強孟丹,吳劍榮,孫漢石,巫志遠,詹曉北

(1. 江南大學 糖化學與糖生物技術教育部重點實驗室,江蘇無錫 214122;2. 無錫小天鵝電器有限公司,江蘇無錫 214100)

有害微生物在自然環(huán)境中分布廣泛,許多針對家用電器微生物污染的研究證實了這些污染狀況會對人體健康造成一定危害[1-2]。其中我們日常使用頻繁的洗衣機已被證明是微生物理想的棲息地[3],微生物和營養(yǎng)物質通過水或臟衣服被引入洗衣機[4],潮濕的環(huán)境和營養(yǎng)供應為洗衣機中的微生物提供了完美的生存條件。現(xiàn)存的洗衣機抗菌、除菌技術都存在一定不足[5],因此如何安全、高效的抑制、殺滅這些微生物成為待解決的一大問題。

抗菌材料是指自身能抑制或殺滅微生物的一類功能材料[6]。目前普遍將抗菌劑分為無機、有機、天然抗菌劑[7]。最常用的天然抗菌劑有甲殼素、殼聚糖、膽礬等[8]。其中殼聚糖是甲殼素脫乙?；漠a物,在自然界中來源廣泛。由于其無細胞毒性、生物可降解、具有廣譜抗菌等特性,在復合抗菌材料方面中得到了廣泛的應用[9-10]。殼聚糖分子鏈上的功能基團使其在一定條件下對金屬離子有螯合作用[11],在殼聚糖中添加金屬極大地提高了其抗菌活性,并在許多領域展現(xiàn)出優(yōu)異的效果。Malini等通過澆鑄法制備了納米氧化鋅殼聚糖復合膜,與殼聚糖相比此復合膜表現(xiàn)出更強的抗菌活性[12]。Liang等發(fā)現(xiàn)通過控制殼聚糖/銀納米顆粒復合微球(CAgMs)尺寸可對其抗菌性能起到影響作用[13]。進一步的,許多此類的研究均證實了殼聚糖金屬復合材料在抗菌領域有極好的效果[14-15]。

本研究選用天然抗菌材料殼聚糖,將其與無機抗菌劑Ag結合制備納米銀—殼聚糖(AgNPs-CTS)復合溶膠,并對復合溶膠的制備溫度進行探究。通過紫外光譜、粒徑對AgNPs的大小、均一程度進行測定,通過透射電鏡對溶膠中的Ag顆粒的形態(tài)進行觀測。進一步的將復合溶膠與含Cu的殼聚糖溶液混合,制備成AgNPs/Cu-CTS復合顆粒。對復合顆粒的機械強度、抑菌性能進行測定,并利用掃描電鏡觀測其表面與截面形態(tài)。將制備好的顆粒應用在洗衣機抗菌程序中,檢測其在機洗過程中的抑菌效果、損耗程度。旨在制備一種天然無污染的應用于機洗過程的抗菌材料。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

殼聚糖(脫乙酰度80-95%)、硝酸銀、乙酸銅、硼氫化鈉、冰醋酸、鄰苯二甲酸二丁酯、戊二醛(25%水溶液)、氫氧化鈉、無水乙醇等,國藥集團化學試劑有限公司。標準洗滌物,按照標準GB/T411要求中的漂白中平布。大腸桿菌(E.coli)ATCC-25922、金黃色葡萄球菌(S.aureus)ATCC-6538,上海保藏生物技術中心。

TB80V80WDCLG全自動洗衣機,無錫小天鵝電器有限公司;PXY-DHS-35X40隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海躍進醫(yī)療器械廠;GI80DWS立式自動壓力蒸汽滅菌器,致微(廈門)儀器有限公司;KQ-2型顆粒強度測定儀,南京科環(huán)分析儀器有限公司;SCIENTZ-10N冷凍干燥機,寧波新芝生物科技股份有限公司;U-3900紫外可見分光光度計,日本日立株式會社;ZEN3700納米粒度及Zate電位分析儀,英國馬爾文儀器有限公司;Quanta 200掃描電子顯微鏡,荷蘭Fei公司;H-7650透射電鏡,日本日立株式會社。

1.2 AgNPs-CTS復合溶膠與AgNPs/Cu-CTS復合顆粒的制備

AgNPs-CTS復合溶膠的制備參考文獻[16]中的方法進行改進,稱取一定質量的殼聚糖,并將之溶于體積分數(shù)為2%的醋酸水溶液,配置質量濃度為4%的CTS的醋酸水溶液,置于磁力攪拌器攪拌至殼聚糖完全溶解。量取40 mL上述配制的CTS的醋酸溶液,加入1 mL一定濃度的AgNO3水溶液,攪拌30 min使Ag+與CTS充分交聯(lián),然后加入硼氫化鈉溶液作為還原劑[反應體系中n(AgNO3)∶ n(還原劑)=1∶ 1.5,確保還原反應進行完全],在60℃加熱攪拌,反應至溶液顏色不再加深,自然冷卻至室溫,得到AgNPs-CTS復合溶膠。

AgNPs/Cu-CTS復合顆粒的制備參考文獻[17-18]中的方法進行改進,將7.2 g殼聚糖與0.4 g乙酸銅溶于60 mL 4%乙酸中,然后加入40 mL AgNPs-CTS復合抗菌溶膠,攪拌均勻。加入2.5 mL鄰苯二甲酸二丁酯,攪拌5 min,然后加入10 mL 0.25%的戊二醛溶液,繼續(xù)攪拌10 min。溶液形成凝膠狀,取合適大小凝膠揉成顆粒狀,置于2 wt%的氫氧化鈉溶液中浸泡3 h,用蒸餾水洗滌后,再放入50%乙醇溶液中密封浸泡2 h后,用蒸餾水洗滌至中性取出。置于烘箱干燥后得到殼聚糖多孔顆粒。

1.3 AgNPs-CTS復合溶膠的表征

1.3.1 AgNPs-CTS復合溶膠的紫外吸收光譜

采用U-3900紫外可見分光光度計對AgNPs-CTS復合溶膠進行紫外吸收光譜測定,表征不同制備條件下所得到的AgNPs的共振吸收峰。測試前,將待測樣品稀釋相同倍數(shù)并超聲分散5 min。取一定量分散后的溶液,置于石英樣品池中,待測。

1.3.2 AgNPs-CTS復合溶膠的粒徑

采用ZEN3700納米粒度及Zeta電位分析儀對AgNPs-CTS復合溶膠的粒徑進行測定,表征不同制備條件下所得到的AgNPs的水合粒徑。測試前,將待測樣品稀釋相同倍數(shù)并超聲分散5 min。取1 mL分散后的溶液,置于樣品池中,待測。

1.3.4 AgNPs-CTS復合溶膠的抑菌性能

采用牛津杯[19-20]法進行抑菌圈測定。將滅菌后的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基液倒入培養(yǎng)皿中,待其凝固后移取0.2 mL稀釋度為10-3的菌液涂布均勻。用鑷子將滅過菌的牛津杯放入培養(yǎng)皿中,每個平皿中均勻地放置2只牛津杯。吸取0.2 mL AgNPs-CTS復合溶膠至牛津杯中。將培養(yǎng)皿置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后測定抑菌圈直徑,設置無菌水作為對照。

1.4 AgNPs/Cu-CTS復合顆粒的表征

1.4.1 AgNPs/Cu-CTS復合顆粒機械強度

取一定質量制備好的抑菌顆粒置于鼓風干燥箱中于60℃下干燥,失水至恒重。利用顆粒強度測定儀測定不同組顆粒的破碎強度,樣品測定5次取平均值。

1.4.2 AgNPs/Cu-CTS復合顆粒平板抑菌

選取大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為代表菌種。將滅菌后的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基液倒入培養(yǎng)皿中,迅速放入制備好的殼聚糖抑菌顆粒,待其凝固后移取2 mL稀釋度為10-3的菌液涂布均勻。將培養(yǎng)皿于生化培養(yǎng)箱中37℃下培養(yǎng)12 h,記錄抑菌圈大小。

1.5 AgNPs/Cu-CTS復合顆粒的機洗應用

1.5.1 抑菌性能損耗

將抑菌顆粒在標準程序下進行洗滌,每洗滌20次后取樣,依據(jù)1.3.2方法進行平板抑菌實驗,測定抑菌圈大小。以抑菌圈的大小衡量復合抗菌材料抑菌性能損耗。

1.5.2 抑菌效果檢測

依據(jù)GB 21551.5-2010[21]附錄AA《帶有除菌功能電動洗衣機除菌試驗方法》方法進行檢測。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實驗均重復3次以上,獲得的值表示為平均值±標準偏差(ˉX±SD)。使用軟件SPSS 18.0進行單因素方差分析,基于Duncan的多重比較檢驗,確定值之間的差異,不同字母標注表示具有顯著差異(P<0.05)。

2 結果與討論

2.1 AgNPs-CTS復合溶膠的制備和表征

首先考察了制備條件對AgNPs-CTS復合溶膠的影響,并對其微觀形態(tài)進行了表征,結果如圖1所示。從紫外—可見光譜分析可以看出,所有溫度下制備的樣品均在400 nm～450 nm之間出現(xiàn)吸收峰。根據(jù)之前的研究可知殼聚糖通過氨基和羥基與銀離子相互作用,AgNPs在410 nm左右處出現(xiàn)特征吸收峰[22-23]。隨著溫度的升高AgNPs的特征吸收峰逐漸增強,峰形逐漸變寬,說明所生成的AgNPs顆粒濃度增大并且粒徑分布趨向不均勻。升高溫度可能會提高還原反應的速度,增加反應體系中AgNPs的成核率,導致AgNPs的成核速率大于AgNPs晶核的生長速率,從而形成更多的納米Ag顆粒。同時,反應體系中存在有大量水溶劑,水在高溫時易揮發(fā),使得反應體系中的AgNO3濃度增加,從而導致制備的AgNPs粒徑較大、分布較寬。因而,本實驗選擇反應溫度選擇在60℃為制備復合抗菌劑的最佳反應溫度。

圖1 AgNPs-CTS復合溶膠的表征

測定不同反應溫度下制備的AgNPs-CTS復合溶膠的粒徑和PDI,如圖1所示。粒徑即為顆粒的大小,在本研究中來反映納米Ag顆粒大小。PDI是多分散性指數(shù),用于描述聚合物分子量分布,在本研究中用來反映納米Ag顆粒的粒度分布情況。可以看出,隨著反應溫度的提升,樣品粒徑呈現(xiàn)出先減小后增大的趨勢。在反應溫度為60℃時樣品的粒徑最小,且PDI值也最低。這表明納米Ag顆粒在此條件下尺寸最小,且分布更為均一。因此60℃為制備AgNPs-CTS復合溶膠的最優(yōu)溫度,這與紫外—可見光譜的結果一致。對AgNPs-CTS復合溶膠的微觀結構進行分析。進一步對納米Ag顆粒進行TEM分析,發(fā)現(xiàn)制得的納米Ag顆粒均呈近球形,粒徑約為20 nm左右,大小相對均勻,并未發(fā)生團聚現(xiàn)象,這與之前的研究[24]結果一致。

采用平板培養(yǎng)法測定AgNPs-CTS復合溶膠對大腸桿菌和金黃素葡萄球菌的抑菌效果,以抑菌圈大小作為衡量指標,其中左側為空白對照,右側為復合溶膠。如圖2所示,復合溶膠對兩種菌都起到了明顯的抑制作用,其中大腸桿菌的抑菌圈大小約為2.3 cm,金黃色葡萄球菌的抑菌圈大小約為2.5 cm,而空白對照則并未有明顯抑菌圈出現(xiàn)。

圖2 AgNPs-CTS復合溶膠的抑菌圈

2.2 AgNPs/Cu-CTS復合顆粒的制備和表征

抑菌材料在機洗過程中需要承受水流的沖擊和機器運轉產生的摩擦,因此不能直接以溶膠狀進行應用。本研究進一步以上述制備的AgNPs-CTS復合溶膠為基礎,制備了AgNPs/Cu-CTS復合顆粒。利用顆粒強度測定儀對制備好的抑菌顆粒進行檢測,測定其機械強度為554.1±17.9 N,達到相關強度要求。進一步對AgNPs/Cu-CTS復合顆粒的表面和截面進行了掃描電鏡分析,結果如圖3所示?？梢钥闯?復合顆粒的內部和表面均呈現(xiàn)出孔狀結構,這可能與致孔劑鄰苯二甲酸二丁酯的加入有關。此外,本研究中復合顆粒的多孔結構可為被吸附物Ag、Cu提供更多的吸附位點。同時,較高總表面積和多孔結構可能更有利于復合顆粒對細菌的殺滅。

圖3 AgNPs/Cu-CTS復合顆粒的SEM圖

采用平板培養(yǎng)法測定AgNPs/Cu-CTS復合顆粒對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果,以抑菌圈大小作為衡量指標。如圖4所示,復合顆粒對兩種菌都起到了明顯的抑制作用,其中大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的抑菌圈半徑均為0.5 cm。與復合溶膠相比顆粒材料抑菌圈大小有所減弱,但顆粒形態(tài)的復合材料能更好的應用在機洗程序中,且能更好的保持長效抑菌的效果。

圖4 AgNPs/Cu-CTS復合顆粒的抑菌圈

2.3 AgNPs/Cu-CTS復合顆粒的機洗應用損耗測試

抑菌顆粒長期置于洗衣機內部使用,其壽命參數(shù)也十分關鍵。損耗測試結果如表1所示,隨著洗滌次數(shù)的增多,抑菌顆粒在平板上的抑菌圈大小有所減弱,但其減弱并不明顯。未經洗滌的抑菌材料其抑菌圈大小在0.50 cm,當進行50次時后抑菌圈大小仍有0.40 cm。殼聚糖能夠通過離子交換、螯合等機制吸附金屬離子[25],金屬離子與殼聚糖通過氨基和羥基發(fā)生相互作用。這可能對抑菌顆粒在長期洗滌損耗的抑菌效果中起到了正向作用。

表1 抑菌顆粒機洗損耗

對復合顆粒機洗的抑菌效果進行了測試,結果如表2所示。結果表明,抑菌顆粒對菌布上的細菌有著較強的殺滅作用,且洗滌條件改變后抑菌效果達到了99.15%。這可能是因為AgNps、Cu+和CTS在洗滌環(huán)境中對菌體的作用使得很大一部分細菌被殺滅,同時改變后的環(huán)境更不利于菌體的存在。本復合材料在應用中具有較優(yōu)的效果。

表2 復合顆粒機洗抑菌率

3 結論

本研究制備了AgNPs-CTS復合溶膠,對溶膠性能進行了表征,證明復合溶膠具有良好的抗菌性能。進一步的制備得到了AgNPs/Cu-CTS復合顆粒,對其形態(tài)、抑菌效果和在機洗中的應用進行了研究。AgNPs/Cu-CTS復合顆粒是一種具有多孔結構和長效抑菌性的復合抗菌材料。此材料在機洗過程中取得了較好的抑菌效果。