陳向東 王宗繼 徐麗 杜廣青 胡靖敏 王永紅

1.目的

蛋白質(zhì)是代謝反應中的功能執(zhí)行者，直接催化反應的發(fā)生，而不同代謝狀態(tài)下蛋白的表達及活性都有不同程度的差異，通過不同狀態(tài)下蛋白表達的差異來反映代謝途徑的改變。細胞破碎和蛋白質(zhì)提取是獲得蛋白質(zhì)提取量的關鍵，目前凝結(jié)芽孢桿菌細胞破碎和蛋白提取的研究比較少，因此將建立凝結(jié)芽孢桿菌細胞破碎和蛋白質(zhì)提取的方法。

2.材料與方法

2.1實驗材料

2.1.1實驗試劑

蛋白提取緩沖液見表2.1，SDS-PAGE 分離膠和濃縮膠配方見表2.2和表2.3，脫色液見表2.4，SDS上樣緩沖液見表2.5，考馬斯亮藍染色液見表2.6。蛋白定量采用BCA法蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒，生工生物工程（上海）股份有限公司。

2.1.2實驗儀器與設備

2.2實驗方法

2.2.1細胞破碎方法

凍干后液氮研磨：保存于-80 ℃冰箱中的菌體樣品先于凍干機中凍干至少24 h，之后，將凍干后的菌體置于預冷過的研缽中同時加入液氮一起研磨，液氮研磨時間為10 min，研磨成粉末狀之后加入到裂解液中，6000 rpm 離心30 min 后取上清。

凍融法：保存于-80 ℃冰箱中的樣品重懸于裂解液中，將樣品于-80 ℃冰箱冷凍10min 中，之后于95 ℃煮10 min，重復以上步驟3-5 次，6000 rpm 離心30 min 后取上清。

超聲裂解法：保存于-80 ℃冰箱中的菌體樣品重懸于裂解液中，超聲破碎儀使用3 mm微探頭，功率設置為650 W×55%，超聲5 秒，停5 秒，如此反復多次，整個過程要確保在冰上進行且持續(xù)20 min 左右，6000 rpm，30 min 后保留上清。

冷凍破碎法：保存于-80 ℃冰箱中的菌體樣品重懸于裂解液中，加入0.5g磁力玻璃珠，于全自動樣品冷凍研磨儀，65Hz，10min。將破碎完的菌體離心，6000 rpm 離心30min 后取上清。

2.2.2蛋白濃度測定

計算BCA工作液總體積：BCA工作液總體積=（標準曲線測定點數(shù)+樣品數(shù)）×重復次數(shù)×每個樣品所需的BCA工作也體積;根據(jù)所需BCA工作液總體積，定量取溶液A：溶液B=50：1，混勻制成BCA工作液;按照表2.8制備BCA標準曲線。

采用酶標板法，向酶標孔中分別加入5μL不同濃度的標準蛋白溶液;每個標準品設置2個重復，各孔分別加入5μL溶液F，37℃水浴中保溫30min，隨后個加入200μL BCA工作液，迅速混勻，在37℃水浴中保溫30min.冷卻至室溫后，在酶標儀上測各孔的A562值。以各孔A562平均值為縱坐標，對應的蛋白質(zhì)濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

3.結(jié)果

3.1蛋白濃度標準曲線

以BSA（牛血清蛋白）濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制BCA標準曲線見圖3.1，相關系數(shù)R2為0.9941。

3.2蛋白提取方法篩選

3.2.1細胞破碎方法篩選

細胞破碎方法分別選用了凍融法、冷凍破碎法、超聲破碎法和凍干后液氮研磨法。根據(jù)圖3.2，鏡檢結(jié)果顯示經(jīng)過凍融法破碎后凝結(jié)芽孢桿菌形態(tài)變化不大;使用玻璃珠冷凍破碎和凍干后液氮研磨可打碎部分桿菌，桿菌形態(tài)長短不一，破碎不均勻;使用3 mm微探頭，功率650 W×55%，超聲20min后菌體形態(tài)呈現(xiàn)均勻的短桿狀。

為了進一步探究細胞破碎的效果，比較了四種破碎方法提取的蛋白濃度差異并結(jié)合SDS-PAGE結(jié)果進行分析。從提取的蛋白濃度來看，凍干后液氮研磨>冷凍破碎>超聲破碎>凍融法（表3.1），結(jié)合相應的電泳圖（圖3.3），凍干后液氮研磨提取的蛋白種類最多。盡管，超聲破碎后得到均勻的短桿狀，由于超聲過程中不可避免有產(chǎn)熱以及大量泡沫，最終都會影響蛋白提取效果。綜上所述，最終選擇凍干后液氮研磨法進行細胞破碎進行后續(xù)實驗。

3.2.2蛋白提取緩沖液成分及用量優(yōu)化

3.2.1.1不同蛋白提取緩沖液篩選

在細胞破碎方法為凍干后液氮研磨的條件下，比較了不同緩沖液的提取效果，采用Tris-HCl pH6.7，2%SDS，蛋白裂解液（0.1M Tris-HCl pH 7.6、2%SDS、0.1M DTT、1mM PMSF）進行蛋白提取。結(jié)果表明，蛋白裂解液提取的蛋白量大（表3.2），SDS-PAGE電泳圖的條帶數(shù)也比另外兩種緩沖液多（圖3.4）。

3.2.1.2蛋白裂解液用量篩選

蛋白裂解液分別調(diào)整SDS為2%、4%，DTT為0.1M、0.2M，20mg（菌粉）分別加入裂解液用量1mL、2mL、4mL進行對比（表3.3）。根據(jù)蛋白濃度測定結(jié)果，比較裂解液1和3，2和4發(fā)現(xiàn)，SDS調(diào)整為2%時，蛋白提取濃度以及種類更多;而DTT用量的改變并沒有影響蛋白提取的效果;裂解液的用量增加到2mL時，蛋白提取效果更好，進一步將裂解液用量增加至4mL后，蛋白的提取效果沒有進一步提高（表3.4、圖3.5）。最終確定蛋白裂解液的配方為0.1M Tris-HCl pH 7.6、2%SDS、0.1M DTT、1mM PMSF，用量為2mL。

作者簡介：陳向東（一作），漢族，男，山東省臨沂市，1980.06.05，本科，工程師，山東衛(wèi)康生物醫(yī)藥科技有限公司，食品工程。