賈 爍，鄧 潔，陳功文，鄭火青

（浙江大學動物科學學院，浙江 杭州 310058）

2020 年收錄于Web of Science 核心集的論文中，與蜜蜂病毒有關的研究成果共237 篇。研究論文大部分涉及2 種或更多種病毒，內容主要集中在流行病學和蜜蜂病毒與其他致病因子的協(xié)同作用。研究最多的病毒是殘翅病毒（Deformed wing virus, DWV） 和囊狀幼蟲病毒（Sacbrood virus, SBV），與前2 年的研究熱點一致。

Web of Science 收錄的關于蜜蜂病毒的237篇論文中，主要作者來自37 個國家和地區(qū)，發(fā)表論文數(shù)量最多的國家為美國（59 篇），其次為中國（40 篇） 和德國（15 篇）。這些文章來源于114 種出版物，其中發(fā)表論文數(shù)大于5篇的分別是Viruses（21 篇）、Insects（14 篇）、Journal of Apicultural Research（9 篇）、Journal of Invertebrate Pathology（8 篇）、Scientific reports（8 篇）、PLoS One（7 篇） 和Frontiers in Microbiology（6 篇）。針對237 篇論文逐一分析排查，其中與蜜蜂病毒密切相關的研究性論文91 篇，綜述論文4 篇，另有8 項專利申請。

本文結合研究方向和研究內容，有針對性地選擇Web of Science 和中國知網中的部分文章進行綜述，以期為國內蜜蜂病毒學研究和蜜蜂病毒病防控提供一定的參考。

1 病毒流行病學

1.1 流行病學調查

流行病學調查有利于研究者掌握病毒和其他病原體的流行情況和趨勢，并及時采取措施降低病原體對蜂群的危害。通過對常見蜜蜂病原進行檢測，Luis 等人首次報道了在古巴發(fā)現(xiàn)東方蜜蜂微孢子蟲（Nosema ceranae）、急性蜜蜂麻痹病毒(Acute bee paralysis virus, ABPV)、DWV 和SBV，且發(fā)現(xiàn)這些病原體在古巴已廣泛流行[1]。在土耳其蜜蜂群中，DWV 是最流行的蜜蜂病毒，瓦螨和微孢子蟲也能共同侵染蜂群，但所檢測的樣本中均未檢測到克什米爾蜜蜂病毒(Kashmir bee virus, KBV)和小蜂螨，此外，多種病毒共同感染的情況較為普遍[2]。而土耳其東部地區(qū)的26 個意蜂蜂場中，DWV 和黑蜂王臺病毒(Black queen cell virus, BQCV)的陽性率分別為69.23% （18/26） 和88.46%（23/26），ABPV 和慢性蜜蜂麻痹病毒(Chronic bee paralysis virus, CBPV)均為陰性，狄斯瓦螨（Varroa destructor） 的感染率為89%[3]。

2016 年美國加利福尼亞州的流行病學調查結果顯示，DWV、BQCV、SBV 和西奈湖病毒（Lake Sinai virus, LSV） 是檢出率較高的幾種病毒，此外，蜂群健康與LSV2 豐度呈反比關系[4]。在斯洛文尼亞，意蜂LSV 的感染率（75.92%） 顯著高于熊蜂的感染率（17.07%），并且鑒定出3 個不同的LSV 毒株，分別為LSV1、LSV2、LSV3[5]。

1.2 DWV 相關報道

DWV 是最常見的蜜蜂病毒，其與狄斯瓦螨的協(xié)同作用會降低蜂群的健康水平，縮短冬季蜜蜂的壽命[6,7]。之前有研究報道蜜蜂病毒能夠感染螞蟻，但是這些研究大多數(shù)都局限于一個本地螞蟻種群。最新的研究使用DWV 和2種廣泛入侵日本的螞蟻（Paratrechina longicornis和Anoplolepis gracilipes） 來評估了亞太地區(qū)螞蟻中蜜蜂病毒的流行病學和系統(tǒng)發(fā)育關系。在這2 種螞蟻中都檢測到了DWV，同種螞蟻擁有相似的病毒感染狀況，但不同種螞蟻之間的地理分布模式和來源水平不同。此外，入侵性螞蟻中檢測到的DWV 在遺傳學上與從亞洲的蜜蜂中分離到的DWV 相似，這表明入侵性螞蟻對本地DWV 的富集可能很普遍，但DWV 對螞蟻介導的本地節(jié)肢動物的傳播效率可能因螞蟻的種類而不同[8]。

De Souza 等（2020） 調查了南非DWV-A、DWV-B 和DWV-C 3 種基因型病毒的感染率及其病毒載量，并將研究結果與巴西、英國和美國最近的數(shù)據進行了比較，發(fā)現(xiàn)DWV- B是南非最普遍的基因型[9]；同時，DWV-B 也是比利時流行率最高的基因型，且瓦螨的寄生率與DWV-B 病毒載量之間存在顯著的相關性，但大多數(shù)蜂群中DWV-B 僅以低或中等病毒載量存在[10]。而在智利的蜂場中，DWV-A的流行率最高（71%），DWV-B 的流行率很低，且未檢測到DWV-C 基因型[11]；在阿根廷，DWV-A 的感染率超過90%，DWV-B 的感染率也達到了47%，并且在同一樣本中測到了2 種基因型，但這2 種基因型能否重組以及可能帶來哪些危害仍需進一步研究[12]。

2 病毒傳播

病毒傳播途徑廣泛，研究發(fā)現(xiàn)DWV-A 可以通過蜂產品進行傳播。Schittny 等人針對該結論提出，在貿易條例中應考慮引入新病毒或毒株的風險評估，蜂產品的衛(wèi)生證書中也應包括對病毒的分析[13]。

蜂王可以通過垂直傳播途徑將病毒傳遞給工蜂，所以普遍認為蜂王的健康狀況可以代表蜂群中工蜂的患病概況，有研究者調查了工蜂和蜂王之間DWV 的傳播關系，確認蜂王能將病毒傳染給工蜂，但未發(fā)現(xiàn)從工蜂到蜂王的DWV 傳播證據[14]。

蜜蜂病毒不僅能在蜜蜂群內廣泛傳播，同時也能侵染其他動物和昆蟲。 例如，Gusachenko 等（2020） 證明了DWV 在熊蜂體內的復制，并發(fā)現(xiàn)熊蜂對DWV 某些侵染途徑具有較強的抵抗力[15]。

Al Naggar 等（2020） 比較了BQCV 的水平傳播方式（飼喂和注射） 對成年蜜蜂的影響，發(fā)現(xiàn)與喂食蜜蜂BQCV 相比，將BQCV直接注射到血淋巴中會導致更高的死亡率、更高的病毒滴度和RNAi 途徑關鍵基因表達的顯著變化[16]。

反向遺傳系統(tǒng)可以用于研究病毒復制、傳播和定位，也能更好地了解病毒的傳播和致病機制。Gusachenko 等（2020） 證明了病毒在瓦螨體內的復制，還利用熒光蛋白修飾過的DWV 基因組直接觀察病毒在注射的蛹或喂養(yǎng)的幼蟲體內的分布，這些研究提供了對病毒復制動力學、傳播和發(fā)病機制的了解，并提供了新的工具來研究DWV 介導的蜂群損失[15]。

3 病毒檢測方法

蜜蜂病毒隱性感染情況很常見，大多數(shù)情況下僅依靠發(fā)病癥狀不能夠獲得準確的鑒定，因此基于免疫學方法以及病毒核酸檢測技術進行蜜蜂病毒檢測方法的開發(fā)始終是蜜蜂病毒學中的研究內容之一。Li 等以其實驗室分離到的中華蜜蜂囊狀幼蟲病毒（Chinese sacbrood virus，CSBV） CSBV 相關基因為基礎，首先分別以Linker 連接的VP1、VP2 基因和連續(xù)編碼VP2、VP4 和VP1 的整段基因為靶基因進行原核表達，并用純化的表達蛋白來免疫小鼠和雞。然后通過比較這2 個表達蛋白的抗原性，篩選出抗原性較好的蛋白代替CSBV 作為免疫原，制備單克隆抗體，并利用制備的單克隆抗體研制出了雙抗體夾心ELISA 檢測試劑盒。該試劑盒具有較高特異性、敏感性和準確性，可以用于CSBV 的臨床檢測，也為CSBV 的快速診斷和早期預警提供了技術支撐[17]。

同一內參基因在不同實驗條件下的穩(wěn)定性不同，因此選擇最優(yōu)的內參基因對蜜蜂基因表達的量化研究至關重要。Deng 等評估了11 個內參基因在3 種不同病毒感染和RNAi 條件下的表達情況。結果表明，在不同的病毒感染下， 應該選擇不同的內參基因。 ache2、rps18、β-actin、 tbp 和tif 可用做檢測蜜蜂感染以色列麻痹病毒（Israeli acute bee paralysis virus，IAPV） 時基因表達水平的內參基因，而actin 和tif 可用做檢測蜜蜂感染CBPV 時基因表達水平的內參基因，rpl14、tif、 rpsa、ubc 和ache2 可用做檢測中蜂幼蟲感染CSBV時基因表達水平的內參基因， rpl14、 tif、rps18、ubc 和α-tubulin 可用做檢測RNAi 處理下意蜂基因表達水平的內參基因[18]。

此外，關于蜜蜂病毒檢測方法的研究進展還有很多。比如，Jin 等創(chuàng)建了一個具有感染性的CSBV 克隆，結合綠色熒光蛋白的表達，他們直觀地觀察到該克隆病毒可以感染中蜂和意蜂并在中蜂幼蟲體內以口服接種的方式傳播[19]。Kim 等介紹了應用qPCR 和DNA芯片技術來快速檢測蜜蜂DWV 病毒[20]。Dittes等指出獸醫(yī)診斷方法也可以在蜜蜂健康管理中發(fā)揮重要作用，討論了該方法在成年蜜蜂病害檢查中的應用，并重點介紹了ABPV、KBV、IAPV、CBPV 和DWV 以及狄斯瓦螨等混合感染的診斷和鑒別方法[21]。Cagirgan 等建立了一種多重RT-PCR 檢測方法，能同時對7 種蜜蜂病毒（IAPV、SBV、DWV、ABPV、BQCV、KBV、CBPV） 進行快速檢測，檢測結果靈敏可靠、經濟實惠[22]。

4 病毒與蜜蜂的互作機制

蜜蜂細胞系可以為研究蜜蜂病毒與其宿主之間相互作用的分子機制、抗病毒藥物的開發(fā)等提供有利工具。為此，Guo 等系統(tǒng)綜述了膜翅目昆蟲細胞系的原代培養(yǎng)、建立連續(xù)細胞系以及建立無病毒細胞系的方法，并指出蜜蜂細胞系在昆蟲病毒學中的潛在應用[23]。在缺乏可用的蜜蜂細胞系的情況下，探索蜜蜂病毒在其它物種細胞系中復制的能力，可以為在細胞水平上研究和了解病毒感染以及抗病毒藥物的篩選等相關研究提供新的方法。為此，Erez 和Chejanovsky （2020） 使用鱗翅目血細胞細胞系(P1) 進 行DWV 的 感 染 研 究[24]。 結 果 表 明，DWV 在細胞體內復制，且基因組拷貝數(shù)在感染后增加。盡管從感染細胞中獲得的病毒產量很低，但該研究首次證明DWV 可以在異種細胞系中復制。

盡管缺乏合適蜜蜂細胞系，對蜜蜂病毒致病機理的研究仍取得了頗多進展。Huang 等人通過酵母雙雜交和免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)DWV 的結構蛋白VP2 與宿主的熱休克蛋白10 （Hsp10）存在互作關系，且當過表達DWV 的VP2 蛋白時，Hsp10 的表達量降低[25]。而McMenamin 等人的研究也發(fā)現(xiàn)與在恒溫條件下的蜜蜂相比，熱應激蜜蜂（即在42℃下生存4 h） 體內的模型病毒（Sindbis-GFP） 水平降低，且病毒感染和/ 或熱休克導致了6 個熱休克蛋白編碼基因和3 個免疫基因發(fā)生差異表達[26]。上述結果表明包括熱休克反應在內的應激反應途徑可能在蜜蜂免疫和抗病毒作用中起著重要作用。

Deng 等采用mRNA 和SRNA 高通量測序方法，研究了中蜂幼蟲在自然條件下感染CSBV 后的microRNAs 和siRNAs 的表達變化。他們發(fā)現(xiàn)，參與免疫反應的絲氨酸蛋白酶表達下調，而針對絲氨酸蛋白酶的siRNAs 表達上調。此外，CSBV 感染還影響了中蜂幼蟲角質層蛋白A1A 和A3A 的表達，從而增加了中蜂幼蟲對CSBV 感染的易感性。這項研究結果表明sRNA 可能參與調節(jié)蜜蜂的免疫反應[27]。

Li-Byarlay 等研究了在感染IAPV 后5 h、20 h 和48 h 時白眼蛹基因表達和DNA 甲基化的動態(tài)變化。結果表明，白眼蛹在感染IAPV 后20 h 和48 h 時比在5 h 時有更多的差異表達基因，但在感染IAPV 后5 h 時比20 h和48 h 時DNA 甲基化區(qū)域變化更顯著[28]。

5 病毒與其他因子的協(xié)同作用

同時暴露于多種壓力因素被認為是導致蜜蜂群體數(shù)量下降的主要原因，因此針對病毒與其他不利因素的協(xié)同作用對蜂群影響的研究一直是蜜蜂病毒學領域的熱點。

5.1 蜜蜂病毒與蜂螨的協(xié)同作用

在巴布亞新幾內亞（Papua New Guinea,PNG），雅氏瓦螨（Varroa jacobsoni） 已經通過宿主轉移實現(xiàn)了在當?shù)氐囊夥渲蟹敝场Ｔ谧畛醯姆淙簱p失后，養(yǎng)蜂人在沒有使用殺螨藥的情況下維持蜂群超過10 年，這表明這些蜜蜂種群有一種未知的螨蟲耐受機制。研究人員利用高通量測序等方法，發(fā)現(xiàn)這些地區(qū)的意蜂、東方蜜蜂以及蜂螨中都未發(fā)現(xiàn)DWV 的感染，因此推測在無DWV 感染的情況下，意蜂對雅氏瓦螨可能具有較強的耐受性[11]。相對于雅氏瓦螨，狄斯瓦螨因其與DWV 的協(xié)同作用對蜂群造成的毀滅性危害而受到了更多關注。在實驗室條件下，Gisder 等利用熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization） 等方法在狄斯瓦螨細胞中發(fā)現(xiàn)了DWV 的信號，并且找到了DWV-B 感染腸上皮細胞和唾液腺的直接證據，但他們并未發(fā)現(xiàn)DWV-A 的感染[29]。而de Guzman 等對菲律賓巴拉望島上的意蜂蜂蛹及其寄生蟲小蜂螨（Tropilaelaps） 和狄斯瓦螨的流行病學調查結果也表明DWV-B 比DWV-A更流行，此外，無論是感染了哪種螨蟲的蜂蛹，它們的DWV 的感染率都比未被螨蟲感染的高[30]。這些結果表明了狄斯瓦螨不僅能夠促進DWV 的傳播，還會對DWV 的不同毒株產生相應的影響，從而可能導致致病性強的DWV-B 的流行。

狄斯瓦螨的廣泛分布及其在蜂群中對病毒傳播的促進作用也引發(fā)了學者們對由蜂螨帶來的蜜蜂病毒流行對其他重要昆蟲造成危害的擔憂。由此，Brettell 等人通過轉錄組測序探究了在有瓦螨和無瓦螨存在時，意蜂、胡蜂、蒼蠅和螞蟻等的病毒譜的差異[31]。結果顯示，雖然瓦螨與蜜蜂中DWV 的豐度顯著增加有關，但在其他類群中沒有發(fā)現(xiàn)這種變化。這表明在蜂群中由瓦螨流行而導致的病毒載量的增加可能并不會導致同域分布的其他昆蟲體內病毒載量的上升。

5.2 蜜蜂病毒與農藥的協(xié)同作用

新煙堿類殺蟲劑是全球使用最廣泛的殺蟲劑，這些農藥是通過影響昆蟲中樞神經系統(tǒng)中的煙酰胺乙酰膽堿受體發(fā)揮作用的一種神經毒素。這類殺蟲劑在農業(yè)上的廣泛使用，被認為是造成授粉類昆蟲尤其是蜜蜂數(shù)量下降的一個關鍵因素。常見的新煙堿類殺蟲劑包括吡蟲啉、啶蟲脒、噻蟲嗪、噻蟲胺等，但這些殺蟲劑與蜜蜂病毒的協(xié)同作用對蜂群的可能影響仍未得到充分的闡述。2020 年發(fā)表的有關病毒與農藥的協(xié)同作用的文章有4 篇，其中3 篇的研究對象為新煙堿類殺蟲劑（噻蟲嗪、噻蟲胺） 與DWV 等病毒的協(xié)同作用，剩余1 篇則關注了2 種新型新煙堿類殺蟲劑氟吡呋喃酮(flupyradifurone, FPF) 和氟啶蟲胺腈(sulfoxaflor,SULF) 與DWV 的協(xié)同危害。上述研究表明噻蟲嗪雖然不能引起成年蜜蜂體內DWV 載量的上升，但其與DWV 可能產生協(xié)同作用而誘導成年工蜂的早熟覓食，并且增加了工蜂第一次飛行后不返回蜂群的風險；噻蟲胺對意蜂幼蟲體內DWV 的復制不會產生顯著的影響，但會促進成年意蜂工蜂體內DWV 滴度的上升。有關FPF 和SULF 的研究則發(fā)現(xiàn)，在實驗室條件下它們對蜜蜂體內DWV 的復制不產生明顯的影響，這表明接觸這類新型殺蟲劑并不會顯著加劇病毒對宿主生存的影響[32-35]。

5.3 蜜蜂病毒與腸道菌群的相互作用

腸道菌群參與調控宿主的免疫反應、維生素的合成和食物的消化等。蜜蜂腸道菌群的穩(wěn)態(tài)與其宿主的健康息息相關。Yongsawa 等給6日齡的中蜂幼蟲和意蜂幼蟲飼喂含有SBV 的蜂王漿24 h，檢測了SBV 對中蜂幼蟲和意蜂幼蟲腸道菌群的影響。實驗結果顯示，中蜂幼蟲感染SBV 后，其腸道菌群的破壞程度比意蜂幼蟲更嚴重。 意蜂幼蟲的核心菌種Gilliamella、 Snodgrassella 和Fructobacillus 的相對豐度都沒有發(fā)生顯著變化，而中蜂幼蟲的核心菌種Gilliamella 的相對豐度從35.5%下降至2.96%，Snodgrassella 和Fructobacillus 反而顯著增多。這表明感染SBV 病毒可以擾亂蜜蜂腸道菌群，改變腸道菌群的多樣性，并進而通過腸道菌群紊亂影響健康[36]。

6 抗病毒方法的開發(fā)

植物化學物質是蜜蜂經常接觸的一類物質，其中許多已被證明可以改善蜜蜂的健康。Edward 等人測試了香芹酚、百里香酚、對香豆酸、槲皮素和咖啡因對人工接種了IAPV 的蜜蜂的影響，發(fā)現(xiàn)咖啡因是唯一能夠顯著提高蜜蜂存活率的物質[37]。同時，另一團隊的研究也表明咖啡因能促進免疫相關基因的表達，降低蜜蜂體內DWV 病毒拷貝數(shù)[38]。這些結果表明咖啡因有可能幫助蜜蜂對抗病毒感染。而關于另一種自然界中常見的化學物質——苦杏仁苷的研究則表明飼喂該物質能使蜂群水平上的BQCV、CBPV 和DWV 滴度下降，但會導致SBV 滴度上升[39]。除了一些常見的植物化學物質，在蜜蜂飼料中添加某些能增強蜜蜂免疫力的膳食補充劑也可能是一個預防和治療蜜蜂病毒病的有效途徑。Antonio 等發(fā)現(xiàn)，1,3-1,6β-葡聚糖的攝入不僅能夠提高蜜蜂的存活率，還能降低蜜蜂體內DWV 的滴度[40]。

Fei 等發(fā)現(xiàn)DWV 的表面衣殼蛋白可作為開發(fā)針對該病毒的治療性抗體。他們對DWV表面衣殼蛋白基因的VP1、VP2 和VP3 密碼子進行了優(yōu)化，并將優(yōu)化后的基因在大腸桿菌中進行了表達和純化。然后，將免疫小鼠的抗roVP- 抗血清分別與DWV 共同孵育，并注射到健康白眼蛹內。結果發(fā)現(xiàn)，接種96 h 后，與單純病毒組相比，重組蛋白（roVP1、roVP2和roVP3） 的特異性抗體可以顯著性降低白眼蛹中的DWV 病毒滴度[41]。

腸道菌群與其宿主的健康和免疫有著密切的聯(lián)系，是宿主正常發(fā)育和健康生活不可或缺的參與者。Leonard 等發(fā)現(xiàn)將含有目的基因的質粒導入蜜蜂腸道內β- 變形綱的一種核心菌種Snodgrassella alvi 內，這種經過基因編輯后的細菌重新定殖回蜜蜂腸道后能夠連續(xù)生產dsRNA 來誘導蜜蜂的RNAi 反應，抑制蜜蜂體內DWV 的復制。同時，當?shù)宜雇唑纳鄯鋾r，它們以蜜蜂脂肪體為食，并攝取存在于該組織中的dsRNA，從而觸發(fā)自身的RNAi 反應，進而保護蜜蜂免受蜂螨的侵襲，減少蜜蜂體內DWV 的復制，提高蜜蜂的存活率。該研究創(chuàng)新性地提出通過經基因編輯后的蜜蜂腸道細菌可以抑制蜜蜂體內DWV 復制和殺蜂螨，提供了一種高效的抵抗病毒和蜂螨的方法，也為后續(xù)有關腸道菌群與病毒感染相關的研究提供了一種新思路[42]。

7 蜜蜂病毒相關的專利

與蜜蜂病毒相關的專利共有8 項，其中針對CSBV 的專利有4 項， IAPV 的有2 項，BPV 的有1 項，另外1 項專利與蜜蜂多種病毒相關。侯春生等提出丹桂、八月桂和人參花的提取物可以有效預防蜜蜂感染蜜蜂麻痹病毒。孫麗萍等提出香豆素、腺苷、脯氨酸和含有板藍根、黃樟葉、蜂膠的中藥組合物可用于制備防治CSBV 感染的藥物或飼料，能夠顯著提高感染CSBV 的中蜂幼蟲的存活率，降低病毒的拷貝數(shù)，同時還能夠誘導內源性抗菌肽的表達，提高蜜蜂的免疫力。張體銀等發(fā)明了一種蜜蜂IAPV 實時熒光RT-PCR 檢測試劑盒及其使用方法。