楊瑞芳 李傳友

近年來(lái)，隨著結(jié)核病患者例數(shù)的增加，以及耐多藥結(jié)核分枝桿菌(multiple drug-resistanceMycobacteriumtuberculosis，MDR-MTB)和廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌(extensively drug resistantMycobacteriumtuberculosis，XDR-MTB)菌株的廣泛流行，結(jié)核病的防治形勢(shì)愈發(fā)嚴(yán)峻[1]。盡管宿主細(xì)胞中存在多種不同的免疫應(yīng)答機(jī)制以抵抗MTB，但是MTB也進(jìn)化出了相應(yīng)的生存機(jī)制，從而對(duì)抗宿主細(xì)胞的殺傷作用。然而，截至目前MTB的致病機(jī)制以及與宿主的相互作用等諸多問(wèn)題卻并沒(méi)有完全明確，而且目前基于MTB疫苗和新型藥物的抗結(jié)核治療的研發(fā)進(jìn)展極為緩慢。因此，臨床上對(duì)結(jié)核病的診斷和治療仍然面臨著巨大的挑戰(zhàn)。目前亟需建立一套完善且快速高效的MTB遺傳操作系統(tǒng)，對(duì)于深入研究MTB基因的功能，了解MTB的致病及耐藥機(jī)制，尋找耐藥基因，進(jìn)而開(kāi)發(fā)新型抗結(jié)核藥物和疫苗具有重要意義。

成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)最初源于Ishino等在分析大腸埃希菌中的堿性磷酸酶的同工酶(isozyme-converting alkaline phospatase，Iap)基因進(jìn)行核酸序列分析時(shí)被發(fā)現(xiàn)[2]，但當(dāng)時(shí)并未引起國(guó)內(nèi)外研究者的重視。直到2002年，研究者通過(guò)生物信息學(xué)方法在細(xì)菌和古細(xì)菌基因組中找出相似且廣泛存在的短重復(fù)序列及其間隔序列相關(guān)的基因，并將此種序列命名為“成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(CRISPR)”，與其相關(guān)的蛋白編碼基因命名為CRISPR相關(guān)基因(CRISPR associated genes，Cas)[3]，在此基礎(chǔ)上，CRISPR的相關(guān)研究才逐漸展開(kāi)。目前，CRISPR-Cas系統(tǒng)主要以細(xì)菌抵御外源DNA入侵時(shí)產(chǎn)生的自我保護(hù)機(jī)制為研究熱點(diǎn)。根據(jù)CRISPR-Cas系統(tǒng)中Cas基因種類(lèi)的多樣性以及Cas蛋白作用機(jī)理的不同可以分為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型[4]。其中，Ⅲ型CRISPR系統(tǒng)主要存在于古細(xì)菌中，系統(tǒng)較為復(fù)雜，主要有A、B兩種類(lèi)型，而MTB的CRISPR-Cas系統(tǒng)屬于Ⅲ-A型[5]，參與抗結(jié)核的免疫應(yīng)答反應(yīng)。近年來(lái)，隨著對(duì)CRISPR-Cas系統(tǒng)的深入研究，發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)可能與調(diào)控MTB毒力表達(dá)、耐藥及定向基因編輯方面存在一定的關(guān)系[6-7]。筆者就近年來(lái)CRISPR-Cas系統(tǒng)在MTB免疫和生理調(diào)控研究中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述。

CRISPR-Cas系統(tǒng)對(duì)MTB的免疫調(diào)控機(jī)制

CRISPR-Cas系統(tǒng)是由前導(dǎo)區(qū)(leader)、重復(fù)序列(repeat)、間區(qū)(spacer)及CRISPR周?chē)嚓P(guān)蛋白組成，Cas基因編碼構(gòu)成多種具有不同生理功能的Cas蛋白。不同的物種具有不同的前導(dǎo)區(qū)和重復(fù)序列，是因?yàn)榍皩?dǎo)區(qū)可作為CRISPR轉(zhuǎn)錄時(shí)的啟動(dòng)區(qū)和轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，而CRISPR位點(diǎn)有多個(gè)重復(fù)序列，但它們都有一個(gè)共同特征，即均有一個(gè)回文結(jié)構(gòu)，重復(fù)序列之間存在間區(qū)[8]。MTB中的CRISPR系統(tǒng)都有2個(gè)CRISPR位點(diǎn)[9]，一個(gè)具有24個(gè)重復(fù)序列，而另一個(gè)具有18個(gè)重復(fù)序列。由于這兩個(gè)CRISPR的重復(fù)序列不同。因此，它們屬于兩個(gè)不同的CRISPR位點(diǎn)。

CRISPR-Cas系統(tǒng)介導(dǎo)的免疫保護(hù)機(jī)制發(fā)揮主導(dǎo)作用，可以裂解MTB，保證宿主細(xì)胞的正常功能。此外，CRISPR-Cas系統(tǒng)還可以激活特異性免疫記憶應(yīng)答，預(yù)防同類(lèi)外源DNA的再次入侵[10-13]。主要包括3個(gè)階段：(1)適應(yīng)階段：主要獲取間隔序列并將其整合到CRISPR基因座。CRISPR系統(tǒng)會(huì)在前導(dǎo)序列與第一段重復(fù)序列之間插入一段與外源性基因片段同源的短DNA片段，同時(shí)伴有重復(fù)序列的復(fù)制。(2)表達(dá)階段：新的間隔序列整合到CRISPR基因座后，經(jīng)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生長(zhǎng)前體crRNA與crRNA加工成熟的階段，具體表現(xiàn)為這一前體crRNA在重復(fù)序列處被剪切，并被Cas內(nèi)切酶加工成短小的crRNA，然后與Cas蛋白結(jié)合形成Cas-crRNA作用復(fù)合體。(3)干擾階段：在crRNA的指導(dǎo)下靶向定位與裂解外源性核酸[11-13]。

CRISPR-Cas系統(tǒng)對(duì)MTB生理功能的調(diào)控

一、CRISPR-Cas系統(tǒng)用于轉(zhuǎn)錄調(diào)控和基因編輯

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究者發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas系統(tǒng)可用于干擾目的基因的轉(zhuǎn)錄，而研究最多的是Cas9，且當(dāng)Cas9的內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域發(fā)生突變時(shí)，會(huì)因失去核酸內(nèi)切酶活性而產(chǎn)生無(wú)活性的Cas(dCas9)。dCas9一方面可以通過(guò)結(jié)合到基因的啟動(dòng)子序列或者與轉(zhuǎn)錄抑制因子結(jié)合，從而抑制轉(zhuǎn)錄過(guò)程。另一方面，dCas9也可以與轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合而激活基因的轉(zhuǎn)錄[14-16]。此外，劉雅婷[17]發(fā)現(xiàn)Cas6和Cas10也參與了crRNA的加工過(guò)程。Cas2是一種保守的RNA內(nèi)切酶，存在于含有CRISPR的MTB基因組中，可以編碼基因Rv2816c的轉(zhuǎn)錄，且隨代謝抑制劑的治療而變化，如抗生素和應(yīng)激劑等[9,18]。此外，Zhang等[18]研究通過(guò)將Cas6開(kāi)放閱讀框(ORF)上游的197 bp的DNA片段克隆到無(wú)啟動(dòng)子的β-半乳糖苷酶基因(lacZ)報(bào)告子質(zhì)粒中，并將該Cas6-lacZ報(bào)告子質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BCG wildtype(WT)和Rv2837c(cnpB)缺失株(△cnpB)中，發(fā)現(xiàn)cnpB可以控制結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTBC)的CRISPR-Cas系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄，且通過(guò)一種高度保守的3′-5′寡核苷酸酶控制crRNA水平。

目前，基因編輯被認(rèn)為是生物研究中較常用的可以促進(jìn)基因鑒定和表征的一種有效技術(shù)。近幾年來(lái)，CRISPR-Cas9系統(tǒng)作為新一代的基因編輯技術(shù)，研究愈發(fā)熱門(mén)，它屬于Ⅱ型 CRISPR系統(tǒng)。CRISPR-Cas9系統(tǒng)通過(guò)兩種RNA和一種Cas蛋白精確地對(duì)雙鏈DNA進(jìn)行切割，從而實(shí)現(xiàn)基因編輯[16,19]。因此，未來(lái)在基因編輯和轉(zhuǎn)錄調(diào)控上，CRISPR-Cas9系統(tǒng)將發(fā)揮更大的作用。同時(shí)，CRISPR-Cas9系統(tǒng)靶向的準(zhǔn)確性以及產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂的效率也促進(jìn)了基因編輯和基因治療的發(fā)展[20-21]。此外，來(lái)自細(xì)菌的CRISPR-Cpf1系統(tǒng)也已被開(kāi)發(fā)為高效的基因編輯工具[22]。

Yan等[23]通過(guò)改進(jìn)非同源末端連接修復(fù)通路，并開(kāi)發(fā)了一種基于CRISPR切割和非同源末端連接修復(fù)途徑的基因組編輯工具。與傳統(tǒng)的方法相比，它可以有效地在MTB中同時(shí)產(chǎn)生雙突變和大規(guī)模的基因突變。因此，他們預(yù)計(jì)這種CRISPR-NHEJ輔助的基因組編輯系統(tǒng)將在MTB研究、疫苗開(kāi)發(fā)和藥物靶點(diǎn)分析等方面具有深遠(yuǎn)的應(yīng)用價(jià)值。Rock[24]發(fā)現(xiàn)從嗜熱鏈球菌中提取的Cas9酶在恥垢分枝桿菌中具有優(yōu)異的性能特征，因此開(kāi)發(fā)了一種優(yōu)化的CRISPR干擾(CRISPRi)系統(tǒng)，用于MTB的靶向基因沉默。在這個(gè)系統(tǒng)中，dCas9-sgRNA復(fù)合物與靶基因結(jié)合，通過(guò)阻斷RNA聚合酶啟動(dòng)子通路或轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)而影響轉(zhuǎn)錄過(guò)程。他們提出，基于CRISPR新的功能，基因組的應(yīng)用可能會(huì)產(chǎn)生一個(gè)更強(qiáng)大的結(jié)核病抗生素發(fā)現(xiàn)平臺(tái)，從而有助于實(shí)現(xiàn)MTB基因組測(cè)序，以及開(kāi)發(fā)全新的抗結(jié)核藥物[24-25]。此外，部分研究發(fā)現(xiàn)CRISPRi方法不僅可以在MTB中實(shí)現(xiàn)多基因靶向調(diào)控，也可以對(duì)其他高危險(xiǎn)性的非結(jié)核分枝桿菌(NTM)實(shí)現(xiàn)基因調(diào)控，這些結(jié)果為MTB基因組特征的全面認(rèn)識(shí)，明確致病機(jī)制提供新的方案與思路[26]。另一方面，國(guó)外研究指出，噬菌體療法結(jié)合CRISPRi可能成為一種新的有效解決方案來(lái)應(yīng)對(duì)MDR-MTB、XDR-MTB菌株的不斷出現(xiàn)[22]。Singh等[27]通過(guò)對(duì)141個(gè)分枝桿菌基因組進(jìn)行了比較分析，表明MTBC北京譜系CRISPR-Cas系統(tǒng)可能是由于插入序列IS6110的轉(zhuǎn)位所致，提示CRISPR-Cas系統(tǒng)可能在決定MTB不同譜系中也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。另一方面，Zhang等[28]在體外利用引物延伸方法，發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas系統(tǒng)Csm1(一種Ⅲ-A型 CRISPR-Cas系統(tǒng)效應(yīng)復(fù)合物中的重要蛋白，具有核酸酶活性)可以有效地延伸DNA引物鏈，提出MTB Csm1具有DNA聚合酶活性。

二、CRISPR-Cas系統(tǒng)對(duì)MTB毒力的調(diào)控

Cas2(Rv2816c)——一個(gè)已經(jīng)被報(bào)道的，可以在間區(qū)獲得過(guò)程中發(fā)揮重要作用的保守RNA核酸內(nèi)切酶，參與了逃避巨噬細(xì)胞免疫過(guò)程。國(guó)外一項(xiàng)研究表明，嗜肺軍團(tuán)菌的Cas2是侵染宿主不可或缺的重要因素，后猜測(cè)Cas2可能與MTB毒力及一些生理過(guò)程存在一定的關(guān)系[29]。而國(guó)內(nèi)黃琴琴[10]通過(guò)研究證明，Cas2的過(guò)表達(dá)使恥垢分枝桿菌單菌落形態(tài)發(fā)生改變，生長(zhǎng)速率加快，影響生物膜的形成和滑動(dòng)能力，以及降低恥垢分枝桿菌在巨噬細(xì)胞中的存活率等，因此他們也推測(cè)Cas2可能與其毒力相關(guān)。

Csm5(Rv2819c)和Csm4(Rv2820c)表達(dá)的兩種Cas蛋白屬于同一類(lèi)蛋白家族。國(guó)外學(xué)者對(duì)Rv2820c分別進(jìn)行體內(nèi)和體外研究，發(fā)現(xiàn)兩種實(shí)驗(yàn)中均可以促進(jìn)MTB的毒力[30]。此外，Rindi等[31]通過(guò)比較基因組學(xué)后，發(fā)現(xiàn)Csm5在MTB減毒株H37Ra中的表達(dá)量與在MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv中相比較，出現(xiàn)明顯下調(diào)，提示Csm5可能與MTB的毒力存在一定關(guān)系。這種同源基因表現(xiàn)出不同表型差異的現(xiàn)象以及發(fā)生毒力改變是未來(lái)結(jié)核病研究的熱點(diǎn)。

吳曉麗[32]通過(guò)制備抗Csm3多克隆抗體，發(fā)現(xiàn)Csm3作為MTB CRISPR-Cas系統(tǒng)中的一種分泌蛋白，能夠幫助細(xì)菌抵抗巨噬細(xì)胞的吞噬，從而提高細(xì)菌毒力。此外，他們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Csm3并不能引起巨噬細(xì)胞的凋亡，但是可以引起較弱的T細(xì)胞反應(yīng)，可見(jiàn)，CRISPR-Cas系統(tǒng)不僅與MTB的毒力有關(guān)，還可能與宿主免疫相關(guān)。

三、CRISPR-Cas系統(tǒng)對(duì)MTB耐藥性的調(diào)控

MDR-MTB和XDR-MTB菌株的出現(xiàn)和傳播增加了結(jié)核病治療的難度。同時(shí)，也使開(kāi)發(fā)新的有效的抗結(jié)核藥物更加具有挑戰(zhàn)性[1]。因此，利用噬菌體特異性感染分枝桿菌進(jìn)行結(jié)核病治療已成為MDR-TB和XDR-TB的一種新的治療方法。但在治療過(guò)程中，MTB對(duì)噬菌體的耐藥性迅速上升嚴(yán)重影響治療效果[33-34]。Cas1是Cas家族中最保守的蛋白質(zhì)，是一種金屬依賴的DNA特異性內(nèi)切酶，可以將間隔基整合到CRISPR序列中[33]。不同細(xì)菌屬的Cas1顯示出相關(guān)但不同的生化特性，更為有意義的是發(fā)現(xiàn)Cas1的缺失可能和耐藥性相關(guān)[35]，然而，Brudey等[36]發(fā)現(xiàn)北京譜系MTBC 即使在敲除Cas1基因后仍然是結(jié)核病高發(fā)地區(qū)非常成功的病原體。Wei等[7]重點(diǎn)研究了Ⅲ-A型CRISPR系統(tǒng)和Cas1的功能，發(fā)現(xiàn)抗生素或環(huán)境刺激可以使Cas1缺失株更容易轉(zhuǎn)變?yōu)槌至魻顟B(tài)，使MTBC最終發(fā)展為耐藥菌的可能性增加，而這個(gè)結(jié)果提示Cas1可能參與MTB的耐藥性和應(yīng)激反應(yīng)。Cas1作為CRISPR-Cas系統(tǒng)的重要相關(guān)蛋白，盡管在其他細(xì)菌或腫瘤中的作用已經(jīng)得到了深入的研究，但對(duì)于MTBC的研究還不完全清楚。因此，關(guān)于Cas1功能的進(jìn)一步研究仍然具有重要的意義。

綜上所述，CRISPR-Cas系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于MTB的表達(dá)調(diào)控、耐藥基因和遺傳修飾等多方面，提示其在未來(lái)MTB生物學(xué)研究領(lǐng)域中具有強(qiáng)大的影響力。此外，隨著CRISPR-Cas系統(tǒng)的臨床應(yīng)用逐漸成熟，將為結(jié)核病的臨床診斷、新型抗結(jié)核藥物和疫苗的研究提供一種新的思路。但依然需要對(duì)CRISPR-Cas系統(tǒng)進(jìn)行深入研究，不斷探討和發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)的潛在功能，深入了解MTB的致病和耐藥機(jī)制，為結(jié)核病的治療策略提供更多理論依據(jù)和技術(shù)支持。