賈圓圓

(平潭綜合實(shí)驗(yàn)區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村發(fā)展服務(wù)中心，福建 福州 350400)

牡蠣又稱(chēng)生蠔、海蠣子，隸屬軟體動(dòng)物門(mén)(Mollusca)、雙殼綱(Bivalvia)、珍珠目(Pterioida)、牡蠣科(Ostreidae)，其肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富、富含鋅、牛磺酸、糖原等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1]，是一種高蛋白、低脂肪的健康海洋貝類(lèi)[2]，享有“海中牛奶”之美稱(chēng)。研究發(fā)現(xiàn)，牡蠣對(duì)化學(xué)性肝損傷具有一定程度的輔助保護(hù)作用[3]。牡蠣具有生長(zhǎng)快速、產(chǎn)量高、食物鏈短、經(jīng)濟(jì)效益良好等優(yōu)點(diǎn)[4]。世界上主要的牡蠣養(yǎng)殖國(guó)有中國(guó)、日本、韓國(guó)、美國(guó)、法國(guó)等，其中中國(guó)牡蠣養(yǎng)殖年產(chǎn)量約占世界牡蠣年產(chǎn)量的80%[5]。2020年《中國(guó)漁業(yè)年鑒》統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)的牡蠣養(yǎng)殖區(qū)主要集中在山東、福建、廣東、廣西等省份，養(yǎng)殖產(chǎn)量約占全國(guó)總產(chǎn)量的90%。2019年，中國(guó)牡蠣的養(yǎng)殖面積為14.51×104hm2，養(yǎng)殖產(chǎn)量高達(dá)522.6×104t，占貝類(lèi)海水養(yǎng)殖產(chǎn)量的三分之一還多，占海水養(yǎng)殖總產(chǎn)量的25%左右[6]。牡蠣已成為我國(guó)乃至世界重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖貝類(lèi)。

多倍體是指體內(nèi)含有三套或三套以上染色體組的生物個(gè)體，在水產(chǎn)貝類(lèi)中，與普通二倍體相比，多倍體子代具有個(gè)體大、生長(zhǎng)快等優(yōu)勢(shì)。通常將體內(nèi)含有三套染色體組的生物個(gè)體稱(chēng)為三倍體，一般認(rèn)為三倍體的個(gè)體生物具有不育性。在水產(chǎn)生物育種生產(chǎn)過(guò)程中，通過(guò)人工干預(yù)的形式使生物體中的染色體組增加的技術(shù)稱(chēng)為多倍體育種技術(shù)，該方法已成為獲得水產(chǎn)生物新品種的一個(gè)重要途徑。以改良水產(chǎn)生物種質(zhì)資源、改善能量收支平衡、提高水產(chǎn)品質(zhì)量與產(chǎn)量的水產(chǎn)生物多倍體研究，近年來(lái)一直受到業(yè)界的關(guān)注[7]。

絕大多數(shù)牡蠣為雌雄異體，但也存在雌雄同體現(xiàn)象，外觀上難以區(qū)分，需開(kāi)殼后通過(guò)水滴法或鏡檢法進(jìn)行鑒定。學(xué)者們通過(guò)研究長(zhǎng)牡蠣、近江牡蠣等多種牡蠣染色體核型，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)牡蠣具有兩套染色體組(2n=20)即二倍體。二倍體牡蠣在產(chǎn)生配子的過(guò)程中，性腺的發(fā)育需要消耗體內(nèi)儲(chǔ)存的糖原為其提供能量，精卵的排放導(dǎo)致牡蠣軟體部極度消瘦，嚴(yán)重影響了牡蠣的口感和出肉率。多倍體育種技術(shù)培育的三倍體牡蠣，通過(guò)改變育性使其避免了二倍體牡蠣繁殖期間品質(zhì)下降的問(wèn)題，且三倍體牡蠣保持了多倍體生物個(gè)體大、生長(zhǎng)快的優(yōu)點(diǎn)。本文綜述了近年來(lái)中國(guó)牡蠣的主要養(yǎng)殖品種及三倍體育種的產(chǎn)生機(jī)理和誘導(dǎo)方法，為牡蠣及其他貝類(lèi)的多倍體研究提供參考。

1 主要養(yǎng)殖品種及育種技術(shù)

1.1 主要養(yǎng)殖品種概況

中國(guó)的牡蠣物種資源至少擁有30種[8]，在我國(guó)海域內(nèi)，主要的經(jīng)濟(jì)牡蠣均屬于巨蠣屬，而巨蠣屬在中國(guó)海域定名的種或亞種有12個(gè)[9]。也有學(xué)者[10]認(rèn)為巨蠣屬、牡蠣科的分類(lèi)尚存爭(zhēng)議。我國(guó)牡蠣主要的養(yǎng)殖品種為長(zhǎng)牡蠣(又稱(chēng)太平洋牡蠣，Crassostreagigas)、福建牡蠣(又稱(chēng)葡萄牙牡蠣，C.angulata)、香港牡蠣(C.hongkongensis)、近江牡蠣(C.ariakensis)、熊本牡蠣(C.sikamea)等[11]。

長(zhǎng)牡蠣，左殼凹陷，右殼隆起，鱗片排列緊密，殼形呈圓形或長(zhǎng)三角形，個(gè)體較大，原生長(zhǎng)于西太平洋北部海域，是一種生長(zhǎng)快、抗逆性強(qiáng)、肉質(zhì)肥美的經(jīng)濟(jì)貝類(lèi)，喜高鹽低溫環(huán)境，適合養(yǎng)殖于中高緯度的海域[12]。長(zhǎng)牡蠣原產(chǎn)于日本、澳大利亞等國(guó)，1982年中國(guó)從日本引進(jìn)該物種。北美、歐洲等地陸續(xù)引進(jìn)后，長(zhǎng)牡蠣逐漸成為世界上養(yǎng)殖量較大的海水貝類(lèi)養(yǎng)殖品種。在所有的牡蠣品種中，對(duì)長(zhǎng)牡蠣的研究最為廣泛，其中在牡蠣多倍體育種研究中，已獲得長(zhǎng)牡蠣四倍體群體及全三倍體。在中國(guó)，長(zhǎng)牡蠣主要分布于長(zhǎng)江口以北的黃渤海水域[13]，主要養(yǎng)殖區(qū)分布在山東、遼寧、江蘇等地，2019年養(yǎng)殖面積6.05×104hm2、養(yǎng)殖產(chǎn)量118.55×104t。

福建牡蠣，左殼稍微凹陷，右殼隆起，殼外側(cè)放射性鱗褶分布明顯，殼呈黃色伴有褐色條紋，殼內(nèi)肌痕為深褐色[14]，個(gè)體略小于長(zhǎng)牡蠣，是華南地區(qū)重要的養(yǎng)殖貝類(lèi)[15]，主要分布于長(zhǎng)江口以南海域，福建海域分布較多。其曾經(jīng)一度被認(rèn)為是長(zhǎng)牡蠣[16]，王海艷等[17]通過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)牡蠣和福建牡蠣屬于同一物種不同亞種的關(guān)系。福建牡蠣主要養(yǎng)殖區(qū)分布在福建、臺(tái)灣等地，是福建最主要的養(yǎng)殖品種[18]，2019年養(yǎng)殖面積3.69×104hm2、養(yǎng)殖產(chǎn)量201.26×104t。

香港牡蠣，殼圓形或橢圓形，左殼較小，殼覆鱗片，殼色青、白或褐色，肉質(zhì)發(fā)白。其主要分布在福建以南的華南沿海，而在廣東、廣西等地分布較多，其市場(chǎng)價(jià)格略高于其他牡蠣品種，已成為華南地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)貝類(lèi)[19]，2019年養(yǎng)殖面積4.34×104hm2、養(yǎng)殖產(chǎn)量179.84×106t。研究發(fā)現(xiàn)，香港牡蠣養(yǎng)殖于我國(guó)北方海區(qū)后，冬季出現(xiàn)大規(guī)模死亡現(xiàn)象，不適于北方推廣養(yǎng)殖。香港牡蠣屬高溫低鹽種，在熱帶或亞熱帶的河口常與近江牡蠣共存。近年來(lái)，由于淡水入海量的逐步減少，沿海養(yǎng)殖區(qū)的鹽度略有升高，加上養(yǎng)殖環(huán)境的不斷惡化，以致其死亡率升高。

近江牡蠣，外殼鱗片隨年齡而變化，殼內(nèi)白色，邊緣紫色，肌痕大且位置隨殼形而變化，其長(zhǎng)勢(shì)迅速、抗逆性強(qiáng)，屬?gòu)V溫廣鹽種，在世界各地均有分布，我國(guó)南北方也均有分布。過(guò)去，因肉色不同將近江牡蠣分為“赤蠔”和“白蠔”，王海艷等[17，20-21]利用基因測(cè)序和生物比對(duì)的方法對(duì)其進(jìn)行分子系統(tǒng)學(xué)分析，結(jié)果表明“白蠔”與香港牡蠣的基因序列相近，訂名為香港牡蠣[16]；“赤蠔”訂名為“近江牡蠣”，因其在日本有明海(Ariake)也有分布，但Wakiya Y[22]通過(guò)殼形特征比較將其命名為Crassostreaariakensis，因此近江牡蠣又稱(chēng)為有明巨牡蠣。

熊本牡蠣，為長(zhǎng)牡蠣的姐妹種，野生群體與長(zhǎng)牡蠣在形態(tài)上無(wú)明顯差別，相較于長(zhǎng)牡蠣，其個(gè)體較小；殼長(zhǎng)、殼高相差不大；外殼接近圓形；左殼凹陷較深；自殼頂放射的肋脊較明顯；殼色偏淺、較白。熊本牡蠣原產(chǎn)于日本，主要分布于日本有明海海區(qū)，中國(guó)的中部和南部海區(qū)、韓國(guó)沿海也有分布。在我國(guó)，熊本牡蠣生長(zhǎng)區(qū)域與福建牡蠣略微重疊，野生群體主要生長(zhǎng)于江蘇以南河口與海灣。王海艷等[23]利用分子標(biāo)記技術(shù)證明了野生型熊本牡蠣存在于我國(guó)海區(qū)。由于其個(gè)體較小，在日本的養(yǎng)殖業(yè)中未得到重視，20世紀(jì)50年代，在日本和美國(guó)進(jìn)行的長(zhǎng)牡蠣苗種貿(mào)易中，熊本牡蠣被認(rèn)為是長(zhǎng)牡蠣而引進(jìn)美國(guó)。在美國(guó)，熊本牡蠣的產(chǎn)卵時(shí)間晚于長(zhǎng)牡蠣和美洲牡蠣，填補(bǔ)了夏季牡蠣市場(chǎng)的空白，加上其蠔肉爽滑、口感甘甜，深受美國(guó)消費(fèi)者的喜愛(ài)，成為美國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)貝類(lèi)之一[24]。由于牡蠣外殼形狀易受環(huán)境因素影響，美國(guó)養(yǎng)殖的熊本牡蠣群體的外部形態(tài)不同于日本有明海海域的野生熊本牡蠣群體，美國(guó)的熊本牡蠣左殼凹陷較深，貝殼表面放射狀的背脊更加明顯。

1.2 育種技術(shù)研究

中國(guó)牡蠣養(yǎng)殖歷史悠久，多種因素使牡蠣在長(zhǎng)期養(yǎng)殖生產(chǎn)過(guò)程出現(xiàn)了個(gè)體變小、生長(zhǎng)速度緩慢、生長(zhǎng)周期變長(zhǎng)、品質(zhì)下降等現(xiàn)象[4]。學(xué)者們對(duì)此也進(jìn)行了大量的研究和改進(jìn)工作，一方面，通過(guò)建立牡蠣良(原)種場(chǎng)，加強(qiáng)其種質(zhì)資源的利用和保護(hù)，在采用傳統(tǒng)的選擇育種、雜交育種及基因育種等方法對(duì)牡蠣進(jìn)行遺傳改良而培育出牡蠣新品種(系)等方面均取得了重要的進(jìn)展，有效地推動(dòng)了我國(guó)牡蠣產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。如李琪等2014年培育出我國(guó)首個(gè)牡蠣新品種長(zhǎng)牡蠣“海大1號(hào)”，之后又相繼培育出“海大2號(hào)”和“海大3號(hào)”新品種；喻子牛等2015年培育出香港牡蠣“華南1號(hào)”新品種；曾志南等2017年培育出福建牡蠣“金蠣1號(hào)” 新品種；張國(guó)范等2020年培育出“海蠣1號(hào)”新品種[11]。另一方面，通過(guò)牡蠣多倍體育種技術(shù)推動(dòng)產(chǎn)業(yè)進(jìn)步。郭希明等在1995年發(fā)明了四倍體軟體動(dòng)物(牡蠣、扇貝、蛤、貽貝和鮑)生產(chǎn)方法以及通過(guò)四倍體與二倍體交配生產(chǎn)三倍體的方法[25]。張躍環(huán)等在2017年發(fā)明了一種香港牡蠣四倍體幼貝的制備方法，通過(guò)優(yōu)選三倍體卵子、精選二倍體精子、抑制受精卵第二極體、獲得四倍體幼蟲(chóng)、培育四倍體子代等技術(shù)環(huán)節(jié)，利用了部分三倍體卵子可以行使正常減數(shù)分裂的特性，創(chuàng)造了一種抑制受精卵(三倍卵子+二倍體精子)第二極體制備四倍體的育種方法[26]。李琪等在2017年發(fā)明了一種長(zhǎng)牡蠣“海大2號(hào)”新品種四倍體的誘導(dǎo)方法，為長(zhǎng)牡蠣“海大2號(hào)”新品種四倍體的擴(kuò)大養(yǎng)殖提供了育苗基礎(chǔ)[27]。于瑞海等在2019年發(fā)明了一種培育葡萄牙牡蠣四倍體的方法，為三倍體葡萄牙牡蠣規(guī)?；绱蛳铝嘶A(chǔ)[28]。

2 牡蠣三倍體的產(chǎn)生機(jī)理及培育方法

2.1 牡蠣三倍體的產(chǎn)生機(jī)理

減數(shù)分裂是有性生殖生物在形成配子過(guò)程中出現(xiàn)的細(xì)胞分裂方式，減數(shù)分裂過(guò)程染色體復(fù)制一次，細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)兩次的分裂，配子(精細(xì)胞和卵細(xì)胞)中的染色體組數(shù)為體細(xì)胞的一半，如普通野生二倍體牡蠣產(chǎn)生的精子或卵子中含有一個(gè)染色體組。正常減數(shù)分裂過(guò)程中，一個(gè)雄性生殖細(xì)胞經(jīng)過(guò)減數(shù)第一次分裂形成兩個(gè)次級(jí)精母細(xì)胞，細(xì)胞繼續(xù)分裂，經(jīng)過(guò)減數(shù)第二次分裂后，形成四個(gè)精細(xì)胞，最后發(fā)育為四個(gè)精子；一個(gè)雌性生殖細(xì)胞經(jīng)過(guò)減數(shù)第一次分裂形成一個(gè)次級(jí)卵母細(xì)胞和一個(gè)第一極體(一般不繼續(xù)分裂，退化)，一個(gè)次級(jí)卵母細(xì)胞經(jīng)過(guò)減數(shù)第二次分裂后形成一個(gè)卵細(xì)胞和第二極體(退化)，最終發(fā)育為一個(gè)卵子。

自然界野生牡蠣多為二倍體，正常體細(xì)胞含有兩個(gè)染色體組，牡蠣體內(nèi)的生殖細(xì)胞——精細(xì)胞經(jīng)過(guò)兩次減數(shù)分裂形成含有一個(gè)染色體組的精子。牡蠣排出的成熟卵子卻停留在減數(shù)第一次分裂的前期或中期，當(dāng)精卵結(jié)合形成受精卵后繼續(xù)完成減數(shù)第一次分裂和減數(shù)第二次分裂，排出第一極體和第二極體，這一特殊的減數(shù)分裂過(guò)程為多倍體的誘導(dǎo)創(chuàng)造了條件，通常通過(guò)抑制第一極體或第二極體的釋放使極體的染色體組留在受精卵內(nèi)，達(dá)到染色體組加倍的目的，繼續(xù)完成減數(shù)分裂后形成多倍體。

2.2 牡蠣三倍體的培育方法

三倍體牡蠣的培育途徑主要包括以下兩種：一是生物雜交法，即通過(guò)四倍體牡蠣與普通二倍體牡蠣雜交產(chǎn)生三倍體，理論上該方法產(chǎn)生的子代三倍體率達(dá)100%；另一種是通過(guò)化學(xué)方法或物理方法抑制受精卵減數(shù)分裂中第一極體或者第二極體的排出，使極體內(nèi)攜帶的染色體組留在受精卵內(nèi)，從而使染色體組數(shù)量增加，形成三倍體。通過(guò)后者形成三倍體中，常采用影響第二極體的形成從而獲得三倍體。李孝緒[29]研究發(fā)現(xiàn)，如若抑制減數(shù)第一次分裂第一極體的形成則易導(dǎo)致減數(shù)第二次分裂中染色體分離過(guò)程的復(fù)雜化，帶有的隨機(jī)性較大，可能得到四倍體、三倍體、二倍體甚至非整倍體，子代的三倍體率低且不穩(wěn)定。

2.2.1 生物雜交法

生物雜交是指不同生物群體中個(gè)體間的交配，雜交使親本的基因配合在一起，子代將親本的特性進(jìn)行結(jié)合，具有雜交優(yōu)勢(shì)。在理論上，通過(guò)牡蠣的四倍體與二倍體雜交產(chǎn)生子代三倍體率為100%，且四倍體牡蠣可通過(guò)自身繁育形成穩(wěn)定的群系從而穩(wěn)定獲得三倍體，因此成為三倍體牡蠣產(chǎn)業(yè)化養(yǎng)殖的有效途徑，該途徑操作簡(jiǎn)單，三倍體率高，避免了理化方法對(duì)胚胎發(fā)育的影響，提高了胚胎孵化率及幼蟲(chóng)成活率，但該途徑的工作難度在于如何獲得牡蠣四倍體。長(zhǎng)牡蠣通過(guò)生物雜交法成功誘導(dǎo)出三倍體并應(yīng)有于生產(chǎn)中。Guo X M等[30]將長(zhǎng)牡蠣的二倍體與四倍體進(jìn)行雜交產(chǎn)生全三倍體子代，闕華勇等[31]、王昭萍等[32]對(duì)子代三倍體幼蟲(chóng)各個(gè)發(fā)育時(shí)期的倍性進(jìn)行測(cè)定，表明其三倍體率為100%，除此之外，學(xué)者發(fā)現(xiàn)雜交產(chǎn)生的三倍體孵化、存活與對(duì)照組差異不明顯，進(jìn)一步從實(shí)驗(yàn)上證明理論的可行性和方法的可推行性。除此之外，張躍環(huán)等在2017年發(fā)明了一種香港牡蠣四倍體幼貝的制備方法，李琪等在2017年發(fā)明了一種長(zhǎng)牡蠣“海大2號(hào)”新品種四倍體的誘導(dǎo)方法，于瑞海等在2019年發(fā)明了一種培育葡萄牙牡蠣四倍體的方法。

2.2.2 物理方法

1)溫度休克法

溫度休克法是指通過(guò)劇烈地改變環(huán)境溫度來(lái)抑制受精卵分裂過(guò)程中微管的形成，使紡錘體無(wú)法拉動(dòng)染色體組向兩端移動(dòng)，從而形成多倍體細(xì)胞。溫度休克法具有操作簡(jiǎn)單、成本較低、無(wú)毒、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，該方法通常包括冷休克和熱休克兩種方法，因種類(lèi)不同其處理方法也略有差異。溫度休克法中溫度的選擇應(yīng)根據(jù)牡蠣原始生活海區(qū)的生活溫度確定，溫度不宜過(guò)高或過(guò)低，最適溫度一般為該種的亞致死溫度。于瑞海[33]對(duì)長(zhǎng)牡蠣受精20 min后采用4～5℃冷休克方法15 min得到三倍體的誘導(dǎo)效果最好，得到子代三倍體率為68%，幼貝三倍體率為60.5%，實(shí)驗(yàn)中通過(guò)解剖的方法人工授精，由于精卵發(fā)育的不同步性，降低了受精率和孵化率，該學(xué)者同時(shí)進(jìn)行了熱休克的實(shí)驗(yàn)研究，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)受精卵到2細(xì)胞和4細(xì)胞時(shí)停止發(fā)育。容壽柏等[34]對(duì)近江牡蠣卵子受精25 min后，采用35℃熱休克方法處理20 min，得到64%三倍體胚胎；采用10℃冷休克方法處理20 min得到69%三倍體胚胎，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度超過(guò)42℃，受精卵的死亡率急劇升高，該方法得出的結(jié)論解釋了于瑞海研究中的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。

2)靜水壓法

靜水壓法是通過(guò)液壓機(jī)等靜水壓設(shè)備施壓于牡蠣受精卵，影響分裂過(guò)程中紡錘體中微絲、微管的形成，抑制減數(shù)第二次分裂中第二極體的排出，誘導(dǎo)產(chǎn)生牡蠣三倍體。與溫度休克法相比，靜水壓法對(duì)胚胎的傷害作用較小，但操作過(guò)程需要專(zhuān)門(mén)的工作儀器即液壓機(jī)。Chaiton J A等[35]對(duì)太平洋牡蠣采用靜水壓法誘導(dǎo)產(chǎn)生子代三倍體率為57%，該方法得到的三倍體率不高。

3)電脈沖法

電脈沖休克是利用細(xì)胞融合的方法使染色體數(shù)目加倍，從而形成多倍體，1992年Cadoret J P等[36]對(duì)長(zhǎng)牡蠣采用600 V/cm電脈沖休克，得到子代三倍體率為55%，誘導(dǎo)產(chǎn)生20%四倍體幼蟲(chóng)，該方法獲得的三倍體率較前兩種方法效率更低。

4)滲透壓法

滲透壓法是新提出的獲得貝類(lèi)三倍體的誘導(dǎo)方法，主要通過(guò)降低或提高海水鹽度誘導(dǎo)三倍體的產(chǎn)生。目前，該方法的誘導(dǎo)原理尚未明確，有專(zhuān)家認(rèn)為，其原理可能是滲透壓引起受精卵能量代謝紊亂，影響紡錘體中微絲與微管的形成，從而影響極體的形成誘導(dǎo)產(chǎn)生多倍體[37]。該方法操作簡(jiǎn)易、成本較低、誘導(dǎo)率高，具有廣闊的應(yīng)用前景。于瑞海等[38]在40%～50%太平洋牡蠣受精卵出現(xiàn)第一極體時(shí)，采用鹽度8的低鹽誘導(dǎo)和鹽度60的高鹽誘導(dǎo)，得到子代的三倍體率為90%以上，該實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)率雖高，但誘導(dǎo)后受精卵的發(fā)育過(guò)程會(huì)受影響，實(shí)驗(yàn)中長(zhǎng)牡蠣D形幼蟲(chóng)孵化率明顯下降。王康[39]對(duì)太平洋牡蠣采用高鹽誘導(dǎo)方法進(jìn)行三倍體誘導(dǎo)探索，結(jié)果表明當(dāng)50%受精卵出現(xiàn)第一極體時(shí)，用鹽度65的高鹽海水處理長(zhǎng)牡蠣受精卵20 min后，得到幼蟲(chóng)的三倍體率最高為65.53%，作者認(rèn)為，較低的誘導(dǎo)率可能與精卵的質(zhì)量及精卵發(fā)育的同步性有關(guān)。

2.2.3 化學(xué)方法

1)細(xì)胞松弛素B法

細(xì)胞松弛素B(簡(jiǎn)稱(chēng)CB)是一種真菌代謝物，能夠特異性地作用于微絲，抑制收縮環(huán)的收縮功能，影響分裂溝的形成，阻止細(xì)胞繼續(xù)分裂，從而誘發(fā)多倍體的形成。CB對(duì)微絲的作用具有特異性和可逆性，當(dāng)CB去除后，細(xì)胞內(nèi)的微絲仍可以行使正常功能。CB價(jià)格昂貴，是一種毒性極強(qiáng)的致癌物，不易溶于水，可溶于0.1%二甲亞砜(DMSO)溶液，多倍體誘導(dǎo)結(jié)束后應(yīng)使用DMSO洗去CB殘留液。Stanley J G等[40]通過(guò)細(xì)胞松弛素B誘導(dǎo)產(chǎn)生美洲牡蠣三倍體，該方法作為牡蠣誘導(dǎo)三倍體的開(kāi)端，為后續(xù)學(xué)者的研究提供了理論依據(jù)。Downing S L等[41]對(duì)太平洋牡蠣采用CB誘導(dǎo)，得到子代三倍體率為88%左右；曾志南等[42]對(duì)僧帽牡蠣受精18 min后采用1.5 mg/L CB處理15 min，得到子代三倍體率達(dá)87.5%，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后牡蠣孵化率和面盤(pán)幼蟲(chóng)成活率都比對(duì)照組要低，這可能與CB的高毒性有關(guān)；于瑞海等[43]在太平洋牡蠣出現(xiàn)50%第一極體時(shí)，采用CB誘導(dǎo)15 min，得到子代三倍體率為91.5%，實(shí)驗(yàn)中對(duì)比了CB、6-DMAP、咖啡因三種方法的誘導(dǎo)結(jié)果，從價(jià)格、毒性、誘導(dǎo)率、附殼率多因素綜合考量，認(rèn)為咖啡因是一種相對(duì)容易推廣的誘導(dǎo)劑；林位瑯[44]分別對(duì)太平洋牡蠣、僧帽牡蠣受精卵采用CB誘導(dǎo)，子代三倍體率分別為68.9%、87.5%，得到的孵化率偏低，認(rèn)為應(yīng)從CB的處理時(shí)間、濃度、操作方法等方面做進(jìn)一步的研究。

2)6-二甲氨基嘌呤法

6-二甲氨基嘌呤(簡(jiǎn)稱(chēng)6-DMAP)是一種嘌呤類(lèi)似物，作為蛋白磷酸化抑制劑，作用于特定的激酶從而破壞微管導(dǎo)致微管的解聚集和紡錘體的解散，達(dá)到誘導(dǎo)多倍體的目的。與CB法誘導(dǎo)多倍體相比，6-DMAP的價(jià)格相對(duì)便宜，毒性低、無(wú)致癌風(fēng)險(xiǎn)、易溶于水且具有與CB相似的高誘導(dǎo)率，具有廣泛的應(yīng)用前景。Desrosiers R R等[45]對(duì)太平洋牡蠣采用6-DMAP誘導(dǎo)產(chǎn)生牡蠣三倍體，田傳遠(yuǎn)等[46-48]對(duì)太平洋牡蠣采用6-DMAP誘導(dǎo)作用于第一極體時(shí)，其子代三倍體率為71.3%左右；作用于第二極體時(shí)，其子代三倍體率為93.8%，采用6-DMAP誘導(dǎo)太平洋牡蠣過(guò)程中也出現(xiàn)少量四倍體個(gè)體，該學(xué)者的研究采用Allen 和 Bushek所提出的采用觀察極體出現(xiàn)率為指標(biāo)以確定處理時(shí)間的方法，不再根據(jù)精卵混合時(shí)間作為依據(jù)，通過(guò)觀察第一極體的數(shù)量把握誘導(dǎo)時(shí)機(jī)，為生產(chǎn)應(yīng)用提供了新思路。林琪等[49]對(duì)太平洋牡蠣受精卵采用6-DMAP處理20 min，得到子代三倍體率為81.26%，認(rèn)為受精卵的成熟度及密度是影響三倍體率的重要因素。于瑞海等[50]對(duì)太平洋牡蠣采用6-DMAP誘導(dǎo)，產(chǎn)生子代三倍體率為85.6%，其在精卵的選取和受精過(guò)程做了精心的準(zhǔn)備，從而降低了人工受精的影響。

3)咖啡因法

咖啡因?qū)ξ⒐艿淖饔镁哂刑禺愋?，可改變微管特別敏感的Ca2+濃度，當(dāng)Ca2+濃度高于10-3或極低時(shí)，微管二聚體將解聚無(wú)法組裝成微管結(jié)構(gòu)，染色體無(wú)法分離形成多倍體。Shpigel M等[51]研究發(fā)現(xiàn)溫度休克與咖啡因法結(jié)合使用可使誘導(dǎo)效果更佳，通過(guò)對(duì)太長(zhǎng)牡蠣采用5 mmol/L咖啡因+32℃組合誘導(dǎo)產(chǎn)生子代三倍體率達(dá)71%。王菊生[52]對(duì)太平洋牡蠣采用咖啡因+34℃組合誘導(dǎo)產(chǎn)生子代三倍體率為59.4%，于瑞海等[53]對(duì)太平洋牡蠣采用咖啡因+(33±1)℃組合誘導(dǎo)產(chǎn)生子代三倍體率最高達(dá)90.5%，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著咖啡因濃度的升高，三倍體誘導(dǎo)率升高，D形幼蟲(chóng)孵化率降低；認(rèn)為2 g/L咖啡因濃度最佳。

4)聚乙二醇法

聚乙二醇是一種細(xì)胞融合劑，通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞融合而產(chǎn)生多倍體。Guo X M等[54]對(duì)長(zhǎng)牡蠣采用聚乙二醇誘導(dǎo)產(chǎn)生了30%四倍體胚胎，為三倍體誘導(dǎo)做了新的嘗試、探索。

5)CB+紫外照射

紫外線照射能夠使精子染色體失去活性，Guo X M等[54-55]對(duì)太平洋牡蠣采用紫外線照射+CB聯(lián)合誘導(dǎo)產(chǎn)生牡蠣四倍體，其誘導(dǎo)率高達(dá)96%，紫外線的使用降低了CB的濃度從而降低了毒性所帶來(lái)的影響。

6)秋水仙素

秋水仙素是一種生物堿，對(duì)微管的組裝具有抑制作用，解聚已有的微管，從而抑制紡錘體的形成或者破壞形成的紡錘體[56]，達(dá)到染色體加倍的目的。該誘導(dǎo)劑被廣泛應(yīng)用于植物中，在泥蚶[57]、皺紋盤(pán)鮑[58]中已有相應(yīng)的研究數(shù)據(jù)。

此外，Nocodazole作為一種微管抑制劑，普遍應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)的同步化操作之中，Yang H P等[59]在貝類(lèi)中的硬殼蛤中誘導(dǎo)產(chǎn)生了四倍體。三氯甲烷[60]和聚乙烯二醇[61]等也具有一定的抑制細(xì)胞分裂的作用，但對(duì)貝類(lèi)三倍體的誘導(dǎo)效果不佳。

3 展望

我國(guó)已在牡蠣多倍體育種方面進(jìn)行了大量的研究，取得了一定的成果，但同時(shí)也存在一些問(wèn)題。在牡蠣多倍體的育種方法上，物理方法成本較低、操作相對(duì)簡(jiǎn)單但誘導(dǎo)效果不佳，化學(xué)方法誘導(dǎo)效果雖優(yōu)于物理方法，但其成本高，操作復(fù)雜，部分化學(xué)誘導(dǎo)劑具有毒性，對(duì)牡蠣及養(yǎng)殖環(huán)境都有一定的影響，這兩種育種方法在牡蠣養(yǎng)殖生產(chǎn)中難以普及推廣。一般認(rèn)為，通過(guò)四倍體與二倍體生物雜交的方法培育出三倍體是實(shí)現(xiàn)牡蠣產(chǎn)業(yè)化的根本途徑，該方法穩(wěn)定性好、無(wú)毒副作用，可產(chǎn)業(yè)化和規(guī)?；a(chǎn)。但生產(chǎn)實(shí)踐中，穩(wěn)定的四倍體群體較難獲得，通過(guò)三倍體牡蠣產(chǎn)生的較大卵子誘導(dǎo)四倍體是目前牡蠣四倍體育種中較為可行的方法。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和多倍體育種技術(shù)的應(yīng)用，牡蠣多倍體育種將會(huì)有廣闊的發(fā)展前景。為此建議，首先，應(yīng)加強(qiáng)牡蠣多倍體培育機(jī)理的相關(guān)研究，增加三倍體生長(zhǎng)、繁育、適應(yīng)性的研究，提高四倍體的遺傳穩(wěn)定性；其次，要加強(qiáng)異源多倍體的研究，將傳統(tǒng)雜交育種與多倍體育種相結(jié)合，使其子代綜合多倍體優(yōu)勢(shì)和雜交優(yōu)勢(shì)，擴(kuò)展多倍體誘導(dǎo)技術(shù)研究的領(lǐng)域，培育出滿足人們需求的新品種，為我國(guó)牡蠣養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展作出新的貢獻(xiàn)。