肖佳音，李慶忠

黑龍江省藥品檢驗(yàn)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150088

GB/T 14233.2-2005《醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗(yàn)方法 第2 部分：生物試驗(yàn)方法》［1］是我國現(xiàn)行的醫(yī)用輸液、輸血、注射器具的國家推薦標(biāo)準(zhǔn)，是我國醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢測(cè)的重要技術(shù)依據(jù)，為保障該類醫(yī)療器械的臨床使用安全起到了至關(guān)重要的作用。GB/T 14233.2-2005 是在GB/T 16886《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)》和《中國藥典》兩部分內(nèi)容的基礎(chǔ)上，結(jié)合醫(yī)用輸液、輸血、注射器具的特性制定的，筆者認(rèn)為基本上合理，但仍兩處需進(jìn)一步完善。

1 細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)

GB/T 14233.2-2005 中細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)要求按《中國藥典》［2］細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中的“凝膠法”規(guī)定進(jìn)行。推薦輸液、輸血、注射器具細(xì)菌內(nèi)毒素限量每件不超過20 EU，與腦脊液接觸和胸內(nèi)應(yīng)用醫(yī)療器械每件不超過2.15 EU。

凝膠法是通過鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理進(jìn)行限度檢測(cè)或半定量檢測(cè)內(nèi)毒素的方法，包括凝膠限度試驗(yàn)和凝膠半定量實(shí)驗(yàn)［3］。當(dāng)檢測(cè)結(jié)果有爭(zhēng)議時(shí)，除另有規(guī)定外，以凝膠限度試驗(yàn)結(jié)果為準(zhǔn)［4］。凝膠法系通過鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝膠反應(yīng)的原理，通過觀察有無凝膠形成作為反應(yīng)的終點(diǎn)，是一種限度試驗(yàn)。使鱟試劑產(chǎn)生凝集的內(nèi)毒素的最低濃度即為鱟試劑的標(biāo)示靈敏度。按照《中國藥典》2020 版四部細(xì)菌內(nèi)毒素凝膠限度試驗(yàn)檢查法規(guī)定，當(dāng)試驗(yàn)結(jié)果顯示陰性時(shí)，判定供試品中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量小于規(guī)定的限值；而當(dāng)試驗(yàn)結(jié)果顯示陽性時(shí)，判定供試品中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量大于或等于限值。也就是說，使用細(xì)菌內(nèi)毒素凝膠法，當(dāng)出現(xiàn)陽性結(jié)果時(shí)，實(shí)際上是無法區(qū)分究竟是大于限值還是等于限值的。而GB/T 14233.2-2005 判定結(jié)果中描述的“不超過”包含小于和等于兩層含義，而“等于”凝膠限度試驗(yàn)無法觀察到的。筆者認(rèn)為應(yīng)將限值修訂為“推薦輸液、輸血、注射器具細(xì)菌內(nèi)毒素限量每件應(yīng)小于20 EU，與腦脊液接觸和胸內(nèi)應(yīng)用醫(yī)療器械每件應(yīng)小于2.15 EU”。

2 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

GB/T 14233.2-2005 中細(xì)胞毒性試驗(yàn)主要依據(jù)GB/T 16886.5-2003《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第5 部分：體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)》［5］制定的，GB/T 16886.5 已于2018 年7 月1 日?qǐng)?zhí)行新版本，即GB/T 16886.5-2017 替代原GB/T 16886.5-2003 版本。二者比較，在以下四方面有明顯變化。

2.1 培養(yǎng)基

GB/T 16886.5-2017 較上一版標(biāo)準(zhǔn)，在附錄CMTT 細(xì)胞毒性試驗(yàn)中明確了培養(yǎng)基應(yīng)使用依格爾最低限量基本培養(yǎng)基MEM（不含酚紅、谷氨酰胺、碳酸氫鈉）。MEM 是哺乳動(dòng)物細(xì)胞的理想培養(yǎng)基，相對(duì)于GB/T 14233.2-2005 中推薦的RPMI1640 培養(yǎng)基更適用于貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)，也美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）推薦的用于L929 的細(xì)胞培養(yǎng)基。

2.2 更換培養(yǎng)液后的時(shí)間

GB/T 14233.2-2005 中要求在更換培養(yǎng)液后的72 h 觀察細(xì)胞形態(tài)并測(cè)定細(xì)胞相對(duì)增殖率。GB/T 16886.5-2017 中要求在更換培養(yǎng)液后的24 h 測(cè)定。胡煜雯等［6］提出換液后培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，空白對(duì)照組細(xì)胞收到抑制甚至凋亡的可能性越大，導(dǎo)致假陰性結(jié)果的可能性越高。

2.3 布板

GB/T 14233.2-2005 中要求空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組和供試品組，每組各設(shè)6 孔。GB/T 16886.5-2017 中明確為檢查細(xì)胞接種誤差，不使用第1 列和第12 列，將空白加到96 孔板的第2 列和第11 列。左右兩列平均值大于等于0.2 且左右兩列空白平均值與全部空白平均值相差不大于15%，試驗(yàn)符合接受標(biāo)準(zhǔn)。

2.4 終結(jié)果判定

GB/T 14233.2 中，在570 nm 和630 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度計(jì)算相對(duì)增殖率，按0～4 級(jí)分級(jí)判定。因培養(yǎng)基由MEM 代替RPMI1640，相應(yīng)GB/T 16886.5把參考波長(zhǎng)改為650 nm，若供試品細(xì)胞存活率降低小于空白對(duì)照組的70%，說明該供試品具有潛在的細(xì)胞毒性。

3 討論

醫(yī)療器械作為現(xiàn)代人們醫(yī)療的必須手段，其安全有效性的評(píng)價(jià)是保障我國醫(yī)療事業(yè)健康發(fā)展的基礎(chǔ)［7］。細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)和細(xì)胞毒性試驗(yàn)是醫(yī)用輸液、輸血、注射器具類乃至全部醫(yī)療器械生物相容性評(píng)價(jià)的重要項(xiàng)目。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中“應(yīng)小于”的概念是基于凝膠法反應(yīng)原理［8］提出的，而“不超過”這一概念中的“等于”是凝膠限度試驗(yàn)無法觀察到的，極易引起歧義。關(guān)于細(xì)胞毒性試驗(yàn)，有研究表明［9-10］，在不同的試驗(yàn)條件下應(yīng)用MTT 法，對(duì)同一待檢物進(jìn)行檢測(cè)會(huì)得到不同的細(xì)胞毒性結(jié)果，因此標(biāo)準(zhǔn)化MTT 試驗(yàn)方法對(duì)醫(yī)療器械細(xì)胞毒性試驗(yàn)評(píng)價(jià)的客觀性和科學(xué)性具有十分重要的意義。

以上是筆者對(duì)GB/T 14233.2-2005 中細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)及細(xì)胞毒性試驗(yàn)的幾點(diǎn)看法，希望能對(duì)推進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)修訂起到一定的促進(jìn)作用。