DAF rs150046210遺傳變異與老年結(jié)直腸癌易感性關(guān)系研究

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是世界第三大常見(jiàn)惡性腫瘤，全球范圍內(nèi)每年大約有80萬(wàn)人死于CRC[1]，嚴(yán)重威脅人類的健康。惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白(complement regulatory protein，CRP)參與的免疫逃逸機(jī)制有著十分密切的關(guān)系[2]。在腫瘤組織上高表達(dá)的CRP與腫瘤抵抗補(bǔ)體介導(dǎo)的腫瘤殺傷機(jī)制有關(guān)，并且可使腫瘤逃避機(jī)體免疫攻擊[3]。衰變加速因子(decay-accelerating factor，DAF)作為重要的CRP，在多種腫瘤中高表達(dá)[4-5]，且與不良預(yù)后有關(guān)[6]。核苷酸多態(tài)性不僅是影響人群腫瘤易感性的重要因素，也是揭示腫瘤異質(zhì)性的原因之一。鑒于DAF在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用，本研究通過(guò)檢測(cè)可能影響DAF基因表達(dá)和功能的單核苷酸多態(tài)性在CRC病人和正常對(duì)照組中的分布情況，探討DAF遺傳變異與老年CRC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系，為CRC病因探索提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究經(jīng)華北理工大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并與所有入組病人簽署知情同意書。入選華北理工大學(xué)附屬唐山市工人醫(yī)院及華北理工大學(xué)附屬唐山市人民醫(yī)院于2008年4月至2012年12月收集的病理診斷為CRC的外周血標(biāo)本，其中結(jié)腸癌病人380例，直腸癌病人450例，排除有其他惡性腫瘤病史的人群；入選同一時(shí)期在該院進(jìn)行體檢的健康人群作為對(duì)照組，按年齡和性別分別與病例組進(jìn)行成組設(shè)計(jì)，隨機(jī)選取380例健康人外周血作為結(jié)腸癌對(duì)照組，隨機(jī)選取450例健康人外周血作為直腸癌對(duì)照組，排除既往腫瘤史或與病例組有血緣關(guān)系的人群。

1.2 DAF基因位點(diǎn)選擇 通過(guò)Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)篩選DAF基因多態(tài)性位點(diǎn)，篩選條件：在亞洲人群次要等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)>0.05，最終確定rs150046210，遺傳變異點(diǎn)插入21個(gè)堿基，命名為Ⅱ基因型，缺失21堿基命名為DD基因型。

1.3 研究方法 EDTA抗凝管收集每個(gè)志愿者清晨空腹靜脈血5 mL。使用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的血液基因組DNA提取試劑盒(DP318)提取外周血DNA，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書操作并將提取產(chǎn)物置于-20 ℃冰箱儲(chǔ)存。采用primer 5.0軟件設(shè)計(jì)DAF rs150046210 PCR引物，正向引物序列：5′-TCGTAAATAAGGAGAACCCG-3′，反向引物序列：5′-TACTGGGAGGTCTGTCAAAG-3′。PCR反應(yīng)體系包括2×Ftax PCR Mix混合液3μL，基因組DNA約1～20 ng，10μmol/μL的上下游引物各0.1μL，后補(bǔ)足去離子水至6μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸3 min。使用3.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，DD基因型為一個(gè)196 bp的片段，DI基因型為196 bp和217 bp的兩個(gè)片段，Ⅱ基因型為一個(gè)217 bp的片段。每次PCR實(shí)驗(yàn)均設(shè)置空白對(duì)照孔以避免實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。為保證本研究基因分型的可靠性，隨機(jī)抽取10% DNA標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，且重復(fù)結(jié)果與原結(jié)果一致。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 將資料整理后用Excel錄入數(shù)據(jù)，應(yīng)用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。使用χ2檢驗(yàn)比較病例組與對(duì)照組基本信息(性別、年齡、吸煙和飲酒狀況)及基因型的分布是否有差異。應(yīng)用非條件Logistic回歸分析經(jīng)性別、年齡、吸煙和飲酒狀況調(diào)整后的OR及95%CI，分析比較不同基因型與CRC易感性之間的關(guān)系。所有的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象人口特征情況 本研究納入結(jié)腸癌男205例(53.9%)，女175例(46.1%)，其對(duì)照組男220例(57.9%)，女160例(42.1%)。直腸癌病例男298例(66.2%)，女152例(33.8%)，其對(duì)照組男308例(68.4%)，女142例(31.6%)。結(jié)腸癌組、直腸癌組病例分別與對(duì)照組比較，性別、年齡、吸煙和飲酒狀態(tài)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表示病例組與對(duì)照組間具有良好的可比性。見(jiàn)表1。

表1 研究對(duì)象基本特征(n，%)

2.2 DAF rs150046210多態(tài)性與CRC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系 在結(jié)腸癌和直腸癌的對(duì)照組中，基因型的分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(HWE)，研究對(duì)象具有良好的代表性。非條件Logistic回歸分析顯示，與DAF rs150046210 DD基因型攜帶者相比，Ⅱ基因型攜帶者結(jié)、直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)均明顯升高(OR=1.764，95%CI：1.763～2.675，P=0.008；OR=1.789，95%CI：1.227～2.608，P=0.003)。見(jiàn)表2。

表2 DAF rs150046210多態(tài)性與CRC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系

2.3 DAF rs150046210遺傳變異與CRC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)分層分析 為了進(jìn)一步分析DAF rs150046210遺傳變異與CRC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系，對(duì)與CRC相關(guān)的多種因素(性別、年齡、吸煙和飲酒)進(jìn)行分層分析。性別分層分析顯示，女性中Ⅱ基因型攜帶者結(jié)腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加(OR=2.015，95%CI:1.085～3.742)；男性中Ⅱ基因型攜帶者直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加(OR=2.041，95%CI:1.290～3.228)。年齡分層分析顯示，低年齡組Ⅱ基因型攜帶者結(jié)腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加(OR=2.355，95%CI:1.273～4.356)；高年齡組Ⅱ、DI基因型攜帶者直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加(OR=2.313，95%CI:1.334～4.012；OR=1.757，95%CI:1.106～2.789)。吸煙分層分析顯示，Ⅱ基因型可以增加不吸煙病人結(jié)腸癌、直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=1.791，95%CI:1.106～2.900；OR=2.395，95%CI:1.514～3.788)。飲酒分層分析顯示，Ⅱ基因型增加不飲酒病人結(jié)腸癌、直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=1.714，95%CI：1.086～2.704；OR=1.923，95%CI:1.221-3.030)，見(jiàn)表3，4。

表3 DAF rs150046210多態(tài)性與結(jié)腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)分層分析

表4 DAF rs150046210與直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)分層分析

3 討論

DAF位于1號(hào)染色體長(zhǎng)臂的補(bǔ)體調(diào)控位置[7]，作為重要的CRP，在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，被認(rèn)為是癌癥治療的重要分子靶標(biāo)。DAF屬于膜結(jié)合型補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白，通過(guò)抑制補(bǔ)體攻膜復(fù)合物的形成，從而使腫瘤細(xì)胞逃脫補(bǔ)體攻擊。有研究認(rèn)為,過(guò)表達(dá)DAF是CRC預(yù)后不良標(biāo)志之一[8]。惡性腫瘤相關(guān)基因遺傳多態(tài)性是影響人群腫瘤易感性的重要因素之一，探討CRC相關(guān)基因與其遺傳特征的關(guān)系對(duì)降低腫瘤的發(fā)生率和死亡率具有非常重要的意義。

之前有研究表明，DAF基因編碼區(qū)遺傳變異可增加個(gè)體罹患胃癌[9]和非小細(xì)胞肺癌[10]的風(fēng)險(xiǎn)。但是關(guān)于DAF非編碼區(qū)的遺傳變異是否影響老年人患CRC的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)還鮮有報(bào)道。本研究首次發(fā)現(xiàn)DAF rs150046210顯著增加了老年個(gè)體罹患CRC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

吸煙和飲酒是CRC發(fā)病的危險(xiǎn)因素，但本研究以吸煙、飲酒狀況對(duì)CRC組和對(duì)照組進(jìn)行分層分析后發(fā)現(xiàn)，DAF基因rs150046210變異只增加不吸煙、不飲酒病人CRC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，并未發(fā)現(xiàn)吸煙、飲酒與攜帶Ⅱ等位基因?qū)RC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有交互作用。這可能是因?yàn)槲鼰?、飲酒作為CRC的危險(xiǎn)因素所產(chǎn)生的主效應(yīng)掩蓋了DAF基因多態(tài)性在CRC發(fā)病過(guò)程中所起的作用，所以只有在不吸煙、不飲酒人群中才能觀察到DAF基因多態(tài)位點(diǎn)對(duì)CRC的影響；也可能是因?yàn)檫M(jìn)行分層分析后的吸煙、飲酒組樣本量較小導(dǎo)致結(jié)果的偶然性。因此，對(duì)于DAF基因非編碼區(qū)基因多態(tài)性僅影響不吸煙、不飲酒者CRC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的確切機(jī)制還有待進(jìn)一步探索。

本研究以60歲為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)CRC組和對(duì)照組進(jìn)行年齡分層分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于DAF rs150046210 ID/DD基因型攜帶者，在年齡≤60歲亞組及女性亞組中，Ⅱ基因型攜帶者罹患結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)分別增加了1.355倍和1.015倍；相對(duì)于DAF rs150046210 ID/DD基因型攜帶者，在年齡>60歲亞組及男性亞組中，Ⅱ基因型攜帶者罹患直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)分別增加了1.313倍和0.257倍。表明DAF rs150046210變異使低年齡組和女性罹患結(jié)腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增高，也會(huì)增加高年齡組男性患直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。所以，DAF rs150046210變異對(duì)CRC易感性有影響，此外，環(huán)境等其他因素長(zhǎng)期的協(xié)同作用也可能會(huì)增加患病風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明DAF rs150046210變異影響老年人患CRC的遺傳易感性，進(jìn)一步為探索補(bǔ)體系統(tǒng)在惡性腫瘤中的作用提供了理論依據(jù)。