歐陽(yáng)崇志， 鄭曉輝， 張嚴(yán)， 楊銳敏， 吳文正， 周琦石

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州 510405）

腫瘤切除、骨髓炎或創(chuàng)傷導(dǎo)致的大段骨缺損的治療給外科醫(yī)生和患者提出了巨大的挑戰(zhàn)[1]。大段骨缺損有不同的手術(shù)選擇，如自體骨移植、牽張成骨或帶血管骨移植，但這些技術(shù)都有其局限性，如供體部位的骨量受限和供體部位的并發(fā)癥如長(zhǎng)期疼痛等[2]。作為目前填充大骨缺損方法的一種替代方法——Masquelet 技術(shù)是有前景的臨床療法，Masquelet 技術(shù)的誘導(dǎo)膜組織學(xué)性質(zhì)類似于滑膜組織，為骨愈合提供了有利的環(huán)境，有助于豐富的血管生成，抑制軟組織侵入骨缺損，可保護(hù)自體骨移植物不被吸收?；钛铕龇ㄗ鳛橹嗅t(yī)骨傷科三期辨證思想指導(dǎo)下的治療方法，在骨損傷早中期調(diào)控局部炎癥、促進(jìn)新骨形成方面療效確切；而桃紅四物湯作為活血祛瘀法的代表方在臨床廣泛運(yùn)用于骨折等損傷早中期治療中，并具有較好的臨床療效。本研究旨在探討誘導(dǎo)膜技術(shù)結(jié)合桃紅四物湯對(duì)大鼠骨缺損的修復(fù)作用，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 SPF 級(jí)SD 雄性大鼠30 只，體質(zhì)量240～280 g，購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SYXK（粵）2017-0179。大鼠飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)獲得廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：20181101006。將30 只SD 大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表分成3 組，即誘導(dǎo)膜+桃紅四物湯組、誘導(dǎo)膜組、對(duì)照組，每組10只。

1.2 主要試劑與儀器 蘇木素-伊紅（HE）液（美國(guó)Sigma 公司）；逆轉(zhuǎn)錄酶（RevertAidTMReverse Transcriptase，美國(guó)Thermo 公司）；RNA 提取試劑盒、SYBR Green Realtime PCR Master Mix（日本TAKARA公司）。不銹鋼內(nèi)固定鋼板、直徑1.5 mm的自攻螺釘（東莞市橫瀝燎原模具加工店）；CFX96 Touch Deep Well 定量PCR 儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物及制備 依據(jù)《醫(yī)宗金鑒》，桃紅四物湯組成：桃仁10 g、紅花5 g、川芎10 g、當(dāng)歸12 g、生地黃12g、赤芍10 g。以上中藥材飲片購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。制備方法：將上述飲片置于砂鍋容器中，加入800～1 000 mL水浸泡30 min后再煎煮30 min，過濾藥渣后留存藥液；再加入400～600 mL水煎煮藥渣30 min過濾后留存藥液。將2次煎煮的藥液混合后濃縮成生藥濃度為1 g/mL的中藥液，放入4 ℃冰箱中備用。

1.4 大鼠骨缺損誘導(dǎo)膜模型建立 一期手術(shù)：術(shù)前禁食8 h，術(shù)前使用4 萬單位青霉素肌肉注射，采用30 g/L戊巴比妥鈉（1.5 mL/kg）腹腔注射進(jìn)行麻醉。麻醉效果滿意后將大鼠側(cè)臥于手術(shù)臺(tái)，右下肢備皮消毒鋪無菌洞巾后，在股骨外側(cè)的皮膚和淺筋膜上做一個(gè)縱向切口。將闊筋膜張肌、股二頭肌和股外側(cè)肌分離牽開，自股骨大轉(zhuǎn)子至股骨髁顯露股骨外側(cè)面，在大鼠的股骨外側(cè)放置一塊長(zhǎng)為6孔的不銹鋼鋼板，在鋼板的遠(yuǎn)近端分別擰入2枚普通螺釘固定，在股骨干及鋼板中心用線鋸進(jìn)行股骨截骨，截取骨塊的長(zhǎng)度為4 mm。除對(duì)照組以外，其余2組在骨缺損區(qū)域植入長(zhǎng)度為4 mm的骨水泥填充，使用生理鹽水沖洗術(shù)區(qū)后分層縫合手術(shù)切口。

二期手術(shù)：一期手術(shù)后常規(guī)飼料喂養(yǎng)4 周，4 周后行二期手術(shù)。術(shù)前準(zhǔn)備及手術(shù)入路及麻醉方法同第一期手術(shù)。誘導(dǎo)膜+桃紅四物組和誘導(dǎo)膜組均截取大鼠尾骨，并清除周圍軟組織及軟骨，制作成備用骨粒。常規(guī)消毒鋪巾，沿股骨長(zhǎng)軸縱向切開誘導(dǎo)膜，取出誘導(dǎo)膜內(nèi)的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）的骨水泥。除外對(duì)照組，其余各組將自體骨骨粒植入骨缺損區(qū)，將誘導(dǎo)膜包繞植骨粒，縫合固定誘導(dǎo)膜，避免骨粒移位，使用生理鹽水沖洗術(shù)區(qū)，依次逐層縫合深筋膜、淺筋膜、皮膚。對(duì)照組截骨后維持常規(guī)喂養(yǎng)，不做植骨處理。術(shù)后1、24、48 h 所有大鼠肌肉注射4 萬單位青霉素。

1.5 藥物干預(yù) 誘導(dǎo)膜+桃紅四物湯組植骨術(shù)后第2 天開始使用桃紅四物湯5.9 g·kg-1·d-1灌胃處理，誘導(dǎo)膜組和對(duì)照組術(shù)后第2 天則采用與誘導(dǎo)膜+桃紅四物湯組中灌胃藥液等體積的生理鹽水灌胃。療程8周。

1.6 觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 X射線影像學(xué)檢查 植骨術(shù)后第12周使用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，行X 射線攝片檢查，以評(píng)估骨缺損區(qū)的成骨效果。按Lane-Sandhu X射線評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[3-4]從骨組織形成、骨連接、骨組織塑形3個(gè)方面評(píng)估骨的重建情況。Lane-Sandhu X 射線評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 Lane-Sandhu X 射線評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for Lane-Sandhu X-ray scoring

1.6.2 HE染色法觀察骨缺損區(qū)域組織病理形態(tài) 二期植骨手術(shù)后第12 周獲取股骨標(biāo)本后常規(guī)固定脫鈣，石蠟包埋后4 μm 連續(xù)切片，經(jīng)HE 染色制作切片，觀察骨缺損組織愈合和骨修復(fù)效果。

1. 6. 3 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）法檢測(cè)缺損區(qū)骨組織成骨相關(guān)基因表達(dá) 在植骨手術(shù)后第12 周獲取標(biāo)本后，采用TRIzol法提取植骨區(qū)域的骨組織總RNA，內(nèi)參基因?yàn)棣?actin，檢測(cè)標(biāo)本中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2（TGF-β2）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP-2）mRNA表達(dá)。所用引物由生工生物工程有限公司提供。BMP-2 引物上游序列為5’-CTGCGGTCTCCT AAAGGTCG-3’，下游序列為5’- ACTCAAACTC GCTGAGGACG-3’，擴(kuò)增長(zhǎng)度183 bp；TGF-β2引物上游序列為5’- GACCGCAACAACGCAATCTA-3’，下游序列為5’-CGTGTTGCTCCACAGTTGAC-3’，擴(kuò)增長(zhǎng)度160 bp；VEGF 引物上游序列為5’-TCGGTTCCAGAAGGGAGAG-3’，下游序列為5’-CCTGGGACCACTTGGCAT-3’，擴(kuò)增長(zhǎng)度190 bp；β-actin 引物上游序列為5’-GATCAAGATCATTGC TCCTCCTG-3’，下游序列為5’-AGGGTGTAAAA CGCAGCTCA-3’，擴(kuò)增長(zhǎng)度183 bp。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃10 min預(yù)變性；95 ℃5 s變性；60 ℃1 min退火，40 個(gè)循環(huán)。取組織總RNA 2 ng 按Thermo Scientific 公司的逆轉(zhuǎn)錄說明將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并將其做10倍稀釋，以β-actin為內(nèi)參基因，取等量cDNA（2 ng）進(jìn)行染料法RT-PCR 反應(yīng)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)時(shí)以目的基因與內(nèi)參基因的比值為目的基因的相對(duì)定量值。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 實(shí)驗(yàn)組1 只雄性大鼠在二期手術(shù)麻醉后死亡，考慮為麻醉藥物過量導(dǎo)致死亡，其余29只雄性大鼠耐受手術(shù)操作，無其他并發(fā)癥。

2.2 各組大鼠股骨正側(cè)位X 片結(jié)果比較 通過大鼠股骨的正側(cè)位X片結(jié)果可見：誘導(dǎo)膜+桃紅四物湯組形成連續(xù)骨痂并形成髓腔，骨皮質(zhì)修復(fù)較好；誘導(dǎo)膜組髓腔未完全形成，且重建皮質(zhì)薄弱，尚可見不連續(xù)的骨皮質(zhì)；對(duì)照組骨缺損區(qū)未形成骨連接，骨端硬化，髓腔閉塞。誘導(dǎo)膜+桃紅四物湯組Lane-Sandhu X 射線評(píng)分優(yōu)于其他2 組。見表2、圖1。

圖1 各組大鼠骨缺損區(qū)X線攝片檢查結(jié)果比較Figure 1 Comparison of X-ray results of bone defect area in varoius groups

表2 各組大鼠術(shù)后股骨骨缺損區(qū)Lane-Sandhu X射線評(píng)分比較Table 2 Comparison of Lane-Sandhu X-ray scores of femoral bone defect in various groups after surgery（±s）

表2 各組大鼠術(shù)后股骨骨缺損區(qū)Lane-Sandhu X射線評(píng)分比較Table 2 Comparison of Lane-Sandhu X-ray scores of femoral bone defect in various groups after surgery（±s）

①P ＜0.001，與對(duì)照組比較；②P ＜0.001，與誘導(dǎo)膜組比較

Lane-Sandhu X射線評(píng)分（分）7.44±1.01①②4.80±1.03①1.50±1.18組別誘導(dǎo)膜+桃紅四物湯組誘導(dǎo)膜組對(duì)照組

2.3 各組大鼠骨缺損區(qū)域組織形態(tài)比較 通過對(duì)骨缺損區(qū)域組織切片HE 染色觀察，可見：誘導(dǎo)膜+桃紅四物湯組骨缺損植骨區(qū)與正常骨組織交界處可見骨組織形成，成骨細(xì)胞排列整齊有序，較多骨小梁形成，成骨質(zhì)量好；誘導(dǎo)膜組骨小梁形成量較少，見少量骨組織形成；對(duì)照組纖維、肌肉、結(jié)締組織為主，骨小梁生成少，且間隙內(nèi)可見纖維組織及軟組織。見圖2。

圖2 各組大鼠骨缺損區(qū)域組織形態(tài)比較（HE染色，×400）Figure 2 Comparison of tissue morphology of bone defect area in rats of varoius groups（by HE staining，×400）

2.4 各組大鼠骨缺損區(qū)骨組織成骨相關(guān)基因表達(dá)比較 PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，誘導(dǎo)膜+桃紅四物湯組和誘導(dǎo)膜組VEGF、BMP-2、TGF-β1的mRNA 表達(dá)水平存在不同程度的上調(diào)（P＜0.01或P＜0.001），其中，誘導(dǎo)膜+桃紅四物湯組上調(diào)更為明顯，且優(yōu)于誘導(dǎo)膜組（P＜0.001）。見表3。

表3 各組大鼠骨缺損區(qū)骨組織成骨相關(guān)基因表達(dá)比較Table 3 Comparison of the expression of osteogenic related genes in bone defects in varoius groups（±s）

表3 各組大鼠骨缺損區(qū)骨組織成骨相關(guān)基因表達(dá)比較Table 3 Comparison of the expression of osteogenic related genes in bone defects in varoius groups（±s）

①P ＜0.01，②P ＜0.001，與對(duì)照組比較；③P ＜0.001，與誘導(dǎo)膜組比較

TGF-β1 2.10±0.08②③0.84±0.03①0.70±0.04組別誘導(dǎo)膜+桃紅四物湯組誘導(dǎo)膜組對(duì)照組BMP2 1.61±0.09②③0.81±0.05②0.47±0.05 VEGF 1.96±0.07②③1.06±0.05②0.61±0.02

3 討論

早期研究表明，聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）誘導(dǎo)的膜被認(rèn)為是一種有前景的血管化骨再生的治療策略[1]。采用PMMA 骨水泥填充骨缺損后，PMMA 周圍逐漸形成一層含有新血管的膜[5]。去除PMMA后，通過在誘導(dǎo)的軟組織鞘內(nèi)植骨，可以快速重建缺損。誘導(dǎo)膜的形成是由異物引起的慢性炎癥反應(yīng)引起的，誘導(dǎo)膜可防止移植物吸收，為血管形成和皮質(zhì)化創(chuàng)造良好的微環(huán)境，促進(jìn)骨形成[2，6]。誘導(dǎo)膜含有血管生成和成骨相關(guān)的生長(zhǎng)因子，如VEGF-A、BMP-2、TGF-β1[7]。VEGF 能誘導(dǎo)血管生成，在骨修復(fù)和骨再生中起重要作用，此外，血管可以提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣，并通過吸引內(nèi)皮細(xì)胞和破骨細(xì)胞以及刺激成骨細(xì)胞分化在骨重塑的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。BMP-2 可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的化學(xué)趨勢(shì)、聚集、分化，直接介導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和未成熟成骨細(xì)胞的成骨分化。TGF-β1能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和分化，幫助合成細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，調(diào)節(jié)免疫功能[8]。TGFβ1 已被證明在異物包裹中起重要作用，因此，TGF-β1 被認(rèn)為是破骨細(xì)胞-成骨細(xì)胞相互作用的假定調(diào)節(jié)因子，并在誘導(dǎo)膜中連續(xù)合成[1]。

根據(jù)中醫(yī)骨折三期辨證施治理論，骨折早中期運(yùn)用活血化瘀法可以行氣活血，祛瘀通絡(luò)，以調(diào)節(jié)患者機(jī)體的功能和體質(zhì)，從而調(diào)控骨折局部的新陳代謝?；钛铕鲋兴幙烧{(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的促血管新生因子，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，加速血管新生[9]。既往研究[10]表明，桃紅四物湯可有效減輕患者骨折相關(guān)的臨床癥狀，改善血液流變學(xué)，促進(jìn)骨折端的愈合。也有研究表明，桃紅四物湯能增加血清中MMP-2 的含量，提升血管密度，具有促血管新生作用[11]。桃紅四物湯能促進(jìn)斷端骨痂組織內(nèi)VEGF蛋白表達(dá)及增加全身血清VEGF濃度，到達(dá)表達(dá)峰值呈緩慢下降，在骨折端局部維持高表達(dá)，促進(jìn)斷端早期骨痂血管新生，加速血腫吸收和骨痂生長(zhǎng)，促進(jìn)骨痂后期微血管改建及骨痂塑形，進(jìn)而改善骨折端的愈合速度[12]。此外，李盼祥等[13]已發(fā)現(xiàn)，桃紅四物湯可以上調(diào)VEGF、BMP-2、TGF-β1 水平，進(jìn)而促進(jìn)骨折愈合。

目前，較多研究表明，桃紅四物湯和誘導(dǎo)膜都對(duì)骨形成具有較好的促進(jìn)作用，但桃紅四物湯在誘導(dǎo)膜治療骨缺損二期植骨后聯(lián)合運(yùn)用的研究較少。本研究選用的動(dòng)物模型是4 mm 骨缺損模型，構(gòu)建Masquelet 技術(shù)二期植骨治療模型后采用桃紅四物湯灌胃干預(yù)，觀察骨缺損區(qū)域的成骨效能并檢測(cè)成骨相關(guān)因子。初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，誘導(dǎo)膜技術(shù)能有效改善大鼠骨缺損部位成骨，促進(jìn)骨損傷區(qū)骨痂形成及改建，與桃紅四物湯聯(lián)合使用對(duì)骨缺損區(qū)域的成骨效能有更好的促進(jìn)作用；同時(shí)，本研究中發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)膜聯(lián)合桃紅四物湯組的VEGF、TGF-β1、BMP-2 表達(dá)水平較其他2 組升高。

綜上所述，桃紅四物湯可能通過調(diào)控誘導(dǎo)膜內(nèi)VEGF、TGF-β1、BMP-2 的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)誘導(dǎo)膜二期植骨后骨修復(fù)的作用。該結(jié)果對(duì)提升誘導(dǎo)膜二期植骨后的生物學(xué)效應(yīng)做出了初步的探索，基于此，本研究下一步擬對(duì)桃紅四物湯調(diào)控誘導(dǎo)膜二期植骨后成骨及血管化的機(jī)制進(jìn)行深入的探索。