǎo)致相關(guān)的腹瀉癥狀[2]。因此，了解慢性腹瀉的發(fā)病至關(guān)重要。研究表明，腸道微生物群改變?cè)诼愿篂a的病理生理中具有重要作用，頻繁腹瀉會(huì)導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)[3]。菟絲子(Semencuscutae)是《中華草本》收錄的草藥，藥用部位為雙子葉植物旋花科植物菟絲子、南方菟絲子、金燈藤等植物的種子[4]。菟絲子中有許多天然活性成分，其中包括黃酮類、木脂素、多糖、生物堿和其他化學(xué)物質(zhì)[5]。菟絲子具有多種藥理作用，例如調(diào)節(jié)人體的內(nèi)分泌系統(tǒng)、滋補(bǔ)肝腎、改善視力和防止流產(chǎn)等[6-7]。但是目前關(guān)于菟絲子在慢性腹瀉中的研究甚少。因此，本文研究菟絲子對(duì)慢性腹瀉的改善作用，以及對(duì)腸道炎癥、腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，為臨床治療慢性腹瀉提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SD大鼠60只，雄性，體重(40±20)g，購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)于動(dòng)物房，溫度(23±2) ℃，濕度為50%～60%，光照/黑暗周期為12 h。適應(yīng)環(huán)境1周，正常飲水飲食。

1.1.2 試劑 菟絲子(純度≥98%)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。D-木糖試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。TNF-α試劑盒、IL-1β試劑盒和IL-10試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技有限公司。HE試劑盒、DAB顯色盒和免疫組化試劑盒購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司。DNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。SYBR?Premix EX TaqTMII試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司。

1.2 方法 大鼠慢性腹瀉模型建立：SD大鼠均以含生藥1 g/ml生大黃水煎劑按0.02 ml/g 劑量灌胃，1次/d，連續(xù)8 d，造成慢性腹瀉模型[8]。每只大鼠進(jìn)行單籠飼養(yǎng)，以排便量和濕糞率作為腹瀉的指標(biāo)。濕糞率：每天通過(guò)濾紙印記計(jì)算濕糞率，確定24 h內(nèi)排便的總數(shù)以及濕糞的數(shù)量，濕糞率=濕糞數(shù)量/排便總數(shù)×100%。灌胃給藥8 d后，各造模組大鼠排便量和濕糞率明顯高于假手術(shù)組(P<0.01)，表明造模成功。

1.2.1 分組及給藥 分組：60只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham組)、模型組(model組)、菟絲子低劑量組(SC-L組)和菟絲子高劑量組(SC-H組)，每組15只。model組、SC-L組和SC-H組大鼠按“1.2”項(xiàng)進(jìn)行慢性腹瀉模型制備，sham組灌胃等體積的生理鹽水。給藥方式：灌胃；給藥時(shí)間：造模結(jié)束后1 d，連續(xù)給藥14 d；給藥次數(shù)：1次/d。model組：生理鹽水4 ml/kg；SC-L組：菟絲子3 g/kg，給藥體積為4 ml/kg。SC-H組：菟絲子6 g/kg，給藥體積為4 ml/kg。

1.2.2 血清D-木糖含量測(cè)定 大鼠口服含有3%D-木糖(2 ml)的蒸餾水溶液。給予D-木糖1 h后，經(jīng)3%戊巴比妥鈉麻醉后，于腹主動(dòng)脈采血，并置于離心管中，3 000 r/min 離心15 min，吸取上層血清。將50 μl血清樣品添加到5 ml間苯三酚顯色試劑中，然后將混合物在水浴中加熱至100 ℃，持續(xù)4 min。平衡至室溫后，用酶標(biāo)儀在554 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品吸光度值并計(jì)算D-木糖含量。

1.2.3 血清TNF-α、IL-1β和IL-10含量測(cè)定 給藥14 d后，各組大鼠經(jīng)3%戊巴比妥鈉麻醉后，于腹主動(dòng)脈采血，并置于離心管中，3 000 r/min 離心15 min，吸取上層血清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，用酶聯(lián)儀在450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)定各孔的OD值，根據(jù)OD值所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清中TNF-α、IL-1β和IL-10的含量。

1.2.4 結(jié)腸組織病理變化的測(cè)定 切取小塊新鮮結(jié)腸組織，經(jīng)固定、常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，并制成5 μm的石蠟切片。切片放入蘇木素染液中5 min，自來(lái)水清洗后，置于1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，并用流水沖洗。切片放入伊紅染液中染色 3 min，流水稍洗。之后切片置于梯度酒精(70%、80%、90%、100%)中脫水，各5 min，再放入二甲苯I、II中透明，分別5 min。將切片取出，用濾紙輕輕拭干切片上殘余的二甲苯，在組織上滴加中性樹(shù)膠封片，使用萊卡顯微鏡進(jìn)行拍攝。

1.2.5 結(jié)腸黏膜超微結(jié)構(gòu)改變的測(cè)定 取大鼠的結(jié)腸組織，在4 ℃下，用2.5%戊二醛溶液固定過(guò)夜。之后用1%鋨酸固定2 h，然后用PBS沖洗3次。梯度酒精脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，進(jìn)行超薄切片(70 nm)，乙酸鈾酰和檸檬酸鉛染色后，在透射電子顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6 雙歧桿菌、乳酸桿菌和大腸桿菌含量的測(cè)定 大鼠糞便樣品中的基因組DNA用基因組DNA提取試劑盒，使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA含量，并將每個(gè)配對(duì)的樣品調(diào)節(jié)至相同濃度。使用SYBR?Premix EX TaqTMII試劑盒進(jìn)行qRT-PCR。擴(kuò)增：95 ℃ 30 s；變性：95 ℃ 40 s；退火：在不同的溫度下循環(huán)40 s (雙歧桿菌55 ℃，乳酸桿菌50 ℃，大腸桿菌52 ℃)。使用FTC-3000p實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)完成實(shí)驗(yàn)后，采用2-△△CT法分析數(shù)據(jù)。其中使用的引物見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠狀態(tài)及體重比較 造模期間，sham組大鼠反應(yīng)靈活、主動(dòng)覓食、大便成形、體重增加；model組、SC-L組、SC-H組大鼠在造模第2天出現(xiàn)稀便，之后逐漸加重，體重逐漸減輕，但是有自愈傾向。給藥期間，sham組大鼠反應(yīng)靈活、主動(dòng)覓食、大便成形、體重增加；model組大鼠有自愈傾向，稀便次數(shù)減少，體重增加；SC-L組和SC-H組大鼠給藥后體重增加，稀便次數(shù)減少。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠體重的變化

2.2 各組大鼠排便量和濕糞率比較 如表3所示，與sham組比較，model組大鼠排便量增加(P<0.05)，濕糞率顯著升高(P<0.01)；與model組相比，SC-L組和SC-H組大鼠排便量減少(P<0.05)，濕糞率明顯降低(P<0.05)。

表3 各組大鼠排便量和濕糞率

2.3 各組大鼠血清D-木糖含量比較 如表4所示，與sham組相比，model組大鼠血清D-木糖含量減少(P<0.01)；與model組相比，SC-L組和SC-H組大鼠血清D-木糖含量增加(P<0.05)。

表4 各組大鼠血清D-木糖含量

2.4 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-10含量比較 如表5所示，與sham組相比，model組大鼠血清TNF-α、IL-1β含量顯著增加(P<0.01)，IL-10含量顯著減少(P<0.01)；與model組相比，SC-L組和SC-H組大鼠血清TNF-α、IL-1β含量減少(P<0.05)，IL-10含量增加(P<0.05)。

表5 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-10含量

2.5 各組大鼠結(jié)腸組織病理變化 HE染色結(jié)果顯示，sham組大鼠結(jié)腸組織有完整的上皮和黏膜，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；與sham組相比，model組大鼠結(jié)腸組織的上皮和黏膜被嚴(yán)重破壞，結(jié)腸脈絡(luò)膜上皮輕度脫離，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；與model組相比，SC-L組和SC-H組大鼠結(jié)腸組織的上皮和黏膜有所修復(fù)，炎性細(xì)胞減少。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織病理變化(200×)

2.6 各組大鼠結(jié)腸腸黏膜超微結(jié)構(gòu)改變 電鏡結(jié)果顯示，sham組大鼠的微絨毛在腸上皮細(xì)胞中規(guī)則排列，微絨毛數(shù)量多；與sham組相比，model組大鼠結(jié)腸組織有不同程度的損傷，微絨毛排列混亂，稀疏；與model組相比，SC-L組、SC-H組大鼠結(jié)腸中的微絨毛排列較整齊，微絨毛的數(shù)量增加。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠結(jié)腸腸黏膜超微結(jié)構(gòu)的改變影響(6 000×)

2.7 各組大鼠腸道菌群數(shù)量比較 與sham組相比，model組大鼠腸道中雙歧桿菌、乳酸桿菌的相對(duì)數(shù)量減少(P<0.01)，大腸桿菌增加(P<0.01)；與model組相比，SC-L組和SC-H組大鼠腸道中雙歧桿菌、乳酸桿菌的相對(duì)數(shù)量增加(P<0.05)，大腸桿菌的相對(duì)數(shù)量減少(P<0.05)。見(jiàn)表6。

表6 各組大鼠腸道菌群相對(duì)數(shù)量

3 討論

慢性腹瀉是最常見(jiàn)的功能性胃腸病之一，其高發(fā)病率和高復(fù)發(fā)率嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[9]。研究顯示，慢性腹瀉是由于黏膜免疫系統(tǒng)激活和腸道菌群破壞上皮屏障所致[10]。有報(bào)道，炎癥在慢性腹瀉的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用[11]。炎性細(xì)胞因子如IL-1β和TNF-α?xí)绊懳改c蠕動(dòng)、分泌和重吸收，還可以增加慢性腹瀉患者的腸道敏感性[12]。石祖膠等[13]研究表明，慢性腹瀉組大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平明顯升高。本研究顯示，慢性腹瀉的大鼠血清TNF-α和IL-1β含量增加，血清IL-10含量降低。

血清D-木糖水平是腸道吸收能力的良好指標(biāo)，其吸收與外部胰臟、膽汁鹽的分泌和刷狀緣酶活性無(wú)關(guān)，并且不被人體代謝[13]。當(dāng)腹瀉發(fā)生時(shí)，小腸黏膜的絨毛壽命、長(zhǎng)度變短，數(shù)量減少，從而導(dǎo)致D-木糖吸收率下降[14]。羅明等[15]研究表明，慢性腹瀉大鼠血清中D-木糖含量明顯降低。本研究表明，慢性腹瀉大鼠血清中D-木糖含量降低，與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。

腸道中的微生物群(雙歧桿菌、乳酸桿菌和大腸桿菌等)可構(gòu)建腸道生物屏障[16]，腸道菌群失調(diào)與潰瘍性結(jié)腸炎、抗生素相關(guān)性腹瀉、結(jié)直腸癌等消化系統(tǒng)疾病密切相關(guān)[17]。張衛(wèi)平等[18]研究表明，慢性腹瀉小鼠腸道中雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸桿菌數(shù)量顯著減少，腸球菌、類桿菌數(shù)量明顯增加。本研究結(jié)果表明，慢性腹瀉大鼠腸道中雙歧桿菌、乳酸桿菌的相對(duì)數(shù)量顯著減少，大腸桿菌的相對(duì)數(shù)量明顯增加。

菟絲子是旋花科植物，具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)以及抗氧化和抗腫瘤等功能[19-20]。王翔宇等[21]研究發(fā)現(xiàn)，菟絲子提取物能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，對(duì)骨質(zhì)疏松有一定的治療作用。夏卉芳等[22]研究表明，菟絲子水提液能改善肝臟組織結(jié)構(gòu)，減少肝細(xì)胞壞死數(shù)量，促進(jìn)肝細(xì)胞再生等，因此，菟絲子水提液對(duì)環(huán)磷酰胺所致肝臟損傷有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菟絲子明顯改善了慢性腹瀉的癥狀，慢性腹瀉大鼠排便量和濕糞率下降、結(jié)腸黏膜組織有所修復(fù)、血清D-木糖和炎性因子表達(dá)發(fā)生變化，腸道菌群的數(shù)量也發(fā)生了變化。

綜上所述，菟絲子減輕大鼠的腹瀉癥狀，其可能與減輕炎性因子的表達(dá)、改善腸道菌群數(shù)量及腸黏膜損傷有關(guān)。因此，菟絲子有可能成為臨床治療慢性腹瀉的候選藥物。