宋 超，謝 育，王 冶，蒲勁松，陳 林，郭浩然，崔瀚文

0 引言

骨關(guān)節(jié)炎是一種多因素疾病，具有較高的致殘率，尚無(wú)有效的治療方法[1]。骨關(guān)節(jié)炎病理機(jī)制復(fù)雜，主要有炎性細(xì)胞因子的分泌、關(guān)節(jié)軟骨的機(jī)械性損傷以及軟骨細(xì)胞的凋亡，這些因素均能夠引起氧化應(yīng)激反應(yīng)[2]。核因子NF-E2相關(guān)因子(Nrf2)作為機(jī)體的關(guān)鍵氧化還原敏感性轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)改善機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)、促進(jìn)細(xì)胞存活以及維持細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)具有關(guān)鍵意義。沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(SIRT1)是一種高度保守的NAD+依賴(lài)的蛋白去乙?；割?lèi)，具有調(diào)節(jié)有絲分裂、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和抗凋亡等多種效應(yīng)。有報(bào)道，Nrf2和SIRT1參與骨關(guān)節(jié)炎的病理發(fā)展，兩者激活是骨關(guān)節(jié)炎治療的潛在信號(hào)通路。

玫瑰樹(shù)堿提取于夾竹桃科植物，是一種生物堿，具有抗腫瘤和抗HIV活性[3]。玫瑰樹(shù)堿對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤和膀胱癌在內(nèi)的多種腫瘤均有活性，并且與細(xì)胞周期和凋亡信號(hào)有關(guān)[4-5]。另外，研究發(fā)現(xiàn)，玫瑰樹(shù)堿也具有抗炎活性，可以減弱脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化和敗血性休克[6-7]。但玫瑰樹(shù)堿的抗骨關(guān)節(jié)炎活性研究較少，故本研究探討玫瑰樹(shù)堿對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的治療作用及對(duì)Nrf2和SIRT1信號(hào)活化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 Nrf2、HO-1、SIRT1、p-AMPK和AMPK及β-actin抗體(Abcam，英國(guó))；IL-6、IL-1β、TNF-α大鼠ELISA試劑盒(聯(lián)科，中國(guó))；電子自動(dòng)爪觸覺(jué)測(cè)試儀(瑞沃德，中國(guó))；雙氯芬酸鈉腸溶片(北京諾華制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H11021640)；玫瑰樹(shù)堿(上海陶術(shù)生物科技有限公司，中國(guó))。

1.2 動(dòng)物分組與給藥 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[8-9]，60只SPF級(jí)別雄性SD大鼠(220～250 g)隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、玫瑰樹(shù)堿低劑量組(5 mg/kg)、中劑量組(10 mg/kg)、高劑量組(20 mg/kg)和陽(yáng)性對(duì)照組(雙氯芬酸鈉腸溶片，4 mg/kg)，每組10只。術(shù)后2周灌胃給予玫瑰樹(shù)堿，模型組和假手術(shù)組大鼠給予等體積的生理鹽水，每天1次，連續(xù)給藥3周。

1.3 骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型建立 有報(bào)道，大鼠隔夜禁食12 h，使用右膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶切斷術(shù)建立骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型。腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉，固定于操作臺(tái)，將右膝關(guān)節(jié)刮毛備皮后，用碘伏消毒，在無(wú)菌條件下于膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)切約1 cm縱向切口，然后用鑷子將韌帶拉到一側(cè)，切開(kāi)內(nèi)側(cè)副韌帶以打開(kāi)關(guān)節(jié)腔，同時(shí)小心切斷前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶和內(nèi)側(cè)半月板，縫合膝蓋皮膚和關(guān)節(jié)囊，術(shù)后連續(xù)肌肉注射4 d氨芐青霉素(4×104U/d)，假手術(shù)組大鼠切開(kāi)并縫合膝蓋的皮膚和關(guān)節(jié)囊。

1.4 骨關(guān)節(jié)炎大鼠機(jī)械性異常疼痛 用電子自動(dòng)爪觸覺(jué)測(cè)試儀測(cè)量大鼠PWT值，每周1次。簡(jiǎn)要操作如下：將刺激針對(duì)準(zhǔn)大鼠的足底，隨后逐漸增加刺激力量，待大鼠感到疼痛后，移開(kāi)刺激針，設(shè)備將記錄并顯示刺激針?biāo)查g移開(kāi)的最大值，即PWT，測(cè)量時(shí)每5分鐘1次，連續(xù)3次，計(jì)算平均值。機(jī)械性異常性疼痛通過(guò)測(cè)量撤回閾值來(lái)校準(zhǔn)的von Frey細(xì)絲進(jìn)行評(píng)估。

1.5 骨關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分 根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大鼠的關(guān)節(jié)炎進(jìn)行評(píng)分(0～4分)：無(wú)關(guān)節(jié)炎計(jì)0分；關(guān)節(jié)輕度發(fā)紅腫脹計(jì)1分；關(guān)節(jié)中度發(fā)紅腫脹計(jì)2分；關(guān)節(jié)嚴(yán)重發(fā)紅腫脹計(jì)3分；關(guān)節(jié)嚴(yán)重發(fā)炎，并且負(fù)重困難計(jì)4分。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)量炎癥因子含量 待給藥結(jié)束后，大鼠腹主動(dòng)脈取血，隨后于室溫條件下靜置0.5 h，然后置于4 ℃離心機(jī)3 000 r/min離心15 min，吸取并收集上清，分裝置于-80 ℃冰箱，或采用大鼠ELISA試劑盒檢測(cè)大鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α的含量。

1.7 組織病理學(xué)觀察 大鼠脫頸椎處死，分離并收集大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織，將組織切一小塊放入10%福爾馬林溶液，在室溫下固定24 h。清洗大鼠組織標(biāo)本，隨后轉(zhuǎn)移至EDTA脫鈣液(0.5 M，pH 8)，在37 ℃條件下脫鈣6周，脫鈣期間隔3 d換1次液，將脫鈣的組織石蠟包埋，使用石蠟切片機(jī)將包埋組織切成4 μm薄片，最后蘇木精-伊紅(HE)和番紅固綠染色，顯微鏡觀察并拍照。

1.8 蛋白免疫印跡(Western blot)法 大鼠脫頸椎處死，分離并收集大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織，稱(chēng)一定量置于1.5 ml EP管，隨后加入少許蛋白裂解液，研磨儀組織勻漿，置于4 ℃離心機(jī)12 000 r/min離心15 min，吸取上清，BCA法蛋白定量，加入loading buffer(4×)于100 ℃煮沸，分裝儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱或直接上樣用SDS-PAGE電泳分離蛋白，首先用80 V電壓跑膠30 min，待樣品進(jìn)入分離膠后，用120 V電壓跑膠60 min。根據(jù)分離蛋白分子量不同，采用適當(dāng)轉(zhuǎn)膜條件將分離后的蛋白從膠轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBS緩沖液(含0.1%吐溫)室溫洗滌3次，5 min/次，隨后使用稀釋后的一抗(Nrf2、HO-1、SIRT1、AMPK和β-actin，按1∶1 000稀釋?zhuān)籶-AMPK，按1∶500稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜，TBS緩沖液(含0.1%吐溫)洗膜5次，5 min/次，用HRP標(biāo)記山羊抗兔IG和HRP標(biāo)記山羊抗鼠IG(按1∶20 000稀釋)室溫條件下置于搖床孵育90 min，最后用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑顯影反應(yīng)，并置于成像系統(tǒng)獲取目的條帶圖像。

2 結(jié)果

2.1 玫瑰樹(shù)堿對(duì)骨關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分和機(jī)械性痛閾的影響 模型組大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)較假手術(shù)組明顯增加；玫瑰樹(shù)堿中劑量、高劑量和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)較模型組均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖1A)。PWT結(jié)果表明，模型組大鼠的機(jī)械性痛閾值較假手術(shù)組明顯降低，玫瑰樹(shù)堿各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠的機(jī)械性痛閾值較模型組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖1B)。

圖1 玫瑰樹(shù)堿對(duì)骨關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)和機(jī)械性痛閾值的影響注：A.骨關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)炎評(píng)分；B.骨關(guān)節(jié)炎大鼠的機(jī)械性痛閾值。與假手術(shù)組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.2 玫瑰樹(shù)堿對(duì)骨關(guān)節(jié)炎大鼠血清中炎癥細(xì)胞因子的影響 模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；玫瑰樹(shù)堿各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 玫瑰樹(shù)堿對(duì)骨關(guān)節(jié)炎大鼠血清中炎癥細(xì)胞因子的影響注：A.骨關(guān)節(jié)炎大鼠血清中IL-1β含量；B.骨關(guān)節(jié)炎大鼠血清中IL-6含量；C.骨關(guān)節(jié)炎大鼠血清中TNF-α含量。與假手術(shù)組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01

2.3 玫瑰樹(shù)堿對(duì)骨關(guān)節(jié)炎大鼠骨關(guān)節(jié)病理學(xué)形態(tài)的影響 見(jiàn)圖3。模型組大鼠的關(guān)節(jié)軟骨較假手術(shù)組薄，軟骨細(xì)胞的數(shù)量顯著減少，番紅固綠染色發(fā)現(xiàn)軟骨聚糖有所損失。與模型組比較，玫瑰樹(shù)堿各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠的關(guān)節(jié)軟骨較模型組增厚，并且軟骨細(xì)胞和蛋白聚糖增加。

2.4 玫瑰樹(shù)堿對(duì)骨關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織中Nrf2信號(hào)蛋白表達(dá)的影響 模型組大鼠滑膜組織中Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)水平高于假手術(shù)組(P<0.05)；玫瑰樹(shù)堿各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠滑膜組織中Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)水平高于模型組(P<0.05)。見(jiàn)圖4、表1。

圖4 玫瑰樹(shù)堿對(duì)骨關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織中Nrf2信號(hào)蛋白表達(dá)的影響

表1 蛋白免疫印跡條帶統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.5 玫瑰樹(shù)堿對(duì)骨關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織中SIRT1信號(hào)蛋白表達(dá)的影響 模型組大鼠滑膜組織中SIRT1和p-AMPK/AMPK蛋白表達(dá)水平較假手術(shù)組明顯減少；玫瑰樹(shù)堿各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠滑膜組織中SIRT1和p-AMPK/AMPK蛋白表達(dá)水平較模型組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖5、表1。

圖5 玫瑰樹(shù)堿對(duì)骨關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織中SIRT1信號(hào)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎的臨床癥狀特點(diǎn)主要為慢性關(guān)節(jié)疼痛、腫脹以及活動(dòng)受限，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[10-11]。膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶術(shù)能夠建立骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型，表現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎的臨床特點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于骨關(guān)節(jié)炎的病理和藥物研究[11]。本研究首先采用膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶術(shù)建立骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型，結(jié)果表明,模型組大鼠關(guān)節(jié)炎癥狀明顯，主要是關(guān)節(jié)腫脹和疼痛。此外，玫瑰樹(shù)堿對(duì)骨關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)腫脹和疼痛具有緩解效應(yīng)，說(shuō)明玫瑰樹(shù)堿是一種潛在的治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物。

骨關(guān)節(jié)炎的病理特點(diǎn)主要表現(xiàn)為軟骨基質(zhì)降解、滑膜炎和軟骨細(xì)胞減少等[12]。本研究病理染色發(fā)現(xiàn)，骨關(guān)節(jié)炎大鼠出現(xiàn)了明顯的關(guān)節(jié)炎癥狀，包括基質(zhì)降解，表現(xiàn)為軟骨表面侵蝕、較薄的軟骨和蛋白聚糖損失。玫瑰樹(shù)堿治療后，軟骨表面完整，軟骨細(xì)胞和蛋白多糖減少明顯緩解，表明玫瑰樹(shù)堿能夠緩解骨關(guān)節(jié)炎大鼠的軟骨基質(zhì)降解?；ぱ着c骨關(guān)節(jié)疾病的疼痛和腫脹直接相關(guān)，病理?xiàng)l件下，炎性細(xì)胞能夠大量浸潤(rùn)關(guān)節(jié)滑膜，進(jìn)而釋放大量的炎癥細(xì)胞因子、趨化因子以及蛋白酶，引起關(guān)節(jié)基質(zhì)降解和骨質(zhì)破壞，促使關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展[13]。骨關(guān)節(jié)炎病理變化過(guò)程涉及大量的促炎細(xì)胞因子，IL-1β、TNF-α和IL-6尤為關(guān)鍵[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，玫瑰樹(shù)堿能夠抑制骨關(guān)節(jié)炎大鼠血清中炎癥因子IL-1β、TNF-α和IL-6的釋放。

Nrf2信號(hào)通路主要負(fù)責(zé)細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激和生理上維持細(xì)胞氧化還原平衡。一些研究表明，Nrf2信號(hào)在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，其功能障礙表現(xiàn)為對(duì)炎癥疾病的易感性[16]。Nrf2是調(diào)節(jié)抗氧化基因(包括HO-1)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，Nrf2/HO-1信號(hào)在炎癥疾病的病理變化過(guò)程中具有重要影響[17]。Nrf2敲除小鼠的關(guān)節(jié)基質(zhì)出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷，提示Nrf2/HO-1信號(hào)是骨關(guān)節(jié)炎治療的潛在靶點(diǎn)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，玫瑰樹(shù)堿能夠上調(diào)Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)，激活骨關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織中Nrf2信號(hào)。有報(bào)道，SIRT1能夠抑制炎癥反應(yīng)，還能夠調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1信號(hào)活化[19]。同時(shí)，SIRT1的激活可以增加骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨細(xì)胞中軟骨特異性基因SOX9的表達(dá)、聚集蛋白聚糖和膠原蛋白[20]。SIRT1還可以通過(guò)下調(diào)蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)或增加Bcl-2的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)人軟骨細(xì)胞的凋亡[21]。SIRT1能夠通過(guò)使蛋白激酶RNA樣的ER激酶(PERK)脫乙?；p弱PERK-eIF-2α-CHOP軸，促進(jìn)軟骨形成和骨縱向生長(zhǎng)，SIRT1的激活和抑制也可以調(diào)節(jié)AMPK的活性[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，玫瑰樹(shù)堿上調(diào)SIRT1蛋白的表達(dá)以及AMPK磷酸化，激活SIRT1信號(hào)通路。上述結(jié)果表明，玫瑰樹(shù)堿能夠調(diào)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織中SIRT1-Nrf2信號(hào)活化，參與骨關(guān)節(jié)炎的治療作用。

綜上所述，玫瑰樹(shù)堿能夠緩解骨關(guān)節(jié)炎癥狀和病理?yè)p傷，并且可能與激活滑膜組織中SIRT1-Nrf2信號(hào)通路有關(guān)。但玫瑰樹(shù)堿對(duì)SIRT1-Nrf2信號(hào)通路激活是否是直接作用，仍需進(jìn)一步研究。

致謝：感謝川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院吳旦老師在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上給予的支持和幫助