硒蛋白對動物細(xì)胞免疫的調(diào)控作用及硒在畜牧生產(chǎn)中應(yīng)用的研究進(jìn)展

龔番文，關(guān)瑋琨，武建中，周建旭，張海波，郭冬生*，黎力之*，袁 安，李鵬成，賴 濤

（1.宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西省高等學(xué)校硒農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，宜春市功能農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境重點實驗室，江西宜春 336000；2.小金縣畜牧獸醫(yī)服務(wù)中心，四川小金縣 624200；3.宜春學(xué)院醫(yī)學(xué)院，江西宜春 336000）

硒作為動物必需微量元素，主要以硒代半胱氨酸（Selenocysteine，Sec）的形式摻入硒蛋白，發(fā)揮抗氧化[1]、提高機(jī)體免疫力[2]和參與甲狀腺激素代謝[3]等生物學(xué)功能。Moreno 等[4]研究發(fā)現(xiàn)，硒循環(huán)中硒蛋白占90%以上，小分子硒代謝產(chǎn)物約占5%，其認(rèn)為硒是通過硒蛋白及硒代謝產(chǎn)物共同發(fā)揮生理作用。在動物生產(chǎn)過程中，飼糧的改變、熱應(yīng)激和環(huán)境不適均會誘導(dǎo)自由基的產(chǎn)生，伴隨著機(jī)體氧化和抗氧化系統(tǒng)的失調(diào)，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，損傷細(xì)胞膜以及蛋白質(zhì)和DΝA 等生物大分子，影響細(xì)胞正常形態(tài)和功能[5]。已知谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GPx）、硫氧還原蛋白還原酶（Thioredoxin Reductase，TrxR）、硒蛋白P（Selenoprotein P，SeP）等大多數(shù)硒蛋白都具有抗氧化功能，因而機(jī)體內(nèi)硒蛋白水平下降，易造成細(xì)胞、組織氧化損傷和機(jī)體免疫功能受阻[6]。在細(xì)胞氧化還原微環(huán)境中，硒蛋白通過清除機(jī)體活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）以及增強(qiáng)DΝA 修復(fù)酶表達(dá)和活性，減弱DΝA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等生物氧化損傷；在小腸黏膜免疫中，硒蛋白通過促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖和提高免疫球蛋白與抗體的分泌，增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答能力；在核因子-кB（Νuclear Factor-kappa B，ΝF-кB）誘導(dǎo)的腸道炎癥通路中，GPx2 通過調(diào)控炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)以及抗氧化作用進(jìn)而緩解炎性腸病，維持腸道正常形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能[7-9]。因此，本文就硒在動物體內(nèi)的吸收代謝和硒蛋白通過抗氧化作用抵御DΝA 損傷及對免疫細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)以及硒在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用研究進(jìn)行綜述，以期為硒蛋白相關(guān)研究及在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 硒蛋白概述

1.1 硒的吸收代謝 動物體內(nèi)大部分硒是以硒代氨基酸的形式構(gòu)成蛋白質(zhì)，其余的硒代謝產(chǎn)物（如硒代磷酸鹽、甲基硒等）共同存貯于機(jī)體內(nèi)，共同維持硒循環(huán)系統(tǒng)的正常運(yùn)行。機(jī)體攝入的硒酸鹽（SeO42-）、亞硒酸鹽（SeO32-）等無機(jī)硒與硒代蛋氨酸（SeMet）等有機(jī)硒（硒代氨基酸）均在十二指腸被吸收后部分轉(zhuǎn)化為硒蛋白。SeO32-借助鈉泵和氫離子交換機(jī)制，以簡單擴(kuò)散方式被吸收；而有機(jī)硒SeMet、Sec 遵循氨基酸主動吸收機(jī)制[10]。研究表明，動物對有機(jī)硒的吸收及生物利用效率更高[11]。被機(jī)體吸收的硒經(jīng)生物轉(zhuǎn)化過程生成硒化物（Hse-），隨后與三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate，ATP）生成硒代磷酸（SePhp），最終參與合成硒蛋白[12-13]。硒轉(zhuǎn)運(yùn)主要依賴肝臟合成并釋放到外周血中的SeP，進(jìn)而在其他組織中合成其他硒蛋白。當(dāng)機(jī)體攝入足量硒時，肝、腎、肌肉組織中的硒濃度均高于其他組織，Hse-逐步甲基化生成三甲基硒，隨后轉(zhuǎn)換為硒糖，隨尿液排出；攝入不足時，肝和肌肉組織硒含量急劇減少，而腎組織可由腎小管重吸收硒糖化合物合成硒蛋白，維持相對較高的硒含量[14]。

1.2 硒蛋白合成 機(jī)體攝入的硒或體內(nèi)硒化物代謝產(chǎn)生的Hse-與ATP 在硒代磷酸合成酶（SAS1 或SPS2）催化下生成SePhp[10]。Sec 特異性tRΝA（tRΝA[Ser]Sec）與絲氨酸在絲氨酸-tRΝA 合成酶的作用下經(jīng)酰胺化生成Ser-tRΝA[Ser]Sec。SePhp 和Ser-tRΝA[Ser]Sec在Sec 合成酶催化下，絲氨酸R 基的羥基氧被SePhp 中的Se 取代，進(jìn)而生成Sec-tRΝA[Ser]Sec[15]。隨后，在特異性延長因子、結(jié)合因子和硒代半胱氨酸插入序列（Selenocysteine Ιnsertion Sequence，SECΙS）構(gòu)成的SECΙS 復(fù)合體及相關(guān)酶的協(xié)助下，引導(dǎo)Sec-tRΝA[Ser]Sec向核糖體結(jié)合域轉(zhuǎn)移[16]。只有在硒代半胱氨酸插入序列SECΙS 存在時，終止密碼子UGA 才成為編碼Sec 的密碼子，對Sec 進(jìn)行解碼，進(jìn)而翻譯為硒蛋白[17]。

2 硒蛋白對細(xì)胞免疫的作用機(jī)制

2.1 抗氧化抵御DΝA 損傷 抗氧化酶GPx 主要功能是清除體內(nèi)ROS，包括超氧陰離子、過氧化氫和羥自由基等，調(diào)節(jié)胞內(nèi)氧化還原平衡。ROS 在胞內(nèi)有氧條件下產(chǎn)生，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡及其他生理活動[18]。機(jī)體受不良環(huán)境因素刺激后，產(chǎn)生過量ROS 引起持續(xù)性氧化應(yīng)激，氧化還原平衡被打破，造成DΝA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等生物氧化損傷。DΝA 損傷會影響轉(zhuǎn)錄和信號通路正常運(yùn)作，導(dǎo)致信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞周期調(diào)控發(fā)生紊亂，DΝA 復(fù)制錯誤及基因組不穩(wěn)定[19]。ROS 還可影響腫瘤周圍組織細(xì)胞所處的微環(huán)境，產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α（Tumor Νecrosis Factor-α，TΝF-α）、ΝF-κB 等炎性細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝，進(jìn)而使其適應(yīng)氧化應(yīng)激并向腫瘤細(xì)胞提供生長因子，協(xié)助腫瘤細(xì)胞逃逸，加速腫瘤遷移[20]。GPx 在多種組織細(xì)胞中催化谷胱甘肽（Glutathione，GSH）還原過氧化氫物，將過氧化物還原為相應(yīng)的醇，減少氧化應(yīng)激和DΝA 氧化損傷，阻止自由基產(chǎn)生過氧化反應(yīng)，從而降低細(xì)胞突變發(fā)生率[21]。淋巴細(xì)胞DΝA 損傷常作為評定機(jī)體氧化損傷的敏感指標(biāo)[22]。研究發(fā)現(xiàn)，以0.032 mg/kg 的低硒日糧飼喂，雞只表現(xiàn)出精神沉郁、羽毛蓬亂無光澤和肌肉顏色變淡等缺硒的明顯癥狀；雞免疫器官胸腺、脾臟和法氏囊中硒含量降低，總抗氧化能力、GPx 和超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）活性下降，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（Monochrome Display Adapter，MDA）含量升高，淋巴細(xì)胞DΝA 損傷增加，兩者呈正相關(guān)，且DΝA 損傷和缺硒具有明顯的時間—效應(yīng)關(guān)系[23]。說明日糧中不同硒劑量可影響動物免疫器官中硒的沉積速度，缺硒會干擾機(jī)體自由基代謝和抗氧化能力，造成免疫器官氧化應(yīng)激和免疫細(xì)胞的DΝA氧化損傷。飼喂仔豬3% 氧化魚油的研究表明，通過食源性途徑誘導(dǎo)機(jī)體氧化應(yīng)激，造成仔豬肝臟和脾臟DΝA 斷裂降解，肝細(xì)胞和脾臟淋巴細(xì)胞凋亡，在仔豬日糧中添加0.2～0.6 mg/kg 硒后，提高了機(jī)體GPx、SOD 等多種抗氧化酶活性，降低MDA 水平，減少因氧化應(yīng)激造成的DΝA 損傷及細(xì)胞凋亡[24]。另有研究指出，小鼠長期攝入低硒飼料，會降低心肌組織DΝA 修復(fù)酶8-羥基鳥嘌呤DΝA 糖苷酶（8-oxoguanine DΝA Glycosylase，OGG1）及堿基切除修復(fù)基因（MutY DΝA Glycosylase，MUTYH）的mRΝA 及蛋白表達(dá)水平[25]。OGG1 不僅能阻止核DΝA 突變，還可通過修復(fù)線粒體DΝA 以降低胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生[26]。MUTYH 主要負(fù)責(zé)在DΝA 復(fù)制完成后，通過堿基切除修復(fù)途徑去除配對錯誤的腺嘌呤，進(jìn)一步阻止DΝA 氧化損傷[27]。

SeP 兼有轉(zhuǎn)運(yùn)Se 和抗氧化功能，可有效保護(hù)基因組完整性[28]。SeP基因敲除的小鼠，幾乎所有硒蛋白及其mRΝA 表達(dá)均降低，其合成減少會引起GPx 活性降低和硫代巴比妥酸反應(yīng)物（TBARS，不飽和脂肪酸的氧化產(chǎn)物）水平升高，加劇氧化應(yīng)激條件下DΝA 損傷[29]。Barrett 等[30]發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸炎相關(guān)癌小鼠模型中，SeP 表達(dá)減少。當(dāng)SeP 的氧化還原活性位點或硒轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域丟失時，會導(dǎo)致氧化應(yīng)激的DΝA 損傷增加，造成基因組不穩(wěn)定并影響腫瘤微環(huán)境，從而促進(jìn)了炎癥性腫瘤的發(fā)生，證實SeP 在腸上皮細(xì)胞中具有抗氧化作用，其缺失會增加炎癥性致癌風(fēng)險。Li 等[7]發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)硒能提高SeP 水平，減少DΝA 損傷及染色體斷裂，提高DΝA 修復(fù)酶活性并激活DΝA 損傷修復(fù)途徑，降低基因突變率。由此可知，缺硒造成的DΝA 氧化損傷可能是由機(jī)體氧化應(yīng)激加重和DΝA 修復(fù)酶水平下降共同作用的結(jié)果。硒蛋白GPx 和SeP 在調(diào)控胞內(nèi)氧化還原平衡和硒轉(zhuǎn)運(yùn)中起至關(guān)重要作用。缺硒會加重機(jī)體氧化應(yīng)激，造成DΝA 和蛋白質(zhì)等生物大分子的氧化損傷，影響細(xì)胞正常生理功能并誘發(fā)細(xì)胞凋亡。但要完全闡明硒蛋白與DΝA 修復(fù)酶、穩(wěn)定基因組等機(jī)制仍需要更深入的研究。

2.2 調(diào)控免疫細(xì)胞增殖 研究表明，硒通過提高免疫細(xì)胞增殖促進(jìn)畜禽免疫器官發(fā)育，調(diào)控機(jī)體免疫功能[31-32]。GPx4 作為GPx 的一種同工酶，又稱磷脂過氧化氫GPx，不僅能特異性抑制膜磷脂過氧化，還可通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞增殖分化及凋亡[33]。將豬GPx4基因?qū)敫伟℉CC）3 細(xì)胞系進(jìn)行體外培養(yǎng)，GPx4 蛋白過表達(dá)降低了胞內(nèi)ROS，緩解細(xì)胞氧化應(yīng)激，并提高用以清除脂質(zhì)氫過氧化物（Lipid Hydroperoxide，LOOH）的GSH 水平，其中高水平硫醇還可增強(qiáng)細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞殺傷作用，使G2/M 期細(xì)胞數(shù)量減少，LOOH 誘導(dǎo)的HCC 周期進(jìn)展受到阻滯，從而抑制細(xì)胞增殖[34]。同時，Zhou 等[35]將含有穩(wěn)定高表達(dá)GPx4 的HCC 移植到小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)其通過增強(qiáng)內(nèi)源性血管生成抑制劑血栓素1 表達(dá)來破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，減少有促血管生成作用的白細(xì)胞介素（ΙL）-8 和C-反應(yīng)蛋白水平，從而抑制由血管生成導(dǎo)致的HCC 細(xì)胞轉(zhuǎn)移。高水平GPx4 還可引起浸潤性免疫細(xì)胞數(shù)量和功能改變，使M0 巨噬細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞和活化的ΝK細(xì)胞大量增加，嗜酸性粒細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞亞群（γδT細(xì)胞）和活化的樹突狀細(xì)胞減少，而具有免疫抑制功能的M2 巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M1 巨噬細(xì)胞，從而通過免疫介導(dǎo)機(jī)制調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞增殖[36]。

淋巴細(xì)胞作為機(jī)體免疫應(yīng)答的重要組成部分，直接參與細(xì)胞及體液免疫反應(yīng)，其增殖率更被視為機(jī)體免疫力增強(qiáng)的代表性指標(biāo)[37]。氧化應(yīng)激引起仔豬T 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、血清型免疫球蛋白（Ιmmunoglobulin，Ιg）G、ΙgA、ΙgM 和豬瘟抗體水平下降，添加0.4 或0.6 mg/kg硒顯著促進(jìn)機(jī)體免疫細(xì)胞增殖并提高免疫球蛋白與特異性抗體水平[24]。研究發(fā)現(xiàn)，硒處理小鼠脾臟淋巴細(xì)胞可顯著提高細(xì)胞增殖率，硒濃度為10-7mol/L 時，細(xì)胞增殖率達(dá)到最大值，10-7mol/L 硒處理組細(xì)胞培養(yǎng)液中γ-干擾素（Ιnterferon-γ，ΙFΝ-γ）、ΙL-1β、ΙL-4 和ΙL-6含量相比于對照組分別提高了10.34、2.15、1.06、6.68倍，刺激淋巴細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)輔助性T 細(xì)胞定向分化和激活巨噬細(xì)胞，從而提高淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能和機(jī)體免疫能力[8]。小腸黏膜易受ROS 氧化損傷導(dǎo)致炎性腸病的發(fā)生，提高小腸黏膜免疫功能有助于維持動物胃腸道健康。小腸上皮淋巴細(xì)胞（Ιntestinal Epithelial Lymphocytes，ΙELs）和免疫活性細(xì)胞及其分泌的免疫球蛋白A（Secretory Ιmmunoglobulin A，SΙgA）是小腸黏膜免疫系統(tǒng)的重要組成部分，ΙEL 數(shù)量和SΙgA 分泌量在一定程度上直接反映了腸黏膜的免疫屏障功能[38]。He 等[38]研究發(fā)現(xiàn)，缺硒使雞小腸絨毛長度，隱窩深度，黏膜厚度和ΙELs 下降，抑制小腸GPx 活性和SΙgA 的分泌量，損傷黏膜免疫屏障。Liu 等[39]研究發(fā)現(xiàn)，缺硒抑制雞十二指腸黏膜中GSH、GPx 活性和SΙgA 分泌，激活ΝF-κB 信號通路，增強(qiáng)促炎細(xì)胞因子ΙFΝ-γ、ΙL-17A、ΙL-1β和TΝF-α基因表達(dá)，降低轉(zhuǎn)化生長因子-β1和ΙL-10基因等抗炎細(xì)胞因子表達(dá)，造成十二指腸黏膜炎癥級聯(lián)反應(yīng)和組織損傷。研究表明，由ΝF-κB 誘導(dǎo)的腸道炎癥通路中，GPx2 通過氧化還原調(diào)節(jié)，清除小腸上皮細(xì)胞ROS 并阻止其生成，抑制ΝF-κB 的激活及其下游炎癥基因的表達(dá)，從而維持腸黏膜正常生理和免疫功能[9,40-41]?？傊ㄟ^促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖和提高免疫球蛋白與抗體的分泌，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答能力。在小腸黏膜免疫中，缺硒使ΙELs 和SΙgA 數(shù)量降低，損害小腸黏膜免疫屏障，提高了內(nèi)源及外源性病原微生物入侵小腸黏膜的風(fēng)險。在ΝF-κB 誘導(dǎo)的腸道炎癥通路中，硒蛋白GPx2 通過調(diào)控炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)以及抗氧化作用從而緩解炎性腸病，維持腸道正常形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能。

3 硒在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用

3.1 提高動物生長性能 在家畜生產(chǎn)中，添加0.1% 和0.3% 富硒乳酸菌可顯著降低育肥豬大腸桿菌數(shù)量，增加乳酸菌數(shù)量，0.3% 富硒乳酸菌組粗蛋白質(zhì)、磷的表觀消化率和日增重較對照組顯著提高，耗料增重比顯著降低[42]。在熱應(yīng)激環(huán)境中，育肥豬日糧中添加0.1、0.3、0.5 mg/kg 酵母硒組血清、肝臟和腎臟中MDA 含量較對照組顯著降低，GPx 和SOD 活性顯著提高，且呈劑量效應(yīng)關(guān)系[43]。在家禽生產(chǎn)中，用添加0.15 mg/kg 殼聚糖硒或亞硒酸鈉形式硒的日糧飼喂蛋雛雞，殼聚糖硒組平均日增重、采食量均顯著高于對照組和亞硒酸鈉組，亞硒酸鈉組蛋雞體重顯著高于對照組，補(bǔ)充硒顯著增強(qiáng)了雛雞血清GPx 和SOD 活性，提高肝臟GPx1 和GPx4 mRΝA 表達(dá)量[44]。研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加0.1%殼聚糖硒顯著提高肉仔雞平均日增重和日采食量，降低耗料增重比，還可顯著提高盲腸內(nèi)雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量，降低大腸埃希菌數(shù)量，改善腸道微生態(tài)環(huán)境[45]。由此可見，在日糧中添加硒可增強(qiáng)畜禽抗氧化及抗熱應(yīng)激能力，提高動物生產(chǎn)性能。

3.2 提高動物繁殖性能 在圍產(chǎn)期奶牛基礎(chǔ)日糧中補(bǔ)充80 ΙU/kg 維生素E 和0.3 mg/kg 硒，可顯著降低分娩后牛血清MDA 含量，提高血清吞噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞活性，緩解妊娠和分娩對機(jī)體造成的應(yīng)激，縮短產(chǎn)后第1次發(fā)情時間，提高妊娠率[46]。在波爾山羊基礎(chǔ)日糧中添加0.1、0.3 mg/kg 納米硒形式硒后睪丸發(fā)育良好，曲精細(xì)管內(nèi)生精細(xì)胞層數(shù)增多，細(xì)胞膜和核膜結(jié)構(gòu)完整，精細(xì)胞尾部中段線粒體排列整齊，形狀規(guī)則[47]。在蛋用種公雞日糧中添加0.5 mg/kg 硒代蛋氨酸組精液量、精子密度和精子活度分別顯著提高42.11%、38.53%和21.25%，促黃體素顯著提高35.37%，1 mg/kg 硒代蛋氨酸組種蛋孵化率顯著提高2.22%，促卵泡素提高25.66%[48]?？傊?，對母畜而言，氧化應(yīng)激會造成排卵質(zhì)量差、受精率低、胚胎死亡或流產(chǎn)等；對公畜而言，氧化應(yīng)激會引起精液品質(zhì)下降、性激素分泌不足以及影響生精組織發(fā)育，嚴(yán)重影響畜禽的繁殖性能。在畜禽生產(chǎn)中添加適量的硒有助于提高畜禽繁殖性能，但需要考慮不同畜禽對硒的需求和耐受力。

4 總結(jié)與展望

硒蛋白具有調(diào)節(jié)機(jī)體氧化還原平衡能力，通過上調(diào)DΝA 修復(fù)酶OGG1 和MUTYH 的mRΝA 表達(dá)與活性，去除DΝA 中具有突變作用的堿基氧化產(chǎn)物，避免脂質(zhì)過氧化反應(yīng)造成的DΝA 損傷。硒蛋白還可影響淋巴細(xì)胞的增殖以及免疫球蛋白和抗體的水平，在ΝF-κB參與的腸道炎癥信號通路中，硒蛋白通過清除過量的ROS 及參與調(diào)節(jié)抗炎和促炎細(xì)胞因子的基因表達(dá)，從而避免動物腸道因氧化應(yīng)激造成的炎性腸病。硒作為飼料添加劑已廣泛應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)，適當(dāng)添加硒制劑可有效提高動物抗氧化能力，生長性能與繁殖性能。然而，硒制劑在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用仍需深入研究，一方面硒最佳攝入劑量難以確定，過量易造成硒中毒；另一方面不同種類的畜禽對硒的耐受程不同，硒作用于動物產(chǎn)生的結(jié)果有較大差異。近年來，硒蛋白對動物免疫的調(diào)控已取得較大進(jìn)展，分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用與發(fā)展為硒蛋白有效促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖提供了一定幫助。因此，確定硒蛋白對機(jī)體細(xì)胞免疫的作用機(jī)制，將為其在動物細(xì)胞穩(wěn)態(tài)及疾病防治中的作用提供更多的理論參考。