采后柑橘褐斑病的研究進(jìn)展

龔意輝，彭淑君，李 鵬，曹 鞏，雷梓天，陳思宇，曾永賢*

(1.湖南人文科技學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，湖南 婁底 417000；2.湖南省湘潭市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，湖南 湘潭 411134)

柑橘(CitrusreticulataBlanco)是我國南方最重要的特色水果，含有豐富的類胡蘿卜素、類黃酮、維生素C等營養(yǎng)物質(zhì)，具有較高營養(yǎng)價(jià)值和商業(yè)價(jià)值。但果實(shí)采收后在長期低溫貯藏中易發(fā)生果皮褐斑病，發(fā)病率在20 %～50 %之間，嚴(yán)重時(shí)可高達(dá)90%。柑橘果實(shí)在經(jīng)過采后商品化處理后更易發(fā)生褐斑病。其發(fā)病特征通常是在果皮的油胞層或果蒂周圍出現(xiàn)淡褐色、紅褐色或深褐色的革質(zhì)狀病斑，與周圍界限分明。褐斑病的發(fā)生嚴(yán)重降低了柑橘果實(shí)的外觀品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。國內(nèi)外學(xué)者對(duì)采后果實(shí)褐變的發(fā)生機(jī)理進(jìn)行全面深入的研究，主要集中在荔枝、龍眼、蘋果、梨等水果上，而學(xué)者主要從錦橙和甜橙褐斑病的個(gè)別生理生化特征進(jìn)行研究，對(duì)柑橘褐斑病的發(fā)生機(jī)制缺乏系統(tǒng)研究。近年來，柑橘褐斑病的生理生化特性及其與果實(shí)耐貯性的關(guān)系出現(xiàn)了少量的報(bào)道，褐斑病的發(fā)生嚴(yán)重影響了果實(shí)的保鮮和貨架期。本文主要從褐斑病癥狀、病原體、發(fā)生機(jī)制及防治措施等方面進(jìn)行了全面的綜述，為研究柑橘果實(shí)的保鮮和耐藏性奠定了良好的基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)降低果實(shí)褐斑病的發(fā)生和提高果實(shí)的商業(yè)價(jià)值具有非常重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。

1 柑橘果實(shí)褐斑病病原體

1.1 褐斑病癥狀

柑橘果實(shí)發(fā)生褐斑病后，果皮表現(xiàn)出皺縮、干癟的癥狀，并形成形狀不規(guī)則的深棕色區(qū)域。果皮受傷組織則發(fā)生病斑傷害，表現(xiàn)為外果皮下的大量細(xì)胞出現(xiàn)結(jié)構(gòu)改變，并且油胞空腔變大，形狀改變?yōu)楸鈭A形或狹長型的細(xì)胞，發(fā)生一定程度的下陷，同時(shí)數(shù)量增多。油胞周圍細(xì)胞逐漸萎縮、降解，并且在柑橘果皮表面形成褐斑病癥狀。表現(xiàn)出多種類型的病斑，主要癥狀表現(xiàn)為果皮油胞層或果蒂周圍出現(xiàn)淡褐色、紅褐色或深褐色的革質(zhì)狀病斑。發(fā)生病害部位的油胞破裂，最終導(dǎo)致油胞死亡。根據(jù)褐斑病表現(xiàn)出的外觀形態(tài)特征則分為網(wǎng)狀褐斑、片狀褐斑、蒂緣褐斑、木栓狀褐斑、點(diǎn)狀褐斑、塊狀褐斑[1]。對(duì)上述7類褐斑病原體進(jìn)行培養(yǎng)和病原菌分離鑒定，其中在點(diǎn)狀、片狀和網(wǎng)狀褐斑類型中并沒有成功分離出病菌，則認(rèn)為這3種褐斑屬于生理型病斑，但有時(shí)在木栓狀、塊狀和蒂緣凹陷能分離出病原體，機(jī)械傷害造成的塊狀褐斑并沒有病菌，蒂緣擴(kuò)散不清[2]。

1.2 病原體

大量研究表明，引起柑橘褐斑病的病原體為鏈格孢菌(Alternariaalternata)，屬半知菌門，絲孢綱，絲孢目，暗色菌科，鏈格孢屬(AlternariaNees)[3]。該病原菌在PDA培養(yǎng)基上生長時(shí)，菌落顏色表現(xiàn)為橄欖綠色。其產(chǎn)孢方式是內(nèi)壁芽生孔生式，產(chǎn)孢梗生長方式為合軸式。分生孢子為淡褐色至褐色，生殖方式是單生或短鏈生，成倒棍棒形，梨形或近橢圓形，具縱隔膜3～7個(gè)，大小為(6.92～13.9) μm ×(24.1～44.8)μm，平均10.9 μm×31.6 μm。初生分生孢子體積較小，成卵形，隔膜較少(0～4個(gè))，顏色是淺褐色，無喙；成熟的分生孢子顏色加深，在頂端出現(xiàn)明顯的假喙，喙是柱狀。分生孢子梗單生或簇生，直立型，有隔膜，但不分枝；其色澤也較菌絲深，在基部成深褐色，而在頂部逐漸呈淡褐色[4]。

在梅秀鳳[5]等對(duì)柑橘病害病原體研究中，通過對(duì)柑橘褐斑病原體在PCA培養(yǎng)基條件下的形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)褐斑病病原體能產(chǎn)生較小型的卵圓形分生孢子和較大型的倒棍棒狀分生孢子。棒狀分生孢子均具有橫隔膜，縱隔膜有或無，數(shù)量不等。卵圓形孢子形態(tài)結(jié)構(gòu)相對(duì)較小，縱橫隔膜有或無，隔膜數(shù)0～2個(gè)不等。其孢子梗均較粗，且有隔膜。同時(shí)該菌株可產(chǎn)生的孢子鏈，孢子鏈長度不確定且無規(guī)則，孢子鏈分支不規(guī)則且不均等。

胡中會(huì)[6]等人對(duì)褐斑病病原體菌絲生長及孢子繁殖的條件，進(jìn)行了一系列研究，結(jié)果表明褐斑病病原菌的生物學(xué)特性為，褐斑病菌絲的生長和孢子的萌發(fā)在以甘露醇為碳源培養(yǎng)基上是最為有利；在蔗糖作為碳源，菌絲生長較差；孢子在以麥芽糖為碳源培養(yǎng)基上的萌發(fā)是最差的。pH值和溫度對(duì)褐斑病孢子萌發(fā)有較大的影響，研究結(jié)果表明，褐斑病菌絲和孢子在pH值為5～8，溫度21℃時(shí)最適合生長和萌發(fā)。

2 褐斑病的發(fā)生機(jī)制及影響因素

2.1 致病機(jī)理

當(dāng)今，國際上的研究學(xué)者根據(jù)果實(shí)侵染寄主和產(chǎn)生的寄主?；圆煌?，將褐斑病病原菌定義為粗檸檬致病型(A.alternatepathotype rough lemon) 和橘致病型(A.alternatepathotype tangerine)2種類型。橘致病型和粗檸檬致病型分別產(chǎn)生寄主?；远舅貫锳CT[7]和ACRL[8]。這些毒素只對(duì)特定基因型柑橘品種有毒性，感病品種一旦發(fā)病，常不可控制，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。通過對(duì)褐斑病病原菌的基因鑒定中發(fā)現(xiàn)，能控制橘致病型毒素的合成基因是位于1.2～1.9Mb的線粒體染色體上的ACTTI和ACTT2。ACTTI和ACTT2參與ACT-,AK-和AF-毒素共有結(jié)構(gòu)的調(diào)控[9]。ACT作用于敏感宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)膜，ACT含量升高則導(dǎo)致細(xì)胞電解質(zhì)滲漏和細(xì)胞凹陷，從而最終引起細(xì)胞死亡。ACT-Ib為ACT主要構(gòu)成成分，含量極高，對(duì)柑橘和梨均有毒性。鏈格孢菌橘致病型能更快的保證病菌快速侵入和定殖，是因?yàn)槠浯嬖谝惶子赊D(zhuǎn)錄因子YAPI、SKN7，及MAPK激酶HOG1介導(dǎo)的ROS高效清除系統(tǒng)，能快速降解寄主爆發(fā)的ROS。當(dāng)在特定因子的作用下，該病菌通過產(chǎn)生NADPH (Nicotinamideadeninedinucleotidephosphate，還原型輔酶Ⅱ)和氧化酶復(fù)合體(Nox)合成ROS，其中H2O2作為信號(hào)分子可激活YAP1、HOG1和SKN7介導(dǎo)的ROS解毒系統(tǒng)，從而啟動(dòng)一系列抗氧化反應(yīng)。Nox由NoxA、NoxB或NoxR 3個(gè)組分組成，當(dāng)其中任何1個(gè)或2個(gè)基因缺失，會(huì)抑制病原菌ROS含量的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致SKN7、HOG1和YAPI表達(dá)量呈下降的趨勢(shì)，病原菌對(duì)H2O2等過氧化物敏感程度加深而導(dǎo)致致病性嚴(yán)重削弱[10]。

2.2 影響褐斑病發(fā)病的因素

2.2.1 品種 不同的柑橘種類和品種褐斑病的發(fā)生率存在著較大的差異。據(jù)中國農(nóng)科院柑橘研究所研究表明，柑橘的種類、品種不同，褐斑病的發(fā)生情況差異很大。其中甜橙最容易發(fā)生褐斑病，柑、檸檬次之[11]。對(duì)于像甜橙類的哈姆林品種，其果皮細(xì)密且光滑，褐斑病的發(fā)病率明顯高于一般品種，尤其是在采后貯藏期間的發(fā)病率超過90%。反之，柑橘果皮疏松粗糙的品種在貯藏期間褐斑病發(fā)生幾率較低，例如夏橙只有15%～30%的褐斑發(fā)病率。果皮蠟質(zhì)厚的柑橘品種則不易發(fā)生褐斑病[12]。因此，選擇抗性較強(qiáng)的柑橘品種也是防治褐斑病發(fā)生的重要措施。

2.2.2 貯藏溫度 一般來說，柑橘果實(shí)貯藏溫度越低就越容易導(dǎo)致冷害的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)柑橘品種貯藏溫度持續(xù)低于該品種冷害溫度的14d以上，就會(huì)導(dǎo)致柑橘果皮表面出現(xiàn)褐斑大小不同的病癥[13]。柑橘果實(shí)處于4～6℃或7～9℃時(shí)，則發(fā)生較高的褐斑病，其中錦橙置于2～5℃環(huán)境中貯藏4個(gè)月，果皮褐斑病發(fā)病率高于50%[14]，由此可見，柑橘果實(shí)長期置于低溫環(huán)境中易發(fā)生褐斑病。

2.2.3 貯藏相對(duì)濕度 采后果實(shí)貯藏庫中的相對(duì)濕度是影響褐斑病發(fā)生的重要因素，當(dāng)果實(shí)處于較低濕度的貯藏庫中則易發(fā)生果皮失水，引起果實(shí)褐斑病的出現(xiàn)。相反，當(dāng)果實(shí)處于95%以上的相對(duì)濕度能有效防治褐斑病的發(fā)生。例如，溫州蜜柑在低濕度貯藏6個(gè)月下，褐斑病發(fā)病率為96.7%，而在高濕度下的發(fā)病率僅為8.3%[14]。可見，果實(shí)貯藏庫中的相對(duì)濕度與褐斑病的發(fā)生存在密切的關(guān)系。

2.2.4 貯藏期間的氣體比例 氣調(diào)貯藏是通過調(diào)節(jié)果實(shí)貯藏環(huán)境中的O2和CO2濃度，以保證果實(shí)品質(zhì)和延長貨架期。當(dāng)果實(shí)置于低濃度O2和高濃度CO2貯藏庫中，易導(dǎo)致果實(shí)褐斑病的發(fā)生。大量研究表明，貯藏的CO2濃度以1%～4%，O2濃度為17%～19%為最佳貯藏氣體條件[15]。但對(duì)于不同柑橘品種，在不同溫度，濕度的條件，貯藏的時(shí)間下，褐斑病的發(fā)生則會(huì)有一些差異。因此，合理控制果實(shí)貯藏環(huán)境中O2和CO2的相對(duì)比例能有效抑制褐斑病的發(fā)生。

3 防治措施

3.1 物理防治

3.1.1 選擇優(yōu)良品種 經(jīng)過10余年的品種選育研究，我國選育了許多優(yōu)良柑橘抗褐斑病品種，例如：廣東省選育的紅江橙、新會(huì)橙、暗柳橙以及四川培育的錦橙、先鋒橙均具有較強(qiáng)的抗褐斑病能力[16]；而從國外引進(jìn)的血橙、臍橙、哈姆林甜橙和伏令夏橙品種則不易發(fā)生褐斑病。福建、四川選育的紅橘和江西培育的南豐蜜橘、本地早等品種，此外，還有國內(nèi)市場(chǎng)比較少見的檸檬類等?？梢?，培育優(yōu)良的抗性品種是有效控制褐斑病發(fā)生的重要手段。

3.1.2 控制貯藏溫度 溫度是影響柑橘果實(shí)代謝旺盛水平、果皮失水、病原菌繁殖的重要因素。柑橘是典型的非躍變型果實(shí)且對(duì)低溫較為敏感，若長期將柑橘果實(shí)置于低溫環(huán)境中則易發(fā)生冷害，引起果皮褐斑病的發(fā)生。不同的柑橘品種貯藏的最適溫度存在較大的差別，例如柑類果實(shí)最適貯藏溫度為3～5℃；橘類貯藏溫度為3～12℃左右[17]。因此，合理控制柑橘果實(shí)的貯藏溫度是減少褐斑病發(fā)生的重要手段。

3.1.3 提高貯藏環(huán)境濕度 在采后果實(shí)貯藏過程中合理控制貯藏環(huán)境濕度是減少褐斑病發(fā)生的重要手段。柑橘果實(shí)置于環(huán)境濕度過低的情況下易使果皮失水萎蔫，嚴(yán)重降低果實(shí)的外觀品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。若柑橘貯藏濕度過高則引起微生物繁殖速度過快，易發(fā)生褐斑病。不同柑橘品種貯藏環(huán)境濕度存在較大的差異。甜橙類對(duì)環(huán)境濕度的要求相對(duì)高一些，90%～95%左右。一般果實(shí)貯藏溫度較低時(shí)，則適當(dāng)提高貯藏環(huán)境中的相對(duì)濕度，反之，則適當(dāng)降低。

3.1.4 控制貯藏氣體比例 柑橘果實(shí)對(duì)CO2的濃度較敏感，高于3%便會(huì)造成氣體傷害。在采后柑橘褐斑病的研究中，發(fā)現(xiàn)在CO2濃度不超過2%～4%，O2不低于17%～19%范圍內(nèi)，褐斑病的發(fā)病率低[18]。故在貯藏期間需要常通風(fēng)換氣，如在一定條件，可采用冷風(fēng)機(jī)進(jìn)行通風(fēng)透氣，降低果實(shí)貯藏過程中CO2的濃度，在一定程度上減少柑橘褐斑病的發(fā)病率。

3.2 化學(xué)防治

3.2.1 采后及時(shí)用2,4-D浸果 2，4-D為植物生長調(diào)節(jié)劑，該外源生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用，改變了果實(shí)內(nèi)源激素的平衡，進(jìn)而影響果實(shí)的生理代謝。2，4-D處理柑橘能保持果蒂的青綠和抑制柑橘果實(shí)的衰老進(jìn)程，提高柑橘果實(shí)抗褐斑病的能力[1]。采用該試劑處理果實(shí)則誘導(dǎo)柑橘褐斑病的抵抗能力提高，并且藥物處理越及時(shí)效果越顯著。

3.2.2 果實(shí)采后浸硫法 利用一定濃度的亞硫酸或亞硫酸鹽浸泡果實(shí)，其原理為亞硫酸鹽中釋放出來的二氧化硫?qū)哳愡M(jìn)行保鮮處理。當(dāng)果實(shí)處于新鮮狀態(tài)下時(shí)，果實(shí)pH值降低，PPO酶活性被抑制，故褐斑病生理性所導(dǎo)致的褐斑減少。目前，對(duì)于荔枝保鮮常用此方法，好果率為97%以上。

3.2.3 果實(shí)采后鈣處理 果膠酸鈣處理能提高采后果實(shí)細(xì)胞壁的機(jī)械強(qiáng)度和細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，并且能夠提高采后果實(shí)中鈣含量，采后果實(shí)糖酸比和果膠酸與對(duì)照相比有所提高，果實(shí)細(xì)胞膜的通透性較處理前有所降低，最終延長果實(shí)的耐藏性和貨架期。龔新明[19]等研究發(fā)現(xiàn)，在黃冠梨褐斑病的防治過程中，CaCl2的浸泡下，可減少褐斑病的發(fā)生幾率。在低溫、低濕或高CO2的條件下，可短暫抵抗逆環(huán)境，降低褐斑病的發(fā)生率。

4 結(jié)論與展望

我國柑橘種類眾多，但褐斑病的發(fā)生嚴(yán)重影響了柑橘的耐貯性和品質(zhì)。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)柑橘果實(shí)褐斑病的病原體形態(tài)結(jié)構(gòu)、發(fā)生規(guī)律、防治措施等方面進(jìn)行了大量的研究，但對(duì)于采后柑橘褐斑病的分子致病機(jī)制尚未明確闡明。從果實(shí)耐貯和采后商品化處理與保鮮的角度，筆者認(rèn)為應(yīng)加強(qiáng)以下3個(gè)方面的研究。

4.1 加強(qiáng)柑橘果實(shí)生理生化特性、果皮形態(tài)結(jié)構(gòu)與褐斑病相關(guān)性的研究，為培育耐藏性柑橘新品種打下良好基礎(chǔ)

國內(nèi)外對(duì)柑橘果實(shí)褐斑病的形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了相關(guān)研究，油胞崩潰和周圍細(xì)胞變形與果實(shí)褐斑病的發(fā)生存在密切的關(guān)系。對(duì)于褐斑病柑橘果實(shí)微觀結(jié)構(gòu)的觀察缺乏系統(tǒng)的探究，在柑橘果實(shí)的采后處理與耐貯性研究中，可以從改善柑橘果皮形態(tài)結(jié)構(gòu)的角度著手，從而培育出抗褐斑病強(qiáng)和耐藏性強(qiáng)的新品種。

4.2 加強(qiáng)對(duì)柑橘果實(shí)褐斑病發(fā)病規(guī)律和影響因素的研究，為及時(shí)發(fā)現(xiàn)病害和控制病害提供理論參考依據(jù)

對(duì)影響果實(shí)貯藏過程中褐斑病發(fā)生因子如溫度、濕度、氣體比例等方面進(jìn)行全面深入的研究，有利于改善果實(shí)采后商品化處理技術(shù)，減少褐斑病發(fā)生幾率，以達(dá)到提高柑橘果實(shí)貯藏性和品質(zhì)，以期獲得更高的商業(yè)價(jià)值。

4.3 加強(qiáng)對(duì)柑橘果實(shí)褐斑病發(fā)生的分子機(jī)制進(jìn)行深入研究

隨著現(xiàn)代分子技術(shù)手段的發(fā)展和褐斑病發(fā)生相關(guān)基因克隆的不斷深入，運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)和瞬時(shí)表達(dá)對(duì)調(diào)控褐斑病發(fā)生的關(guān)鍵基因進(jìn)行功能研究，或利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)柑橘褐斑病的發(fā)生機(jī)制進(jìn)行深入研究，試圖探明影響褐斑病發(fā)生的關(guān)鍵蛋白，加強(qiáng)這些方面的研究可進(jìn)一步完善柑橘果實(shí)褐斑病的發(fā)生機(jī)制。