劉 宇 鄭國(guó)俠 王云華

大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院，遼寧省大連市 116000

細(xì)菌黏附普遍存在于自然界和日常生活中，是重要的生物學(xué)現(xiàn)象。細(xì)菌在宿主表面的黏附是細(xì)菌感染的關(guān)鍵步驟，單個(gè)細(xì)菌的黏附是生物膜形成的第一個(gè)步驟。細(xì)菌黏附引起的感染已被公認(rèn)為是全球范圍內(nèi)最關(guān)鍵的健康挑戰(zhàn)之一，每年受影響的人數(shù)以百萬(wàn)計(jì)[1]。了解細(xì)菌黏附的機(jī)制及其影響因素、檢測(cè)細(xì)菌在各種材料表面的黏附，將使得我們能夠根據(jù)需要來(lái)調(diào)節(jié)其黏附能力。本文從影響細(xì)菌黏附的因素及細(xì)菌黏附的研究模型進(jìn)行綜述。

1 常見(jiàn)的細(xì)菌黏附

細(xì)菌黏附主要表現(xiàn)在醫(yī)學(xué)、食品安全和工業(yè)方面。在大多數(shù)場(chǎng)合，細(xì)菌黏附帶來(lái)的是負(fù)面的影響；但也有一些場(chǎng)合，細(xì)菌黏附是有利的。

在醫(yī)學(xué)方面，細(xì)菌黏附于宿主細(xì)胞，是跨越細(xì)胞和組織屏障的起點(diǎn)。建立對(duì)宿主細(xì)胞的穩(wěn)定黏附后，細(xì)菌能夠在宿主內(nèi)傳播并表達(dá)或進(jìn)一步釋放毒力因子，從而感染宿主細(xì)胞。細(xì)菌黏附引起的手術(shù)感染是醫(yī)院最常見(jiàn)的感染之一，77%病例的死亡直接歸因于手術(shù)感染。例如，在使用醫(yī)療設(shè)備(如植入物)進(jìn)行組織和器官功能重建時(shí)，醫(yī)療設(shè)備容易被細(xì)菌污染，之后黏附的細(xì)菌會(huì)導(dǎo)致成熟和復(fù)雜的三維生物膜結(jié)構(gòu)形成，感染周?chē)M織，并可能引起復(fù)雜的慢性感染。細(xì)菌主要通過(guò)界面作用黏附在各類(lèi)留置醫(yī)療設(shè)備材料表面，例如導(dǎo)管、支架和牙科種植體，并經(jīng)常發(fā)生生物膜相關(guān)感染。此外，口腔是多種微生物共存的微環(huán)境，牙科種植體存在于這種環(huán)境中，易使細(xì)菌定植于其結(jié)構(gòu)表面，尤其是牙齦結(jié)構(gòu)基臺(tái)的表面，唾液沖刷及物理操作不易清潔，使得種植體周?chē)M織發(fā)生細(xì)菌感染率升高[2]。

在食品安全方面，細(xì)菌主要黏附于食物接觸表面，包括食物容器、器皿、切片機(jī)、盤(pán)子、水壺、切割木板、刀具、鋼托盤(pán)和鏟子、不銹鋼容器和塑料容器中，是食源性疾病暴發(fā)的主要原因之一。據(jù)報(bào)道，2018 年因國(guó)內(nèi)食品細(xì)菌黏附危害導(dǎo)致死亡人數(shù)達(dá)到上萬(wàn)人，經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)近 100億。

在工業(yè)方面，細(xì)菌容易在工業(yè)輸水管道內(nèi)壁、蓄水池、游泳池的池壁表面、廢水過(guò)濾分離膜和飲用水過(guò)濾器膜表面等附著和生長(zhǎng)，細(xì)菌等微生物滋生會(huì)導(dǎo)致用水水質(zhì)變差、管道過(guò)濾膜堵塞和危及人類(lèi)健康等重大危害。細(xì)菌黏附的影響有時(shí)也是有利的。例如，在利用細(xì)菌處理污水時(shí)，增加細(xì)菌在水處理設(shè)備上的黏附能力，將減少細(xì)菌的損傷量，延長(zhǎng)細(xì)菌補(bǔ)充周期，降低生產(chǎn)成本。在利用固定床進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)生物制品時(shí)，增加細(xì)菌在固定床上的黏附，也有利于延長(zhǎng)其使用周期。

2 細(xì)菌黏附的影響因素

細(xì)菌黏附是細(xì)菌與材料表面的相互作用過(guò)程。細(xì)菌本身的特性、材料特性和黏附環(huán)境等多個(gè)方面的因素均會(huì)對(duì)細(xì)菌的黏附過(guò)程產(chǎn)生重要影響。對(duì)這些影響因素及其作用機(jī)制的深入研究，將有助于抗菌材料和抗菌藥物的開(kāi)發(fā)。

2.1 細(xì)菌因素 細(xì)菌本身的特性主要包括細(xì)菌含有的特定基因、表達(dá)的蛋白和分泌的黏性物質(zhì)。有些細(xì)菌可能表達(dá)與黏附相關(guān)的蛋白，其含量表達(dá)量通常與細(xì)菌黏附成正比。吳彥平等人通過(guò)比較沙門(mén)氏菌腸炎血清型鼠傷寒沙門(mén)氏菌(S. Typhimurium)和沙門(mén)氏菌腸炎血清型鼠傷寒亞種(S. Typhi)PagN等位基因變體與不同腸細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)層粘連蛋白的結(jié)合情況發(fā)現(xiàn)，鼠傷寒沙門(mén)氏菌PagN等位基因變體的結(jié)合較好、黏附較強(qiáng)。并且，取PagN等位基因中49和109處的氨基酸殘基進(jìn)行取代分析顯示，殘基49處的谷氨酸增加了鼠傷寒沙門(mén)氏菌PagN的黏附[3]。另外，Horstmann等人利用甲基化酶使鼠傷寒沙門(mén)氏菌鞭毛的鞭毛蛋白中的賴(lài)氨酸甲基化，增強(qiáng)了沙門(mén)氏菌對(duì)鞭毛的依賴(lài)，促進(jìn)了其與上皮細(xì)胞的黏附；Pilicides是抑制革蘭陰性菌中伴侶通路的化合物，該抑制劑靶向菌毛伴侶蛋白PapD，利用Pilicides可以將細(xì)菌對(duì)細(xì)胞株的黏附率降低90%，說(shuō)明菌毛伴侶蛋白在細(xì)菌的黏附中發(fā)揮重要作用[4]。

同時(shí)，細(xì)菌可以通過(guò)細(xì)胞膜分泌的黏性物質(zhì)(如黏附素、表層蛋白)與材料結(jié)合而黏附在其表面。例如，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期或穩(wěn)定期收獲的乳酸菌，其黏附性顯著下降，可能是因?yàn)樵谶@兩個(gè)時(shí)期收獲的乳酸菌表達(dá)的黏附素較低，菌體活性較弱；Vaca等人發(fā)現(xiàn)鮑曼不動(dòng)桿菌的表面黏附素——三聚體自動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Acinetobacter trimeric autotransporter，Ata)表達(dá)降低時(shí)，黏附于細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)(Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ和Ln膠原蛋白)的細(xì)菌也顯著減少，進(jìn)而證明了Ata是鮑曼不動(dòng)桿菌與ECM結(jié)合的至關(guān)重要成分，從而突出了Ata在細(xì)菌黏附中的重要性。此外，去除表層蛋白(S層蛋白)后的乳酸菌菌體，其黏附性顯著下降。

2.2 黏附材料 從與細(xì)菌相互作用的黏附材料方面來(lái)說(shuō)，影響?zhàn)じ阶饔玫闹饕蛩匕ú牧媳旧淼男再|(zhì)、其表面結(jié)構(gòu)及摻雜材料等。通過(guò)改進(jìn)材料性能或結(jié)構(gòu)來(lái)抑制細(xì)菌的黏附，可以大幅度減少殺菌劑或消毒劑的使用，具有重要的實(shí)用價(jià)值，是目前研究的重要領(lǐng)域之一。

2.2.1 材料的親疏水與帶電性質(zhì):黏附材料本身的性質(zhì)，主要包括親疏水性能、帶電狀態(tài)等方面，對(duì)細(xì)菌的黏附有較大的影響。通常，細(xì)菌黏附與疏水性成反比。例如在玻璃上大腸桿菌黏附較多，而在聚四氟乙烯黏附較少，主要是聚四氟乙烯的疏水性較高。武鉞和金建烽等人利用氧化石墨烯通過(guò)電鍍法成功加載于純鈦表面，提高了純鈦表面的親水性能，有利于金黃色葡萄球菌的黏附。Camargo等人通過(guò)制備兩種涂層，即利用季銨化過(guò)程將氮化鈦(titanium nitride，TiN)和碳化硅(Silicon carbide，SiC)上的表面氮轉(zhuǎn)化為正電荷生產(chǎn)季銨化的氮化鈦(Quaternized titanium nitride，QTiN)和季銨化的碳化硅(Quaternized silicon carbide，QSiC)。通過(guò)掃描電鏡(Scanning electron microscope，SEM)圖像證實(shí)，相比于TiN和SiC涂層，疏水性較高的QTiN和QSiC涂層組上牙齦卟啉單胞菌大大減少[5]。

細(xì)菌的黏附能力還受材料表面的帶電狀態(tài)直接影響。朱青青等人發(fā)現(xiàn)在口腔pH條件下一些細(xì)菌本身帶負(fù)電荷，與唾液中含量豐富的鈣離子(Ca2+)結(jié)合，通過(guò)靜電作用形成細(xì)菌—鈣—細(xì)菌的結(jié)合，使細(xì)菌附著于牙面上。同時(shí)，研究表明鈦摻雜類(lèi)金剛石碳(Titanium doped diamond-like carbon，Ti-DLC)涂層中，隨著作為電子供體的鈦含量的增加，大腸桿菌和銅綠假單胞菌的黏附降低，主要是因?yàn)殡娮庸w大的表面部分，增加了Ti-DLC涂層的負(fù)電荷，而這兩種細(xì)菌本身帶負(fù)電荷，因而與涂層產(chǎn)生了排斥反應(yīng)，其黏附下降[6]。

2.2.2 材料的表面形貌:除了材料本身的性質(zhì)之外，材料的表面形貌對(duì)細(xì)菌的黏附也起到了決定性的作用。

材料表面形貌的主要因素之一是表面粗糙度，細(xì)菌黏附通常和粗糙度成正比。James等人使用具有各種表面積和粗糙度的植入物，包括Natrelle(光滑表面)、Smooth Silk/Silk Surface(絲綢)、Velvet Surface(天鵝絨)、Siltex和Biocell等不同粗糙度的表面，在9個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中評(píng)估了表皮葡萄球菌、銅綠假單胞菌和Pickalti菌3種細(xì)菌的附著。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與表面較光滑(光滑、絲綢和天鵝絨)的植入物相比，具有較粗糙紋理的植入物表面(Siltex和Biocell)的細(xì)菌黏附較多[7]。Tupinambá等人創(chuàng)建了等離子體聚合膜沉積物以修飾金屬正畸托槽，降低其表面粗糙度，抑制了細(xì)菌黏附[8]。

此外，材料表面的特征性結(jié)構(gòu)，也會(huì)影響細(xì)菌黏附的偏好性。王麗云等人在聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(Polyethylene terephthalate，PET)基底上構(gòu)建具有多圖案元素、尺寸梯度的三維規(guī)則結(jié)構(gòu)，包含彎曲邊緣、直邊緣、凸出柱體平面以及柱體之間的凹谷平面的三維規(guī)則形貌，并有六個(gè)尺寸梯度，系統(tǒng)研究不同培養(yǎng)條件下三維形貌對(duì)細(xì)菌黏附的影響，結(jié)果表明細(xì)菌對(duì)各圖案元素黏附時(shí)表現(xiàn)出的偏好性越小，菌體在該三維規(guī)則微觀形貌的黏附數(shù)量越少，其中對(duì)三維結(jié)構(gòu)曲率小的邊緣地帶表現(xiàn)出明顯的偏好性黏附。如果將此物理方法與抗生素或其他抑菌劑修飾表面的方法結(jié)合，即在此邊緣區(qū)域連接抑菌劑，既可以有效抑制細(xì)菌對(duì)表面的污染，又可以大大降低抑菌劑的使用劑量。表皮葡萄球菌RP62A(ATCC 35984)在聚乙二醇(Polyethylene glycol，PEG)織造的聚尿烷(Polyurethane urea，PUU)表面上的黏附研究揭示結(jié)合紋理和PEG處理可減少細(xì)菌黏附。Schwibbert等人利用飛秒激光誘導(dǎo)的亞微米結(jié)構(gòu)修改聚乙烯(Polyethylene，PE)表面形貌，用大腸桿菌測(cè)試菌株對(duì)表面進(jìn)行細(xì)菌定殖研究。結(jié)果表明，納米結(jié)構(gòu)使大腸桿菌的黏附性降低[9]。通過(guò)對(duì)特定表面進(jìn)行圖案化來(lái)改變細(xì)菌的黏附性能，符合綠色環(huán)保的發(fā)展趨勢(shì)，是當(dāng)前研究的重點(diǎn)之一。

2.2.3 材料的摻雜:用抗菌物質(zhì)對(duì)材料進(jìn)行摻雜，也會(huì)大幅度提高材料的抗黏附性能。Silvestro等人利用透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid，HA)的不同百分比(1%～35%)來(lái)修飾殼聚糖(Chitosan，CS)，發(fā)現(xiàn)相比于未摻入HA的CS基質(zhì)來(lái)說(shuō)，當(dāng)摻入HA濃度≥5%時(shí)CS基質(zhì)能夠避免表皮葡萄球菌黏附[10]。Piarali等人通過(guò)在紡絲過(guò)程之前將聚羥基鏈烷酸酯紡絲溶液、合成抗菌肽Amhelin和酶Dispersin B添加到溶液中，將它們共價(jià)地偶聯(lián)到纖維上，形成活化的聚羥基鏈烷酸酯網(wǎng)狀物，接著感染表皮葡萄球菌?？咕Y選結(jié)果顯示，用Amhelin和Dispersin B進(jìn)行表面活化的纖維可使纖維表面上附著的細(xì)菌減少83%。呂夢(mèng)萌等人發(fā)現(xiàn)洗必泰負(fù)載的銀修飾介孔二氧化硅納米粒子(The CHX-loaded, silver-decorated mesoporous silica nanoparticles，Ag-MSNs @ CHX)可以通過(guò)破壞細(xì)菌的生物膜，抑制革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌大腸桿菌生長(zhǎng)，減少其黏附[1]。

2.2.4 細(xì)胞表面分子表達(dá)：當(dāng)細(xì)菌在生物體內(nèi)定植時(shí)，其黏附表面通常是細(xì)胞表面，此時(shí)細(xì)胞表面某些分子的表達(dá)會(huì)影響細(xì)菌的黏附。對(duì)于細(xì)菌在細(xì)胞表面的黏附研究發(fā)現(xiàn)，Caco-2細(xì)胞被大腸桿菌O157：H7感染后，Caco-2細(xì)胞中的整合素b1升高。當(dāng)Caco-2細(xì)胞整合素b1受到抗體阻斷或CRISPR/Cas9敲除時(shí)，其表面細(xì)菌附著減少。說(shuō)明細(xì)胞表面的整合素起到了促進(jìn)黏附的作用，這可能是因?yàn)楸淮竽c桿菌O157：H7感染的細(xì)胞中，整合素會(huì)提高talin蛋白、paxillin蛋白和α-肌動(dòng)蛋白等黏附(Focal adhesion，F(xiàn)A)蛋白的表達(dá)水平[11]。Huebinger等人使用嚙齒動(dòng)物手術(shù)感染模型，在切口部位感染了銅綠假單胞菌，用結(jié)合到聚合物支架上的重組細(xì)菌黏附素——多價(jià)黏附分子(Multivalent adhesion molecules，MAM)片段制成MAM7抑制劑治療感染，結(jié)果顯示MAM7可以抑制最初黏附在組織手術(shù)切口中的細(xì)菌，其主要原因是該抑制劑會(huì)附著于宿主表面受體纖連蛋白和磷脂酸酯，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性排斥抑制細(xì)菌附著。

2.3 黏附環(huán)境 高溫、離子濃度和電等因素會(huì)影響細(xì)菌的黏附。高溫處理的唾液乳桿菌和植物乳桿菌，其黏附性顯著下降。主要是這兩種細(xì)菌對(duì)溫度敏感，熱處理時(shí)表面成分會(huì)發(fā)生變化，從而影響其黏附性。用鈣離子處理后的乳酸菌，其黏附能力顯著提高，可能是因?yàn)榛罨蒜}離子介導(dǎo)的信號(hào)通路，從而促進(jìn)細(xì)菌與細(xì)胞表面受體間的特異性結(jié)合。通少量的直流電可以抑制細(xì)菌黏附，在直流電作用下，帶負(fù)電的細(xì)菌被推離陰極，沿著陽(yáng)極表面運(yùn)動(dòng)，一部分細(xì)菌黏附在陽(yáng)極表面發(fā)生電子轉(zhuǎn)移而死亡，沉積黏附的細(xì)菌數(shù)量會(huì)明顯減少。

3 細(xì)菌黏附的研究模型

細(xì)菌黏附的研究模型主要包括靜態(tài)模型和動(dòng)態(tài)模型。靜態(tài)模型主要是利用待測(cè)物與細(xì)菌進(jìn)行靜態(tài)共培養(yǎng)，然后測(cè)定并評(píng)價(jià)細(xì)菌黏附力。任婷婷等人將裸玻璃和各種帶涂層的玻璃加入含大腸桿菌懸液的24孔板中，在37℃下溫育，經(jīng)過(guò)洗滌、固定、脫水、干燥處理，通過(guò)SEM拍攝電鏡照片計(jì)算黏附的大腸桿菌的數(shù)量，反映細(xì)菌在不同涂層的黏附力[12]。同時(shí)，馬駿等人將光滑面、粗糙面的鈷鉻鉬合金和鈦合金四種試樣分別放入不同類(lèi)型的培養(yǎng)板中，分別吸取異硫氰酸酯(Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC) 標(biāo)記的表皮葡萄球菌和結(jié)核桿菌菌液滴入培養(yǎng)板內(nèi)，在恒溫箱中孵育，經(jīng)過(guò)洗滌，通過(guò)熒光顯微鏡觀察，對(duì)熒光面積進(jìn)行計(jì)算，研究了細(xì)菌在不同試樣上的黏附情況，展示了細(xì)菌對(duì)人工關(guān)節(jié)假體的影響。另外，Nogueira等人將牙釉質(zhì)樣品分別放入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用變形鏈球菌接種，在37℃下孵育，經(jīng)過(guò)洗滌、超聲處理，在平板表面上涂布，37℃下孵育后，使用立體鏡對(duì)菌落形成單位進(jìn)行計(jì)數(shù)，以此研究細(xì)菌在牙釉質(zhì)樣品的黏附力[13]。靜態(tài)模型雖然操作簡(jiǎn)便，但也存在不足：培養(yǎng)環(huán)境封閉，細(xì)菌在研究過(guò)程中所產(chǎn)生的一些代謝產(chǎn)物和毒力因子等會(huì)使封閉環(huán)境發(fā)生顯著變化；受培養(yǎng)上清中浮游菌的干擾，難以采用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察[14]。

動(dòng)態(tài)模型主要是模擬體內(nèi)真實(shí)環(huán)境，進(jìn)行細(xì)菌黏附力的研究。王若茜等人將人支氣管上皮樣細(xì)胞(Human bronchial epithelial cells，HBE)接種至流動(dòng)小室中，待其融合長(zhǎng)滿(mǎn)小室，將熒光染料標(biāo)記的鮑曼不動(dòng)桿菌加入流動(dòng)小室，接入流動(dòng)系統(tǒng)，放置于熒光顯微鏡下觀察細(xì)菌在細(xì)胞上的黏附情況，以此研究細(xì)菌在呼吸道上皮細(xì)胞的黏附[14]。同樣，Paladin等人用銀對(duì)聚氨酯導(dǎo)管進(jìn)行了處理，通入接種金黃色葡萄球菌的M9基本培養(yǎng)基，制成了復(fù)制人體的生理狀況的洗滌系統(tǒng)，使用綠色熒光核酸染料對(duì)導(dǎo)管進(jìn)行染色，通過(guò)熒光顯微鏡研究了細(xì)菌在導(dǎo)管上的黏附[15]。動(dòng)態(tài)模型雖然操作復(fù)雜，但動(dòng)態(tài)模型更能夠模擬細(xì)菌黏附的生理生化微環(huán)境和力學(xué)環(huán)境，更加貼近體內(nèi)真實(shí)的動(dòng)態(tài)環(huán)境，并且可實(shí)時(shí)觀察細(xì)菌在黏附材料上的黏附情況[14]。

綜上所述，細(xì)菌黏附對(duì)生產(chǎn)生活的諸多環(huán)節(jié)有著重要的影響，受到越來(lái)越多的關(guān)注，已成為研究的熱點(diǎn)。從細(xì)菌本身和材料兩個(gè)方面開(kāi)展的諸多研究，使我們更加了解細(xì)菌的黏附機(jī)制，從而能夠根據(jù)應(yīng)用需要來(lái)抑制(如介入醫(yī)療器械)或促進(jìn)細(xì)菌的黏附(如污水處理廠)。開(kāi)發(fā)新的、環(huán)保綠色的抗細(xì)菌黏附或促進(jìn)黏附的材料與制劑，是今后的主要研究方向。