諶蒙蒙 董靜 賈紅彥 張宗德 潘麗萍

結(jié)核性腦膜炎(tuberculous meningitis,TBM)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)通過血行播散侵入軟腦膜形成結(jié)核結(jié)節(jié)，結(jié)核結(jié)節(jié)破潰后病灶內(nèi)大量MTB進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔引起的非化膿性炎性疾病。TBM作為致死率和致殘率最高的結(jié)核病類型，其死亡率在10%～36.5%[1-2]。目前確診TBM的金標(biāo)準(zhǔn)是腦脊液(cerebrospinal fluid, CSF)抗酸染色涂片或MTB培養(yǎng)陽性，但是CSF抗酸染色陽性率低，只有10%～20%，MTB培養(yǎng)時(shí)間長(1～8周)且不夠敏感(敏感度為36%～81.8%)[2]，因此對(duì)TBM的早期診斷不具有明顯的臨床意義。近年來，WHO推薦GeneXpert MTB/RIF技術(shù)用于疑似TBM患者的診斷，雖然GeneXpert MTB/RIF技術(shù)對(duì)CSF標(biāo)本中MTB的診斷具有較高的特異度(98.1%)，但是敏感度相對(duì)較低(63%)。因此，GeneXpert MTB/RIF技術(shù)僅可以作為TBM診斷的納入標(biāo)準(zhǔn)而不能用于排除標(biāo)準(zhǔn)，需要結(jié)合其他高敏感度的檢測(cè)方法用于TBM的早期診斷[3]。

由于TBM患者早期的臨床表現(xiàn)和影像學(xué)變化均不具有特異性，且缺乏有效的實(shí)驗(yàn)室診斷方法，致使TBM的早期診斷異常困難。然而，早期診斷TBM對(duì)于患者的及時(shí)治療和改善預(yù)后至關(guān)重要。目前的研究顯示，CSF中存在多種生物標(biāo)志物，可用于TBM的早期診斷，包括MTB來源的生物標(biāo)志物和宿主來源的生物標(biāo)志物。其中較為常見的MTB生物標(biāo)志物包括脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)[4]、早期分泌抗原靶6(ESAT-6)、培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)[5]、抗原Ag85B[6]、熱休克蛋白X(hspX)和蘋果酸合成酶G(GlcB)[7]等，它們作為MTB特異性抗原指標(biāo)，可直接反映MTB進(jìn)入機(jī)體的情況。近年來關(guān)于宿主生物標(biāo)志物的研究，大致可分為蛋白、RNA和代謝物，它們反映了MTB感染后機(jī)體免疫應(yīng)答的指標(biāo)變化，與疾病的進(jìn)展轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。本文主要針對(duì)目前CSF中宿主診斷生物標(biāo)志物用于TBM診斷的進(jìn)展和挑戰(zhàn)展開綜述。

一、CSF中細(xì)胞因子標(biāo)志物對(duì)TBM的診斷

MTB感染機(jī)體后，引起以T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)和遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)為主的免疫反應(yīng)，而細(xì)胞因子在免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)中起重要作用，如誘導(dǎo)細(xì)胞黏附分子的形成、促進(jìn)中性粒細(xì)胞的遷移以及炎癥介質(zhì)的釋放等，從而加強(qiáng)炎癥反應(yīng)。因此，通過檢測(cè)某些細(xì)胞因子可能有助于TBM 的早期診斷、病情評(píng)估及預(yù)后判斷。

目前γ干擾素釋放試驗(yàn)(interferon-γ release assays, IGRA)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床。Yu等[8]研究發(fā)現(xiàn)，CSF 中的IGRA檢測(cè)對(duì)于診斷TBM效果優(yōu)于外周血中的IGRA檢測(cè)，在外周血和CSF中檢測(cè)的敏感度分別為78.0%和77.0%，特異度分別為61.0%和88.0%，受試者工作特征曲線下面積(AUC)分別為0.76和0.83?？梢姡ㄟ^檢測(cè)CSF中的γ-干擾素(IFN-γ)水平可以幫助診斷TBM患者。

除IFN-γ外，也有多種細(xì)胞因子被證明與TBM疾病相關(guān)。Sharma等[9]發(fā)現(xiàn)，TBM患者血清和CSF中各種促炎細(xì)胞因子的水平顯著升高，包括白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-2 (IL-2)、白細(xì)胞介素-6 (IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和IFN-γ，且血清和CSF中的促炎細(xì)胞因子水平與TBM的嚴(yán)重程度相關(guān)。Kwon等[10]發(fā)現(xiàn)，TBM組CSF中腺苷脫氨酶(adenosine deaminase, ADA)、白細(xì)胞介素12亞單位β(IL-12p40)、白細(xì)胞介素13(IL-13)、巨噬細(xì)胞炎蛋白α(MIP-1α)、可溶性程序性死亡因子1(PD-1)和程序性死亡受體配體1(PD-L1)的水平明顯高于非TBM組，且IL-12p40、IL-13、MIP-1α、可溶性PD-1和PD-L1的濃度對(duì)TBM診斷的敏感度都在80%以上，因此，CSF中IL-12p40、IL-13、MIP-1α、可溶性PD-1和PD-L1水平可能是早期診斷TBM的有效輔助指標(biāo)。在兒童TBM患者中，Manyelo等[11]發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、IL-13和抗菌肽LL-37 可以作為兒童TBM患者輔助診斷的工具，且用IFN-γ和髓過氧化物酶(MPO)分別替代IL-13和抗菌肽LL-37后可以提高TBM診斷的準(zhǔn)確性(敏感度為82.6%，特異度為95.8%)。

以上研究顯示，TBM患者CSF中存在多種細(xì)胞因子指標(biāo)改變，且細(xì)胞因子水平與TBM患者疾病嚴(yán)重程度(包括CSF間隙滲出物，導(dǎo)致粘連、腦積液和閉塞性血管炎等腦損傷并發(fā)癥)密切相關(guān)。因此，可以通過監(jiān)測(cè)細(xì)胞因子水平來反映TBM患者的疾病進(jìn)程及預(yù)后。隨著IGRA檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，IFN-γ目前已經(jīng)應(yīng)用于臨床輔助診斷TBM患者，但是存在敏感度不高的問題。TNF-α作為重要的促炎細(xì)胞因子，對(duì)TBM患者疾病發(fā)展起著重要作用。但是，單個(gè)細(xì)胞因子標(biāo)志物很難直接作為TBM患者的診斷工具，因?yàn)榇蟛糠盅仔约?xì)胞因子在其他炎性疾病中也會(huì)存在改變，因此需要通過多種細(xì)胞因子聯(lián)合來提高TBM診斷的準(zhǔn)確性。

二、CSF中其他蛋白標(biāo)志物對(duì)TBM的診斷

目前ADA已經(jīng)作為臨床上診斷TBM的常規(guī)檢查，但是缺乏統(tǒng)一的ADA閾值標(biāo)準(zhǔn)，限制了該指標(biāo)用于TBM診斷的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。Shekhawat等[12]研究證明，在MTB感染后，宿主的熱休克蛋白(hsps)水平發(fā)生改變(hsp25、hsp70和hsp90水平均有所升高、hsp60水平有所下降)。且Shekhawat 等[13]的另一項(xiàng)研究顯示，hsp70和hsp90在TBM診斷中的敏感度分別為89%和88%，特異度分別為82%和89%，組合hsps (hsp25、hsp60、hsp70和hsp90)能更有效診斷TBM患者。Yang等[14]發(fā)現(xiàn)尼爾樣2型分子(NELL2)是TBM組中神經(jīng)元特異性差異最大的蛋白，TBM組NELL2水平較健康對(duì)照組明顯降低，且NELL2能夠以83.3%的敏感度和75%的特異度來區(qū)分TBM患者與健康對(duì)照者。Chen等[15]發(fā)現(xiàn)，CSF中高遷移率族蛋白1(HMGB-1)水平對(duì)于TBM診斷的敏感度雖然不高(61.02%)，但具有較好的特異度(89.94%)，鑒別TBM高?；颊吲c非神經(jīng)系統(tǒng)的其他結(jié)核病患者(如肺結(jié)核、腸結(jié)核或關(guān)節(jié)結(jié)核)的敏感度為79.49%，特異度為94.52%，提示CSF中HMGB-1水平是TBM高?；颊咴缙阼b別診斷較好的指標(biāo)。Peng等[16]發(fā)現(xiàn)，TBM患者CSF和血清中Delta-like 1配體(DLL1)水平均明顯增高，且CSF中DLL1含量與血清中DLL1含量呈正相關(guān)，表明CSF和血清中DLL1的水平對(duì)TBM的診斷具有潛在的價(jià)值。譚燕[17]發(fā)現(xiàn)，TBM患者組CSF和血清中的單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)水平均明顯高于對(duì)照組，且經(jīng)過治療后有所改善，提示MCP-1對(duì)TBM診斷具有一定的價(jià)值?？梢?，宿主的hsp25、hsp60、hsp70和hsp90組合用于TBM診斷顯示出了較高的價(jià)值，可能是由于宿主hsp具有分子伴侶功能，而且是對(duì)抗病原體免疫反應(yīng)中的主要免疫原，因此在TBM發(fā)展中起著重要作用[13]。其他單一蛋白(NELL2、HMGB-1和DLL1等)也在TBM診斷中的不同方面顯示出一定的潛在價(jià)值。但這些指標(biāo)單獨(dú)用于TBM的診斷效能相對(duì)有限，可能需要進(jìn)一步探索不同蛋白組合來提高診斷價(jià)值。

三、 CSF中RNA標(biāo)志物對(duì)TBM的診斷

微小核糖核酸(microRNA, miRNA)在組織、血液或CSF中的異常表達(dá)與人體多種疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系，包括結(jié)核病[18]。Pan等[19]發(fā)現(xiàn)CSF和外周血miR-29a在兒童TBM患者中的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，診斷TBM的AUC均大于0.85，且miR-29a表達(dá)與顱內(nèi)壓增高、意識(shí)障礙、局灶性腦癥狀、腦膜刺激、水腫、腦電圖異常和腦外結(jié)核等因素密切相關(guān)，說明檢測(cè)miR-29a的表達(dá)水平可以幫助早期診斷兒童TBM患者，且聯(lián)合CSF與外周血中的miR-29a 進(jìn)行分析可顯著提高TBM的診斷價(jià)值。另一項(xiàng)研究描繪了TBM和病毒性腦炎(VM)患者的miRNA表達(dá)譜，以更好地了解這兩種疾病的發(fā)病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)TBM患者外周血4個(gè)miRNA 組合(miR-126-3p、miR-130a-3p、miR-151a-3p、miR-199a-5p) 具有較好的識(shí)別能力(AUC=0.89，敏感度為90.6%，特異度為86.7%)，且其中3個(gè)miRNA (miR-126-3p、miR-130a-3p、miR-151a-3p)的表達(dá)量在TBM和病毒性腦膜炎患者的CSF樣本中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[20]。

外泌體是由活細(xì)胞分泌釋放到體液中直徑為30～100 nm的微泡，內(nèi)含有RNA和蛋白質(zhì)分子，參與細(xì)胞間通訊和免疫調(diào)節(jié)。在不同的外泌體生物標(biāo)志物中，miRNA被認(rèn)為是最有前途的候選生物標(biāo)志物，因?yàn)樗哂懈哓S度、固有的穩(wěn)定性和易于采樣等特點(diǎn)[21]。尹慧敏等[22]發(fā)現(xiàn)，CSF外泌體let-7d在不同類型的腦膜炎患者中存在差異性表達(dá)，在化膿性腦膜炎及TBM患者中l(wèi)et-7d表達(dá)明顯低于病毒性腦膜炎和正常組，同時(shí)化膿性腦膜炎患者let-7d的表達(dá)水平明顯低于TBM患者，提示通過檢測(cè)CSF外泌體let-7d的表達(dá)水平可以用來區(qū)分不同類型的腦膜炎患者。路雁惠等[23]發(fā)現(xiàn)let-7d在TBM患者CSF外泌體中的表達(dá)水平明顯下降，可作為TBM診斷及與相關(guān)腦炎鑒別診斷的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。Hu等[24]發(fā)現(xiàn)6個(gè)miRNA (miR-20a、miR-20b、miR-26a、miR-106a、miR-191、miR-486)在結(jié)核病患者血漿外泌體標(biāo)本中存在表達(dá)差異，通過機(jī)器模擬算法與miRNA結(jié)合診斷，在TBM中AUC達(dá)到0.97，表明檢測(cè)外泌體miRNA含量可以提高TBM的臨床診斷水平。

信使核糖核酸(messenger RNA, mRNA)差異性表達(dá)可以反映TBM進(jìn)展。Rohlwink等[25]發(fā)現(xiàn)，兒童TBM患者全血和CSF的兩個(gè)不同部位(腦室和脊髓)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜發(fā)生改變，TBM患者與健康對(duì)照者全血樣本中存在2230個(gè)差異基因表達(dá)?？梢姡琓BM有明顯的免疫應(yīng)答模式，典型和非典型炎性小體活化顯著增加，T細(xì)胞活化明顯降低。TBM患者與非結(jié)核腦部感染對(duì)照者腦室CSF樣本中存在312個(gè)差異基因表達(dá)，顯示腦室CSF轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜改變與神經(jīng)元興奮性毒性和腦損傷相關(guān)；TBM患者兩個(gè)不同部位CSF之間存在389個(gè)差異基因表達(dá)，顯示脊髓CSF轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜改變與蛋白質(zhì)翻譯和細(xì)胞因子信號(hào)相關(guān)；反映了TBM患者外周、中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及腦區(qū)內(nèi)的疾病發(fā)展過程是不同的。另有其他研究發(fā)現(xiàn)，B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和胸膜微環(huán)境中mRNA的差異性表達(dá)也與結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)聯(lián)[26-28]。

雖然至今尚未發(fā)現(xiàn)與TBM相關(guān)的長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)和環(huán)狀RNA (circular RNA, circRNA)標(biāo)志物，但He等[29]發(fā)現(xiàn)，結(jié)核病患者與社區(qū)獲得性肺炎患者和健康對(duì)照者的血漿中存在12個(gè)差異性表達(dá)的lncRNA，且進(jìn)一步驗(yàn)證顯示2種lncRNA——ENST00000354432和ENST00000427151在結(jié)核病患者血漿樣本中的表達(dá)顯著上調(diào)，當(dāng)截?cái)嘀捣謩e設(shè)定為0.05和0.03時(shí)，有82%的結(jié)核病患者的表達(dá)水平高于這兩個(gè)截?cái)嘀?，且沒有社區(qū)獲得性肺炎患者和健康對(duì)照者，提示血漿中l(wèi)ncRNA的表達(dá)水平與結(jié)核病具有一定的相關(guān)性，這兩個(gè)lncRNA 可能是結(jié)核病快速診斷的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。

目前，關(guān)于TBM患者CSF中RNA標(biāo)志物的研究主要集中在miRNA方面，且這些研究提示miRNA可能是診斷TBM的潛在生物標(biāo)志物。但是，大部分研究是針對(duì)血漿、細(xì)胞等樣本材料進(jìn)行miRNA的篩選和驗(yàn)證，針對(duì)CSF的研究仍然較少。對(duì)于TBM來說，CSF是其病灶部位的直接相關(guān)體液，其中蘊(yùn)含豐富的疾病信息，可以直接反映疾病的發(fā)生發(fā)展。因此，尚需要進(jìn)一步開發(fā)針對(duì)TBM患者CSF特異性miRNA的深入研究。目前關(guān)于TBM患者CSF中mRNA、lncRNA和circRNA標(biāo)志物的研究較少，但其在結(jié)核病診斷和治療中的潛在價(jià)值已顯現(xiàn)，未來仍需要進(jìn)一步探索它們?cè)赥BM患者中的診斷價(jià)值。

四、CSF中代謝標(biāo)志物對(duì)TBM的診斷

眾所周知，MTB感染會(huì)改變機(jī)體的代謝過程。臨床上發(fā)現(xiàn)TBM患者普遍存在CSF葡萄糖、氯化物水平降低和乳酸水平升高等改變，通過對(duì)CSF葡萄糖、氯化物和乳酸濃度變化的監(jiān)測(cè)，對(duì)判斷TBM患者的狀態(tài)和TBM病情轉(zhuǎn)歸具有一定的指導(dǎo)意義。目前代謝組學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)其他多種新的代謝物與TBM疾病相關(guān)聯(lián)。Li等[30]通過CSF代謝組學(xué)發(fā)現(xiàn)25種有助于區(qū)分TBM和病毒性腦膜炎患者的關(guān)鍵代謝物，包括參與氨基酸、碳水化合物、脂蛋白和脂質(zhì)、核苷代謝的分子和其他有機(jī)分子，這些代謝標(biāo)志物可能是TBM鑒別診斷的潛在生物標(biāo)志物。Zhang等[31]發(fā)現(xiàn)，能區(qū)別TBM與病毒性腦膜炎、細(xì)菌性腦膜炎和陰性對(duì)照組的代謝物分別有23種、6種和21種，它們與TBM患者CSF代謝物的差異主要涉及碳水化合物、氨基酸和脂質(zhì)等代謝。Dai等[32]發(fā)現(xiàn)，與其他類型的腦膜炎相比，TBM患者CSF中存在大量代謝物水平的增加，其中主要的代謝物結(jié)果有所不同，包括氨基酸、尿素、脂類、脂肪酸、膽紅素、膽汁酸和尿酸，主要涉及氨基酸、脂類和核苷的代謝，因此可以通過TBM和其他類型腦膜炎的不同代謝特征，確定潛在的代謝生物標(biāo)志物用于TBM患者的鑒別診斷。在兒童TBM患者中，Van等[33]研究發(fā)現(xiàn)，有8種代謝物(2-羥基丁酸鹽、肉堿、肌酸、磷酸肌酸、谷氨酸鹽、谷氨酰胺、胍基乙酸鹽和脯氨酸)與兒童TBM密切相關(guān)，它們與糖代謝失控、脯氨酸和肌酸代謝上調(diào)和谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)受阻相關(guān)，因此通過分析兒童TBM患者的代謝特征，可幫助兒童TBM患者進(jìn)行早期診斷。

以上研究顯示，CSF中多種代謝物與TBM疾病相關(guān)聯(lián)，主要參與了碳水化合物、氨基酸、脂類和核苷酸等代謝過程，通過分析CSF中代謝物特征有助于TBM的早期診斷。但是代謝水平相對(duì)較復(fù)雜，實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用可能會(huì)比較困難。

五、 總結(jié)與展望

綜上所述，CSF中存在多種宿主生物標(biāo)志物與TBM疾病進(jìn)展及轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)的蛋白、RNA和代謝標(biāo)志物。目前發(fā)現(xiàn)部分宿主生物標(biāo)志物顯示出對(duì)TBM診斷具有較高敏感度和特異度，主要集中于細(xì)胞因子和其他CSF蛋白標(biāo)志物，RNA層面研究相對(duì)較少，代謝物類別復(fù)雜，因此，這些標(biāo)志物距離應(yīng)用于臨床仍需要大量研究去驗(yàn)證。目前的研究提示宿主標(biāo)志物與數(shù)學(xué)模型結(jié)合更有利于提高TBM早期診斷效能，因此，未來可能通過CSF中宿主標(biāo)志物的多組學(xué)聯(lián)合來尋求更好的TBM早期診斷方法。此外，相對(duì)于細(xì)胞或組織而言，CSF中相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)水平會(huì)相對(duì)較低，可能會(huì)給CSF中宿主標(biāo)志物的研究和進(jìn)一步的廣泛應(yīng)用帶來一定的困難，未來需要開發(fā)敏感度更高的檢測(cè)技術(shù)以更好應(yīng)用這些標(biāo)志物。