司徒榮貴 黃 婷 彭冠明 林昌明 黃炬峰 毛積鵬,2
(1. 臺山市紅嶺種子園,廣東 臺山529223;2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院/廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510642)
松花粉,又名松花、松黃,泛指馬尾松Pinus massoniana、油松P. tabuliformis、紅松P. koraiensis和樟子松P. sylvestris等國內(nèi)松屬植物雄蕊所產(chǎn)生的干燥花粉[1]。是一味歷史悠久的藥食同用中藥,始載于東漢《神農(nóng)本草經(jīng)》,富含氨基酸、脂質(zhì)、維生素、核酸、萜類和黃酮等多種營養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)[2-4]。具有“天然微型營養(yǎng)庫”、“完全營養(yǎng)品”和“綠色寶庫中的黃金粉”等美譽(yù)[5-6]。現(xiàn)代藥理研究表明,松花粉具有調(diào)節(jié)免疫[7-8]、抗氧化[9]、抗炎[2]、抗疲勞[10]、抗重金屬毒性[11-12]、降血糖、降血脂、防止心腦血管病[13]、保護(hù)內(nèi)臟[14]、和抗腫瘤[15]等多種生物學(xué)活性和保健功能。例如,鮑善芬等[16]研究發(fā)現(xiàn)松花粉對生化反應(yīng)系統(tǒng)所產(chǎn)生的過氧化氫、超氧自由基、羥自由基和次氯酸等活性氧系具有較好的清除作用。劉協(xié)等[10]人研究表明松花粉能有效對抗酒精中毒引起的肝臟脂質(zhì)過氧化損傷,能有效的保護(hù)肝臟。錢進(jìn)[13]研究發(fā)現(xiàn)破壁松花粉還具有降低血糖的作用。雖然針對松花粉活性成分和藥理作用的研究已開展了許多深入的研究,但基本以本土松屬樹種為研究對象。對引進(jìn)的國外松如火炬松P. taeda和濕地松P. elliottii及雜交松濕加松P. elliottii×P.caribaea花粉的研究鮮有開展[17-18]。本研究基于代謝組學(xué)技術(shù)手段對馬尾松、火炬松、濕地松和濕加松4 種松花粉進(jìn)行了成分鑒定和差異比較分析。旨在為更好的開發(fā)和利用松花粉提供物質(zhì)基礎(chǔ)。
分別以種植于廣東省臺山市紅嶺種子園的濕地松和濕加松,信宜市林業(yè)科學(xué)研究所的馬尾松和英德市林業(yè)科學(xué)研究所的火炬松為研究材料。分別隨機(jī)收集了4 個樹種18 個單株的花粉。每3 個單株的花粉混合為一份樣品,共6 個生物學(xué)重復(fù)。
各樣品分別精確稱取200 mg(±1%)于10 mL EP 管中。隨后加入5 mL 甲醇溶液,充分混勻后室溫超聲60 min,4℃條件下,12 000 rpm離心12 min。取上清液濃縮至干后加200 μL 甲醇復(fù)溶,混勻后取上清液過0.22 μm 微孔濾膜。濾液保存于進(jìn)樣瓶中用于超高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用(UPLS-MS/MS)分析。
色譜條件:儀器采用Thermo Vanquish,使用ACQUITY UPLC? HSS T3 1.8 μm(2.1 mm×150 mm)色譜柱。自動進(jìn)樣器溫度設(shè)為8 ℃,以0.25 mL/min 的流速,40 ℃的柱溫,進(jìn)樣 2 μL 進(jìn)行梯度洗脫。流動相為正離子0.1%甲酸水(B1)-0.1%甲酸乙腈(A1);負(fù)離子 5 mM 甲酸銨水(B3)- 乙腈(A3)。梯度洗脫程序?yàn)?~1 min,2% A1/A3;1~9 min, 2%~50% A1/A3;9~12 min,50%~98% A1/A3;12~13.5 min,98% A1/A3;13.5~14 min,98%~2% A1/A3;14~20 min,2% A1-正模式(14~17 min,2% A3 -負(fù)模式)。
質(zhì)譜條件:儀器使用 Thermo Q Exactive Plus,電噴霧離子源(ESI)。正負(fù)離子電離模式,正離子噴霧電壓為 3.50 kV,負(fù)離子噴霧電壓為2.50 kV。鞘氣 30 arb,輔助氣10 arb。毛細(xì)管溫度325 ℃,以分辨率70 000 進(jìn)行全掃描,掃描范圍81~1 000,并采用HCD 進(jìn)行二級裂解。碰撞電壓為30 eV,同時采用動態(tài)排除去除無必要的 MS/MS 信息。
基于自建庫和公共數(shù)據(jù)庫,根據(jù)二級譜信息進(jìn)行物質(zhì)定性分析,分析時去除同位素信號、含K+離子、Na+離子和NH4+離的子重復(fù)信號。代謝物定量則是利用三重四級桿質(zhì)譜的多反應(yīng)檢測模式進(jìn)行。差異代謝物的篩選則以單變量分析的差異倍數(shù)(Fold change)值大于2 或小于0.5 及多元統(tǒng)計(jì)分析中的正交偏最小二乘法判別分析(Orthogonal Partial Least Squares—Discriminant Analysis,OPLS-DA) 模型的VIP(Variable Importance in Projection)值大于1 為篩選指標(biāo)。
通過Proteowizard 軟件(V.3.0.8789)將獲得的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成mzXML 格式,隨后利用R(V.3.3.2)的XCMS 程序包進(jìn)行峰識別、峰過濾和峰對齊分析。使用Microsoft Excel (16.0)軟件對質(zhì)核比、保留時間和峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
在進(jìn)行基于質(zhì)譜技術(shù)的代謝組學(xué)研究時,為了獲得可靠且高質(zhì)量的數(shù)據(jù),通常需要進(jìn)行質(zhì)量控制(Quality Control, QC)。各QC 樣本的主成分分析(Principle Component Analysis, PCA)結(jié)果如圖1 左所示。結(jié)果顯示QC 樣本密集分布、重復(fù)性好、差異小,說明檢測系統(tǒng)穩(wěn)定。為了發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)記物,潛在的特征峰在QC 樣本中的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative standard deviation, RSD)不能超過30%。因此,在QC 的基礎(chǔ)上通常會進(jìn)行質(zhì)量保證(Quality Assurance, QA),QA 結(jié)果如圖1 右所示。結(jié)果表明RSD 小于30%的特征峰比例達(dá)到70%以上,說明數(shù)據(jù)良好。
圖1 QC 樣本的主成分分析和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分析Fig.1 The principle component and relative standard deviation analyses of QC samples
利用UPLC-MS/MS 在馬尾松、火炬松、濕地松和濕加松4 種松花粉組織中共鑒定到368 種代謝物成分。其中有機(jī)酸類74 種、脂質(zhì)類物質(zhì)71 種、氨基酸及其衍生物66 種、糖及醇類物質(zhì)31 種、萜類化合物26 種、黃酮類化合物22 種、核苷酸及其衍生物類21 種、生物堿類14 種、維生素10 種、酚酸類5 種木質(zhì)素和香豆素類5 種、其它類化合物成分23 種。部分代謝物成分如表1 所示。
表 1 部分代謝物信息Table 1 The information of part metabolites
在4 種松花粉組織的6 個比對組中共鑒定到175 種差異積累代謝物。其中脂質(zhì)34 種、有機(jī)酸34 種、氨基酸及其衍生物31 種、糖及醇類15種、核苷酸及其衍生物15 種、萜類化合物13 種、黃酮類11 種、生物堿類5 種、維生素4 種、木脂素和香豆素2 種、酚酸類1 種、其它類10 種。KEGG 富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),鑒定到的差異代謝物主要富集于丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路,黃酮和黃酮醇代謝通路、谷胱甘肽代謝通路及單萜生物合成通路(圖2)。
圖2 差異代謝KEGG 富集分析Fig. 2 The KEGG enrichment analysis of differential metabolites
顯著性差異分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),共45 種代謝物在不同松樹的花粉組織中含量差異特異性顯著。野黑櫻苷、松脂醇、新松香酸、異槲皮苷、香芹酮、前列腺素B2、前列腺素D2、前列腺素H2、前列腺素J2、赤霉素A53 和赤霉素A4 等31 種代謝物在馬尾松花粉組織中顯著高積累。其中原兒茶酸和神經(jīng)酸在馬尾松花粉組織中特異性積累(圖3)。谷氨酰胺、組氨酸、天冬酰胺和煙酰胺等7 種代謝物在火炬松花粉組織中顯著高積累。吲哚乙酰胺和茉莉酮酸甲酯2 種代謝物在濕地松花粉組織中顯著高積累。纖維二糖、海藻糖和維生素B6 等5 種代謝物則在濕加松花粉組織中顯著高積累(表2)。
圖3 原兒茶酸和神經(jīng)酸的顯著性差異分析Fig.3 The significant differences analysis of protocatechuic acid and nervonic acid
本研究利用UPLC-MS/MS 代謝組學(xué)技術(shù)對2種國外松火炬松和濕地松、1 種雜交松濕加松和1種本土松馬尾松的花粉組織的代謝物成分進(jìn)行了鑒定及差異分析。共鑒定出代謝物368 種,主要為脂質(zhì)、有機(jī)酸、氨基酸和黃酮等化合物。其中8 種人體必需氨基酸,包括亞油酸和亞麻酸在內(nèi)的多種不飽和脂肪酸;維生素B1、B2、B3、B5、B6 和煙酰胺;兒茶素、槲皮苷和異槲皮苷等黃酮化合物;前列腺素A2、B2、C2、D2、E1、F1、F2、G2、H2、I2、J2 和海藻糖等高生物活性物質(zhì)均被成功鑒定。表明UPLC—MS/MS 及其相關(guān)代謝組學(xué)技術(shù)適用于藥用植物高生物活性物質(zhì)的鑒定及挖掘。先前已有相關(guān)學(xué)者利用UHPLC-MS/MS、LS-MS/MS 或UHPLC -QTOF/MSE 代謝組學(xué)技術(shù)分別對黃岑Scutellaria baicalensis[19]、新疆一支蒿Artemisia rupestris[20]和文冠果Xanthoceras sorbifolia[21]等藥用植物的不同采收時期或不同組織部位進(jìn)行了代謝組學(xué)分析。差異統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明,共有175 種代謝物在4 種不同松樹的花粉組織中含量有差異。其中44 種代謝物在不同松花粉組織中的含量差異特異性顯著,主要顯著高積累于馬尾松松花粉組織中。初步表明,馬尾松松花粉的營養(yǎng)物質(zhì)及活性成分含量略高于濕地松、火炬松和濕加松的松花粉。但包括8 種人體必需氨基酸在內(nèi)的絕大部分鑒定到的氨基酸及其衍生物在4 種花粉組織中的含量均無顯著差異。絕大部分的不飽和脂肪酸和黃酮類化合物在4 種花粉組織中的含量也無顯著差異。綜合表明,國外松火炬松、濕地松和濕加松及本土松樹馬尾松的松花粉組織均富含多種營養(yǎng)成分和高生物活性物質(zhì),可為相應(yīng)的藥物和保健產(chǎn)品提供原材料。本研究結(jié)果為更好的開發(fā)和利用多種松花粉提供了一定的物質(zhì)基礎(chǔ)。