氟維司群細菌內(nèi)毒素檢查方法學研究

王以云 王秀艷 段春艷

摘要：目的：建立氟維司群細菌內(nèi)毒素檢查方法。方法：按照《中華人民共和國藥典》2020版四部通則1143細菌內(nèi)毒素凝膠檢查法的要求，采用兩個廠家的鱟試劑進行細菌內(nèi)毒素干擾試驗，并對樣品進行細菌內(nèi)毒素檢查。結(jié)果：氟維司群用細菌內(nèi)毒素檢查用水和二甲基亞砜溶解成10mg·ml-1的溶液稀釋至80倍時，對細菌內(nèi)毒素檢查無干擾。結(jié)論：可采用此法對氟維司群的細菌內(nèi)毒素進行檢查。

關鍵詞：氟維司群;細菌內(nèi)毒素;凝膠法;干擾試驗

內(nèi)毒素是革蘭陰性細菌細胞壁脂多糖，極微量（1ng/kg）的內(nèi)毒素進入人體即可引起發(fā)熱反應。大劑量的內(nèi)毒素可引起機體發(fā)生內(nèi)毒素休克、彌散性血管內(nèi)凝血、多器官衰竭等反應，甚至導致死亡。故注射劑中內(nèi)毒素內(nèi)毒素含量應嚴格控制，生產(chǎn)注射劑所使用的原料中內(nèi)毒素的含量也應進行控制，以保證注射劑的安全性。

氟維司群是一種抗腫瘤藥，屬于競爭性雌激素受體拮抗劑，可阻斷雌激素的作用而本身沒有激動受體作用。主要用于絕經(jīng)后（包括自然絕經(jīng)和人工絕經(jīng)）婦女在抗雌激素輔助治療后或過程中復發(fā)、或在抗刺激素治療期間疾病進展的雌激素受體陽性的局部晚期或轉(zhuǎn)移性乳腺癌。本研究對氟維司群細菌內(nèi)毒素檢查的可行性進行方法學研究，為該原料質(zhì)量標準中制定細菌內(nèi)毒素檢查提供依據(jù)。

1、儀器與材料

1.1實驗材料

鱟試劑，靈敏度為0.06EU·ml-1，規(guī)格：0.1ml，批號2003252，湛江安度斯生物有限公司，批號19090412，福州新北生化工業(yè)有限公司;細菌內(nèi)毒素工作標準品，效價9000EU·支-1，批號150800-201601，廠家中國食品藥品檢定研究院;細菌內(nèi)毒素檢查用水50ml·瓶-1，批號：1910100，湛江安度斯生物有限公司;二甲基亞砜，批號200227，西隴科學股份有限公司。

1.2儀器

GZX-9246MBE電熱恒溫干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠），XW-80A型漩渦混合器（上海滬西分析儀器廠有限公司），HH-8型恒溫水浴鍋（上海梅香儀器有限公司），XSR204型萬分之一天平（梅特勒-托利多），移液器（賽托利斯）。

1.3樣品

氟維司群，批號：633200201、633200301、633200302，山東新時代藥業(yè)有限公司。

2、方法與結(jié)果

2.1菌內(nèi)毒素限值的確定

根據(jù)企業(yè)內(nèi)控標準，確定原輔料的細菌內(nèi)毒素限值（總細菌內(nèi)毒素之和小于制劑限度）。質(zhì)量標準規(guī)定：每1mg氟維司群中含內(nèi)毒素的量應小于0.5EU·mg-1。

2.2鱟試劑靈敏度復核

按照《中華人民共和國藥典》2020版四部通則1143細菌內(nèi)毒素檢查法規(guī)定，進行鱟試劑靈敏度復核，結(jié)果見表1。兩批鱟試劑經(jīng)用細菌內(nèi)毒素國家標準品檢查，λc與λ均一致，結(jié)果均復核規(guī)定。

2.3最大有效稀釋倍數(shù)的計算

氟維司群供試品溶液的配制：稱取供試品100mg，加入1mlBET水，再加入9ml的二甲基亞砜，混勻溶解既得C=10mg·ml-1的供試品溶液。

最大有效稀釋倍數(shù)（Maximum valid dilution，MVD）MVD= CL/λ為根據(jù)，C為供試品溶液濃度10mg·ml-1，L為細菌內(nèi)毒素限值0.5EU·mg-1，λ為鱟試劑的靈敏度0.06EU·ml-1，則MVD=83倍。

2.4干擾實驗

按照《中華人民共和國藥典》2020版四部通則1143細菌內(nèi)毒素檢查法，用兩個廠家標示靈敏度為0.06EU·ml-1的鱟試劑進行干擾試驗。根據(jù)數(shù)據(jù)計算MVD=83倍，方便樣品的稀釋及干擾實驗標準內(nèi)毒素的加入，選擇80倍進行干擾試驗。

稱取供試品100mg，共稱取四份，每份分別加入1ml含100EU/ml、50EU/ml、25EU/ml、12.5EU/ml標準內(nèi)毒素溶液，每份再分別加入9ml的二甲基亞砜，溶解混勻后每份溶液用細菌內(nèi)毒素檢查用水依次稀釋10倍、20倍、40倍、80倍制成含內(nèi)毒素濃度為0.125、0.06、0.03、0.015EU·ml-1的供試品溶液。每份供試液稀釋10倍時產(chǎn)生絮狀沉淀，靜置沉淀取水相進行下一步稀釋。

用細菌內(nèi)毒素檢查用水將細菌內(nèi)毒素工作標準品制成濃度為0.125、0.06、0.03、0.015EU·ml-1的內(nèi)毒素標準溶液;同時進行陰性對照。根據(jù)公式antilg（∑X/4）分別計算出內(nèi)毒素標準溶液和含供試品的內(nèi)毒素溶液的反應終點濃度的幾何平均值，試驗結(jié)果見表2。

從以上干擾結(jié)果，內(nèi)毒素標準溶液的反應終點濃度的幾何平均值均在0.5λ～2λ之間，含供試品的內(nèi)毒素溶液的反應終點濃度的幾何平均值均在0.5λ～2λ之間，80倍供試液對鱟試劑與細菌內(nèi)毒素反應無干擾作用。

2.5供試品內(nèi)毒素檢測結(jié)果

將三批供試品分別稱取100mg，加入1ml細菌內(nèi)毒素檢查用水，再加入9ml的二甲基亞砜，溶解混勻后用細菌內(nèi)毒素檢查用水依次稀釋10倍、20倍、40倍、80倍制成供試品溶液;供試液稀釋10倍時產(chǎn)生絮狀沉淀，靜置沉淀取水相進行下一步稀釋。按照《中華人民共和國藥典》2020版四部通則1143細菌內(nèi)毒素檢查法，進行細菌內(nèi)毒素檢查，結(jié)果見表3。三批供試品細菌內(nèi)毒素均符合規(guī)定，即內(nèi)毒素含量小于0.5EU·mg-1。

3、討論

細菌內(nèi)毒素隨注射劑進入人體血液所導致的“熱源反應”是注射劑臨床應用中發(fā)生率較高的不良反應，細菌內(nèi)毒素是注射劑質(zhì)量檢查的重要項目。氟維司群作為注射劑原料，從生產(chǎn)源頭控制細菌內(nèi)毒素。本文按照《中華人民共和國藥典》2020版四部通則1143“細菌內(nèi)毒素檢查法—凝膠法”進行細菌內(nèi)毒素檢查法研究，結(jié)果表明氟維司群用溶劑溶解混勻后，稀釋80倍時對細菌內(nèi)毒素檢查無干擾作用，可在大于或等于此稀釋倍數(shù)下采用凝膠法進行氟維司群的細菌內(nèi)毒素檢查，從而控制供試品的內(nèi)毒素含量在限值范圍內(nèi)，保證產(chǎn)品質(zhì)量，確?；颊哂盟幇踩?。

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