紅毛藻多糖的提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性

吳云輝，閻光宇，余 蕾，張怡評，楊 婷，晉文慧

(1.廈門海洋職業(yè)技術(shù)學(xué)院，海洋生物學(xué)院，福建 廈門 361100； 2.自然資源部第三海洋研究所，海洋生物資源開發(fā)利用工程技術(shù)創(chuàng)新中心，福建 廈門 361005； 3.福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 廈門 361005)

紅毛藻(Bangiafusco-purpurea)俗稱紅發(fā)菜、牛毛藻、牛毛海苔，屬紅藻門(Rhodophyta)、原紅藻綱(Florideophyceae)、紅毛菜目(Bangiales)、紅毛菜科(Bangiaceae)、紅毛菜屬(Bangiaatropurpurea)植物。紅毛藻主產(chǎn)于莆田湄洲、南日島一帶海域，顏色褐紅，細如毛發(fā)，含有豐富的鈣質(zhì)和各種維生素，年產(chǎn)量約為80～100 t(干重)。目前主要作為食品原料銷售，每噸紅毛藻的價格為(10～30)×104元，然而，關(guān)于紅毛藻精深加工產(chǎn)品尚未見到[1]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)紅毛藻中含有豐富的多糖類成分，這種成分具有降血壓、降血脂、防止動脈粥樣硬化等多種生物活性[1-2]。海藻多糖的提取及活性研究一直是藻類資源研究與開發(fā)的熱點，但由于紅毛藻價格較高，關(guān)于紅毛藻多糖的提取工藝及開發(fā)應(yīng)用的研究報道較少。本文對紅毛藻多糖提取工藝中的料液比、溫度、時間三個因素進行單因素實驗考察，并通過正交實驗優(yōu)選最佳提取工藝，試制樣品，而后對其體外抗氧化活性進行評價，以期為紅毛藻多糖的進一步開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干紅毛藻，購自福建莆田南日鎮(zhèn)。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，分析純，Sigma公司；葡萄糖、濃硫酸、苯酚、乙醇、水楊酸、雙氧水、七水硫酸亞鐵等試劑均為分析純，中國醫(yī)藥集團。

1.2 儀器

UH5300紫外-可見分光光度計，日本HITACHI公司；H1650-V離心機，湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司；SQP電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；QL-901漩渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；HH-ZK2恒溫水浴鍋，鞏義市予華儀器有限公司；DHG-9030A電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；DFT-200粉碎機，溫嶺市林大機械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多糖含量測定方法

精密稱量葡萄糖，用水配制成0.1 mg/mL標準溶液，分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL標準溶液置于20 mL具塞試管，加水至1.0 mL，配成 0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL系列葡萄糖標準溶液，再依次加入1.0 mL 5%苯酚水溶液(g/W)和5 mL濃硫酸，每個樣品加水補足至總體積10 mL，渦旋混勻后于30℃水浴反應(yīng)20 min，之后在 490 nm 測定吸光度[2]，以吸光度為縱坐標、葡萄糖濃度為橫坐標繪制標準曲線。

1.3.2 紅毛藻多糖提取

將干燥的紅毛藻用粉碎機粉碎，過篩(40目)。稱取紅毛藻粉末1.0 g，置于100 mL三角燒瓶中，按照料液比1∶40(W/V)加入40 mL蒸餾水后，于80℃水浴加熱提取2.0 h，紗布過濾，離心取上清液，量取濾液體積并測定吸光度以計算紅毛藻多糖提取量。

1.3.3 提取液中多糖含量的測定

取紅毛藻多糖提取液0.5 mL，按照1.3.1方法依次加入1.0 mL 5%苯酚水溶液(g/V)和5 mL濃硫酸，加水補足至10 mL，渦旋混勻，于30℃水浴反應(yīng)20 min后，在490 nm 測定吸光度[3]，代入葡萄糖標準曲線，求算提取液濃度，并計算提取液中紅毛藻多糖提取量。

多糖提取量(mg/g)=M1×V1/M2

(1)

式(1)中，M1：從標準曲線上計算出樣品溶液的含量(mg/mL)；M2：取樣量(g)；V1：樣品定容體積(mL)。

1.3.4 紅毛藻多糖提取單因素實驗

以料液比、提取溫度、提取時間作為考察因素，以紅毛藻多糖提取量為指標進行單因素實驗。

1)考察料液比對紅毛藻多糖提取量的影響

精密稱取1.0 g紅毛藻粉末12份，每個條件平行3份，按照料液比1∶30、1∶40、1∶50 和 1∶60(W/V)，分別依次加入 30、40、50、60 mL的蒸餾水，在80℃水浴條件下提取2.0 h，按照1.3.1方法每組平行測定3次。

2)考察提取時間對紅毛藻多糖提取量的影響

精密稱取 1.0 g紅毛藻粉末12份，每個條件平行3份，分別加入40 mL(料液比1∶40)蒸餾水，于80℃水浴條件下提取，再分別于0.5、1.0、1.5、2.0 h時停止提取，離心取上清液，按照1.3.1方法每組平行測定3次。

3)考察提取溫度對紅毛藻多糖提取量的影響

精密稱取 1.0 g 紅毛藻粉末12份，每個條件平行3份，分別加入 40 mL(料液比1∶40)蒸餾水，并分別于70、80、90、100℃下提取1.5 h，離心取上清液，按照1.3.1方法每組平行測定3次。

1.3.5 紅毛藻多糖提取工藝優(yōu)化

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以紅毛藻多糖提取量為考察指標，以提取溫度、提取時間、料液比為因子進行L9(34)正交實驗，以確定紅毛藻多糖的最佳提取工藝。

表1 正交實驗因素水平表

1.3.6 提取工藝驗證

為驗證建立的最佳提取工藝，本實驗進行3次平行實驗。稱取1.0 g紅毛藻3份，按照建立的最佳提取工藝進行提取，并按照1.3.1方法平行測定3次。

1.3.7 紅毛藻多糖的抗氧化活性實驗

1)紅毛藻多糖清除DPPH自由基的能力測定

分別用5支7 mL離心管移取0.04 mg/mL DPPH-乙醇溶液1.5 mL，再依次加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL紅毛藻多糖溶液(濃度為2 mg/mL)，并用水補足至3.0 mL，靜置30 min后在517 nm處測定溶液吸光度，計算紅毛藻多糖對DPPH自由基的清除率[4-5]。

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

(2)

式(2)中，A0為未加紅毛藻多糖溶液DPPH溶液的吸光度；A1為加紅毛藻多糖溶液后DPPH溶液的吸光度；A2為紅毛藻多糖溶液的吸光度。

2)紅毛藻多糖清除羥基自由基的能力測定

分別向5支離心管加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL紅毛藻多糖溶液(濃度為5 mg/mL)，用蒸餾水補足至1.0 mL，然后每支離心管分別加入0.3 mL 6 mmol/L FeSO4、1.5 mL 6 mmol/L水楊酸，搖勻，最后加入30% H2O2啟動反應(yīng)，靜置10 min后在510 nm處測定吸光度，計算紅毛藻多糖對羥基自由基的清除率[6-7]。

清除率(%)=(A0-A1+A2)/A0×100

(3)

式(3)中，A0為未加紅毛藻多糖溶液時羥基溶液的吸光度；A1為加紅毛藻多糖溶液后羥基溶液的吸光度；A2為紅毛藻多糖溶液的吸光度。

2 結(jié)果

2.1 多糖標準曲線測定

根據(jù)1.3.1方法得到回歸曲線方程，如圖1所示，Y=9.945 0X-0.010 1(Y為吸光值，X為葡萄糖濃度)，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 5。

2.2 紅毛藻多糖提取單因素實驗

2.2.1 料液比對紅毛藻多糖提取量的影響

在水浴溫度80℃、提取時間2.0 h的條件下，分別以料液比1∶30、1∶40、1∶50 和 1∶60(W/V)提取紅毛藻多糖，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，當(dāng)料液比從1∶30到1∶50，紅毛藻多糖的提取量呈上升趨勢，以1∶30到1∶40上升的趨勢較大，之后上升趨勢較慢，基本上趨于平衡狀態(tài)。這主要是因為隨著料液比的增加，溶解的多糖也增多，且在一定范圍內(nèi)增加提取液的體積可以增大溶劑與提取物的接觸面積，使水溶性的多糖能夠較多地溶出，于是產(chǎn)生了隨水量增加而多糖提取量升高的現(xiàn)象，但是當(dāng)料液比增加到可以溶解所有能被提取出的多糖時，繼續(xù)增加水量，所溶解的多糖也不會再增加，出現(xiàn)了繼續(xù)加水而多糖提取量趨于平穩(wěn)的現(xiàn)象?？紤]后續(xù)多糖提取液濃縮干燥等能耗因素，料液比以1∶40為最佳。

2.2.2 提取時間對紅毛藻多糖提取量的影響

在水浴溫度80℃、料液比1∶40的條件下，分別于0.5、1.0、1.5、2.0 h時停止提取紅毛藻多糖，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，隨著提取時間的延長，多糖提取量在0.5 h到1.5 h逐漸增加，但在1.5 h 到2.0 h過程中，多糖的提取量基本不增加。這可能是因為在提取初期，多糖能夠被不斷提取出來，但是隨著時間延長，多糖提取量逐漸升高而不再有明顯的變化，所以盡管時間延長也無法再提高多糖提取量。同時，也有可能是加熱過久導(dǎo)致部分多糖降解被破壞，從而導(dǎo)致提取量稍微下降。因此，提取時間選擇1.5 h 為最佳。

2.2.3 提取溫度對紅毛藻多糖提取量的影響

在料液比1∶40、提取時間1.5 h的條件下，分別于70、80、90、100℃下提取紅毛藻多糖，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，隨著提取溫度的升高， 多糖含量逐漸增大， 在90℃后多糖含量略微減少。這是因為多糖的溶解度隨著溫度的升高而升高，使得在一定范圍內(nèi)多糖提取量隨溫度升高而升高，但是當(dāng)溫度繼續(xù)升高時，由于多糖的熱不穩(wěn)定性導(dǎo)致其發(fā)生分解，且溫度過高會消耗能量，多糖提取量呈下降趨勢?？紤]到經(jīng)濟成本和防止多糖在高溫下遭受破壞，提取溫度不宜過高，選擇最佳提取溫度為90℃。

2.3 紅毛藻多糖提取工藝優(yōu)化

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以紅毛藻多糖提取量為考察指標，以提取溫度、提取時間、料液比為因子進行L9(34)正交實驗，以確定紅毛藻多糖的最佳提取工藝，正交實驗結(jié)果見表2、表3。

表2 L9(34)正交實驗結(jié)果

表3 正交實驗方差分析表

由表2正交實驗結(jié)果直觀分析可得，提取溫度和提取時間對紅毛藻多糖的提取量影響較顯著，而料液比對紅毛藻多糖的提取量影響最小。通過優(yōu)化的最佳提取工藝為A3B3C2，即以料液比為1∶40、在90℃下提取2.0 h為最佳提取工藝。通過表3正交實驗方差分析結(jié)果進一步表明，提取溫度與提取時間對紅毛藻多糖的提取量起主要作用。

2.4 提取工藝驗證

從表4提取工藝驗證實驗結(jié)果可知，3份樣品的紅毛藻多糖的平均提取量為77.57 mg/g，RSD為2.80%，表明所建立的紅毛藻多糖提取工藝穩(wěn)定可行。

表4 驗證實驗

2.5 紅毛藻多糖的抗氧化活性實驗

2.5.1 紅毛藻多糖清除DPPH自由基的能力測定

由實驗結(jié)果(圖5)可知隨著樣品濃度的增加，樣品的清除率也在不斷增加，說明紅毛藻多糖清除DPPH自由基呈劑量依耐型關(guān)系。根據(jù)樣品的濃度與清除率曲線結(jié)果可得，紅毛藻多糖清除DPPH自由基的IC50值為0.36 mg/mL。

2.5.2 紅毛藻多糖清除羥基自由基的能力測定

由實驗結(jié)果(圖6)可知紅毛藻多糖對羥基自由基的清除率隨著濃度的增加而提高，表明紅毛藻多糖濃度與羥基自由基的清除率呈正相關(guān)。根據(jù)樣品的濃度與清除率曲線結(jié)果可得紅毛藻多糖清除羥基自由基的IC50值為0.65 mg/mL。

3 討論

海藻多糖是藻類植物中重要的組成成分之一，約占干重的20%～70%，它是一類混合物，是海藻細胞間和細胞內(nèi)所含的各種高分子碳水化合物的總稱[8]。研究表明，海藻多糖具有廣泛的生物學(xué)活性，包括抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血脂和降血糖等[9-13]，因而其有望被開發(fā)成為保健品或者藥品，為實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供有益的參考[14]。

本實驗通過單因素實驗并結(jié)合正交實驗設(shè)計優(yōu)化紅毛藻多糖的提取工藝，最后確定紅毛藻多糖最佳提取工藝為料液比1∶40、在溫度為90℃下提取2.0 h。抗氧化活性研究表明紅毛藻多糖能有效清除DPPH自由基，其 IC50值為0.36 mg/mL；紅毛藻多糖清除羥基自由基的IC50值為0.65 mg/mL。本研究可為紅毛藻多糖的高值化開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)，也為海藻多糖的應(yīng)用前景[15]提供了理論參考。