魯明杰，李傳博，謝丹丹，遲乃玉，岳松年，竇少華*

（1.大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116622）

淀粉酶能夠催化α-1,4糖苷鍵水解，并將淀粉分解為多種重要的物質(zhì)，如單糖、糊精等[1-3]。它主要從微生物來(lái)源生產(chǎn)，分為α，β和γ亞型，應(yīng)用十分廣泛，約占世界酶市場(chǎng)的25%～30%，在食品、制藥和洗滌等工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域中起著至關(guān)重要的作用[4-6]。

影響淀粉酶活性的因素有很多，包括溫度、pH、酶濃度、底物濃度、激活劑和抑制劑等[7-8]。目前，通過(guò)生物學(xué)科和物理學(xué)科相結(jié)合來(lái)提高淀粉酶的生產(chǎn)水平成為科學(xué)研究重點(diǎn)。經(jīng)常采用的技術(shù)手段是通過(guò)電場(chǎng)裝置向酶解體系中直接加入高頻、中頻和低頻電場(chǎng)以達(dá)到改變淀粉酶活性的目的[9]。Zeta電位被認(rèn)為是一種估計(jì)蛋白表面電位的間接工具，是維持最佳蛋白功能的關(guān)鍵物理特性[10-11]。因此，可以選擇Zeta電位作為判定蛋白表面由于各種過(guò)程而發(fā)生的變化的工具。

電場(chǎng)可以使氨基酸表面的正負(fù)電荷產(chǎn)生高頻率交替位移，從而使酶活性降低、升高。α-淀粉酶活性升高可以加速底物的分解，提高發(fā)酵工業(yè)效率；α-淀粉酶活性降低，可以有效延長(zhǎng)淀粉制品的保質(zhì)期[12]。毛霉蛋白酶經(jīng)過(guò)高頻電場(chǎng)處理后，酶活增長(zhǎng)幅度較大，有的甚至高達(dá)20%[13]。中等頻率電場(chǎng)處理果膠甲酯酶后，發(fā)現(xiàn)在0.4 V/cm電場(chǎng)強(qiáng)度下對(duì)果膠甲基酯酶活性具有顯著效果[14]。低頻電場(chǎng)輻射條件下生長(zhǎng)的釀酒酵母縮短了生長(zhǎng)遲滯期，加快了其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且其生長(zhǎng)速率相比自然生長(zhǎng)提高了14.5%[15]。由此可知，高頻和低頻電場(chǎng)可以直接作用在酶上，作用快，效果顯著，但是也有弊端，如能耗大，不夠環(huán)保。如果能夠人工合成和電場(chǎng)具有相同作用的短肽，則可以有效解決這個(gè)問(wèn)題。

人工設(shè)計(jì)短肽可以依據(jù)實(shí)際需求，利用不同氨基酸帶電性的不同，合成總電荷量不同的短肽[16]。鄧真真等[17]以經(jīng)典米氏動(dòng)力學(xué)方程為基礎(chǔ)，構(gòu)建復(fù)雜體系中酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型，從理論以及實(shí)驗(yàn)角度來(lái)全面地對(duì)體系中底物的豐度與其相應(yīng)酶促速率之間的關(guān)系進(jìn)行研究，證明復(fù)雜體系中的酶解反應(yīng)速率幾乎與底物的豐度無(wú)關(guān)。本課題組劉榮娜等[18]通過(guò)測(cè)定米氏常數(shù)（Km）和活化能（Ea）驗(yàn)證了帶電蛋白質(zhì)的加入可以提高酶與底物的親和力，增加酶的催化效率。因此，以結(jié)構(gòu)清晰的牛血清白蛋白氨基酸序列為模板，人工設(shè)計(jì)合成帶有正電荷和負(fù)電荷的兩條短肽T8-和T9+。本研究將T8-和T9+兩條短肽加入α-淀粉酶酶促反應(yīng)，并對(duì)α-淀粉酶和帶電荷短肽反應(yīng)過(guò)程各種因素進(jìn)行科學(xué)分析，在最優(yōu)測(cè)定條件下研究人工設(shè)計(jì)帶電荷短肽的加入對(duì)淀粉酶催化作用的影響，可以為酶的食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)應(yīng)用等研究提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

NaH2PO4、Na2HPO4、葡萄糖、HCl、NaOH、NaCl、可溶性淀粉、酒石酸鉀鈉、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）（分析純）：生工生物工程（上海）股份有限公司；α-淀粉酶（500～1 500 U/mg）：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；4-二甲氨基吡啶（4-dimethylaminopyridine，DMAP）、1-羥基苯并三唑（hydroxybenzotrizole，Hobt）、N,N'-二異丙基碳二亞胺（N,N'-diisopropylcarbodiimide，DIC）、wang樹(shù)脂、N,N-二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide，DMF）、巴豆酸：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-S26電熱恒溫水浴鍋：上海一恒儀器有限公司；Multiskan GO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀：賽默飛世爾科技公司；Zeta電位儀：Brookhaven Instruments Inc.。

1.3 方法

1.3.1α-淀粉酶活性的測(cè)定

采用3,5-二硝基水楊酸測(cè)定還原糖[19-20]計(jì)算α-淀粉酶活力。α-淀粉酶活力計(jì)算公式如下：

式中：C為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的葡萄糖含量，μmol；Ew為0.2 mL酶

液中含有的酶的質(zhì)量，mg；t為反應(yīng)時(shí)間，min。

α-淀粉酶活定義：將pH值為6.9，溫度為40 ℃時(shí)，每分鐘水解淀粉產(chǎn)生1.0 mg的葡萄糖所需要的α-淀粉酶量定義為一個(gè)酶活力單位（U/mg）。

1.3.2α-淀粉酶最適反應(yīng)條件的優(yōu)化

溫度對(duì)α-淀粉酶活力的影響：分別設(shè)置實(shí)驗(yàn)溫度（30℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃），加入200 μL 10-4g/mL的α-淀粉酶溶液，磷酸緩沖鹽溶液（phosphatebuffersaline，PBS）濃度0.01mol/L，緩沖液pH 6.9，測(cè)定α-淀粉酶的活力。

PBS緩沖液濃度對(duì)α-淀粉酶活力的影響：分別設(shè)置PBS緩沖液濃度（0、0.01 mol/L、0.02 mol/L、0.03 mol/L、0.05 mol/L、0.10 mol/L），加入200 μL 10-4g/mL的α-淀粉酶溶液，設(shè)置溫度40 ℃，緩沖液pH 6.9，測(cè)定α-淀粉酶的活力。

緩沖液pH對(duì)α-淀粉酶活力的影響：分別設(shè)置緩沖液pH（6.5、6.7、6.9、7.0、7.1、7.3、7.5），加入200 μL 10-4g/mL的α-淀粉酶溶液，設(shè)置溫度40 ℃，PBS緩沖液濃度0.01 mol/L，測(cè)定α-淀粉酶的活力。

1.3.3 短肽的合成

根據(jù)氨基酸的帶電性，利用多肽技術(shù)合成路線合成直線肽T8-、T9+[16，21]。

合成路線：樹(shù)脂溶脹→連接首個(gè)氨基酸→脫保護(hù)→檢測(cè)（深藍(lán)色為陽(yáng)性反應(yīng)）→第一次清洗→縮合→第二次清洗→檢測(cè)（無(wú)色為陽(yáng)性反應(yīng)）→肽鏈的延伸→肽的收縮→氨基酸側(cè)鏈脫保護(hù)→樹(shù)脂的切割→粗品肽

1.3.4 高效液相色譜分析

分別對(duì)兩條短肽進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定，分析其純度，色譜條件參考文獻(xiàn)[22]。

1.3.5 T8-和T9+對(duì)α-淀粉酶活力的影響

先將α-淀粉酶溶液稀釋為10-4g/mL，再分別加入200 μL 1 mg/mL T8-、T9+溶液，作用5 min，再按照1.3.1方法測(cè)得酶活，考察酶活變化。

依次稀釋T8-、T9+溶液濃度為10-4U/mg，10-5U/mg，10-6U/mg，10-7U/mg，10-8U/mg，取溶液200 μL加入α-淀粉酶溶液中，作用5 min，再按照1.3.1方法測(cè)得酶活，考察酶活變化。

1.3.6 米氏常數(shù)的測(cè)定

將含量為2%的淀粉溶液依次稀釋至0.25%、0.50%、1.00%和1.50%的底物濃度。分別將200 μL T8-溶液和T9+溶液加入200 μLα-淀粉酶溶液，40 ℃水浴反應(yīng)5 min，測(cè)得還原糖的產(chǎn)量。按照底物濃度和反應(yīng)速率的關(guān)系使用雙倒數(shù)法作圖[21，23]，可得到最大反應(yīng)速率（Vm）和米氏常數(shù)（Km）。

1.3.7 活化能的測(cè)定

酶能夠明顯的降低反應(yīng)所需活化能，從而加快反應(yīng)速度。溫度對(duì)反應(yīng)速度的影響，一般表現(xiàn)為隨著溫度的升高，化學(xué)反應(yīng)也隨之加快，服從Arrhenius公式[24-25]。分別在30 ℃（303 K）和40 ℃（313 K）條件下測(cè)量各自的酶促反應(yīng)速率常數(shù)。

式中：K為酶促反應(yīng)速率常數(shù)；R為摩爾氣體常數(shù)；T為熱力學(xué)

絕對(duì)溫度，K；Ea為活化能，J/mol；A為阿倫尼烏斯常數(shù)。

（1）根據(jù)直線求Ea以為X軸，log K為Y軸，依據(jù)四點(diǎn)數(shù)據(jù)，求出回歸方程Y=aX+b，最小二乘積計(jì)算出斜率a，將R值代入計(jì)算得Ea。

（2）依據(jù)兩點(diǎn)數(shù)據(jù)直接計(jì)算法，選擇在30 ℃（303 K）和40 ℃（313 K）條件下測(cè)量各自的酶促反應(yīng)速率常數(shù)K，Ea計(jì)算公式為：

1.3.8 Zeta電位的測(cè)定

分別將1.4 mLα-淀粉酶溶液、T8-溶液、T9+溶液、淀粉溶液、水加入到Zeta電位樣品池中，測(cè)得電位[26-27]。然后將α-淀粉酶溶液：T8-溶液、α-淀粉酶溶液：T9+溶液按1∶1比例混合，依次加入到Zeta電位樣品池中，測(cè)得電位。最后將α-淀粉酶溶液：T8-溶液：淀粉溶液、α-淀粉酶溶液：T9+溶液：淀粉溶液按1∶1∶1比例混合，依次加入到Zeta電位樣品池中，測(cè)得電位。

1.3.9 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 26.0和GraphPad Prism 9.0.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均進(jìn)行3次平行，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。數(shù)據(jù)分析過(guò)程中，當(dāng)P＜0.05，表示具有顯著性差異，顯著性的置信區(qū)間為95%。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適測(cè)定條件的優(yōu)化

不同濃度緩沖液、pH、溫度對(duì)α-淀粉酶酶活影響見(jiàn)圖1。

圖1 不同溫度（A）、濃度緩沖液（B）、pH值（C）對(duì)α-淀粉酶酶活影響Fig.1 Effect of different temperature (A),buffer concentrations (B),and pH (C) on α-amylase activities

由圖1A可知，隨著溫度的升高，α-淀粉酶的活性呈先增加后降低趨勢(shì)，在溫度為40 ℃時(shí)，α-淀粉酶酶活有最大值，為199.66 U/mg，說(shuō)明α-淀粉酶的最佳測(cè)定溫度為40 ℃。溫度為30～45 ℃時(shí)酶活雖然有變化，但是變化并不大，說(shuō)明在適宜溫度范圍內(nèi)，溫度對(duì)α-淀粉酶酶活有影響，但影響不大。

由圖1B可知，隨著緩沖液濃度的增加，α-淀粉酶的活性呈不斷降低趨勢(shì)，在緩沖液濃度0.01 mol/L時(shí)，α-淀粉酶酶活有最大值，為628.12 U/mg，說(shuō)明α-淀粉酶的最佳緩沖液濃度為0.01 mol/L。

由圖1C可知，隨著緩沖液pH的增加，α-淀粉酶的活性呈先增加后降低趨勢(shì)，在pH值為6.9時(shí)，α-淀粉酶酶活有最大值，為626.12 U/mg，說(shuō)明α-淀粉酶的最佳緩沖液pH值為6.9，α-淀粉酶酶活受pH值影響較大，后續(xù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)充分注意pH的影響。

2.2 短肽合成結(jié)果

人工設(shè)計(jì)合成的帶電荷短肽T9+和T8-的高效液相色譜圖見(jiàn)圖2，分析結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

表1 T9+高效液相色譜分析結(jié)果Table 1 Analysis results of high performance liquid chromatography of T9+

表2 T8-高效液相色譜分析結(jié)果Table 2 Analysis results of high performance liquid chromatography of T8-

圖2 T9+（A）及T8-（B）的高效液相色譜圖Fig.2 High performance liquid chromatogram of T9+(A) and T8-(B)

結(jié)果表明，制備的短肽T9+RKHYRQSTEFKKVHQ通過(guò)高效液相色譜儀檢測(cè)后出現(xiàn)四個(gè)峰，有三種微量雜質(zhì)，可忽略不計(jì)，第三個(gè)峰為短肽T9+，純度為98.04%，分子質(zhì)量為1 972.26，溶解性正常，符合所需實(shí)驗(yàn)要求。制備的短肽T8-YEDEFHNDQEYSETD通過(guò)高效液相色譜儀檢測(cè)后出現(xiàn)兩個(gè)峰，第二個(gè)峰為短肽T8-，純度為98.88%，分子質(zhì)量為1 920.85，溶解性正常，符合所需實(shí)驗(yàn)要求。

2.3 T8-和T9+對(duì)α-淀粉酶作用的影響

2.3.1α-淀粉酶活力

不同種類及濃度短肽對(duì)淀粉酶活力的影響見(jiàn)圖3。由圖3可知，短肽T8-和T9+質(zhì)量濃度為10-4g/mL時(shí)，加入T8-后，α-淀粉酶酶活為314.27 U/mg，與空白組（未加入短肽）酶活304.72 U/mg相比增加3.13%，加入T9+后，α-淀粉酶酶活為300.58 U/mg，與空白組酶活相比降低1.36%。說(shuō)明帶不同種電荷的短肽對(duì)α-淀粉酶酶活有相反的作用，且隨著加入T8-和T9+溶液濃度的減小，α-淀粉酶酶活變化的趨勢(shì)減小，在短肽質(zhì)量濃度為10-4g/mL時(shí)酶活影響最大，可能是由于所帶電荷的不同引起α-淀粉酶酶活發(fā)生不同的變化。總體來(lái)講，人工設(shè)計(jì)帶負(fù)電荷短肽T8-對(duì)α-淀粉酶的催化作用有正效應(yīng)，人工設(shè)計(jì)帶正電荷短肽T9+對(duì)α-淀粉酶的催化作用有負(fù)效應(yīng)。

圖3 不同種類及濃度短肽加入對(duì)酶活的影響Fig.3 Effects of adding different kinds and concentrations of short peptides on enzyme activity

2.3.2 米氏常數(shù)的測(cè)定

反應(yīng)速率由不同底物濃度下所產(chǎn)生的還原糖含量可求得，依據(jù)雙倒數(shù)作圖法，做出加入不同短肽后α-淀粉酶的米氏方程曲線，得到的α-淀粉酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表3。

表3 加入不同短肽溶液的α-淀粉酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 3 Kinetic parameters of α-amylase with different short peptides

由表3可知，加入T8-溶液，米氏常數(shù)Km升高，Vm/Km增加；加入T9+溶液，米氏常數(shù)Km值降低，Vm/Km也增加，說(shuō)明不同帶電荷短肽的加入使酶與底物的親和力發(fā)生改變[23]。

2.3.3 活化能的測(cè)定

反應(yīng)速率與活化能密切相關(guān)[8]，不同種類及濃度短肽對(duì)活化能的影響見(jiàn)圖4。由圖4可知，加入T8-和T9+后酶的活化能有明顯的改變。加入T8-后，活化能從原來(lái)的2 152.89 J/mol降低為497.44 J/mol，活化能降低，酶活升高，說(shuō)明T8-起到提高酶活性的效果。加入T9+后，活化能為4 942.90 J/mol，增加130%，說(shuō)明T9+起到降低酶活性的效果。其中，質(zhì)量濃度為10-5g/mL時(shí)，活化能改變最小，質(zhì)量濃度為10-6g/mL時(shí)，活化能改變最大，其余質(zhì)量濃度短肽對(duì)活化能的影響也非常明顯。說(shuō)明不同質(zhì)量濃度T8-和T9+的加入對(duì)活化能分別起到降低和升高活化能的作用，且影響較大。

圖4 不同種類及濃度短肽加入對(duì)活化能的影響Fig.4 Effects of adding different kinds and concentrations of shortpeptides on activation energy

2.3.4 電位變化

T8-、T9+、酶、底物淀粉溶液按比例加入后搖勻，進(jìn)行電位測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，將T8-和T9+加入到酶和底物淀粉體系后，原有體系電位值分別增加了32%和47%，說(shuō)明T8-和T9+的加入，影響了α-淀粉酶的酶促反應(yīng)，從而影響了Zeta電位，也說(shuō)明可將電位的變化作為觀察酶性質(zhì)的一個(gè)指標(biāo)。

表4 不同物質(zhì)的Zeta電位Table 4 Zeta potential of different substances

續(xù)表

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用多肽固相合成法合成帶電荷短肽T8-和T9+，并探討其對(duì)α-淀粉酶的活性、米氏常數(shù)（Km）、活化能和Zeta電位的影響。T8-使α-淀粉酶體系活化能降低，反應(yīng)易發(fā)生，可作為激活劑應(yīng)用在食品發(fā)酵中提高發(fā)酵速率。T9+使α-淀粉酶體系活化能升高，反應(yīng)難發(fā)生，可作為抑制劑應(yīng)用在食品貯藏中延遲腐敗速率。人工設(shè)計(jì)的短肽，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，組分單一，能耗小成本低，危害性低，將其應(yīng)用在食品生產(chǎn)、發(fā)酵、釀造以及紡織工業(yè)具有極大的創(chuàng)新意義和應(yīng)用價(jià)值。因此，可以進(jìn)一步驗(yàn)證酶與底物的催化作用和短肽表面所帶電荷的相關(guān)性，為增加或降低酶的活化能提供有力支撐。