穆玉珍，朱美瑤

（重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶沙坪壩 401331）

蘭科植物種類繁多，約有700 屬20000 種，分布遼闊，多生于溫帶和亞熱帶地區(qū)。其姿態(tài)優(yōu)美，花色淡雅，花香清幽，被譽(yù)為“花中君子”，再加上歷來文人墨客吟詩作賦，賦予了蘭花高潔傲岸的文化形象，使得蘭花頗受人們喜愛，具有極大的觀賞價(jià)值，同時(shí)也具備一定的商業(yè)價(jià)值。此外，部分蘭科植物也可入藥，有著極高藥用價(jià)值。然而在自然條件下，蘭花生長周期過長，且其無性和有性繁殖存在許多困難，因此很難進(jìn)行大量繁殖和生產(chǎn)。近年來隨著社會的發(fā)展和人們生活水平的提高，人們對蘭花這類觀賞植物的需求也日益增大，而傳統(tǒng)的蘭花繁殖與生產(chǎn)方式難以滿足需求。蘭花組織培養(yǎng)技術(shù)能夠縮短培養(yǎng)周期，提高繁殖系數(shù)，不受季節(jié)影響，同時(shí)降低了生產(chǎn)成本，可以在短時(shí)間內(nèi)通過無性繁殖大量生產(chǎn)蘭花。

目前的研究對象多集中在蝴蝶蘭、蕙蘭、春蘭、墨蘭、君子蘭、建蘭等，學(xué)者們就外植體的選擇、培養(yǎng)基配方、褐化現(xiàn)象等進(jìn)行了深入研究，為工業(yè)化生產(chǎn)和保護(hù)瀕危種類奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

1 外植體的選擇

目前，對蘭科植物組織培養(yǎng)的研究，選擇的外植體多為某些特定部位，具有一定的局限性。通過對蘭花不同外植體的研究，能夠擴(kuò)大蘭花組織培養(yǎng)的材料范圍，減少對母株的傷害。蘭花的種子、葉片、根尖、花梗、莖尖、子房、花萼、花絲等都可作為外植體。蘭科植物的種類、外植體的選擇不同，試驗(yàn)結(jié)果會存在一定的差異。

1.1 種子

蘭花蒴果中的種子數(shù)量眾多，但種子細(xì)小，胚發(fā)育不完整且無胚乳，種皮結(jié)構(gòu)致密，在自然環(huán)境下不易萌發(fā)。種子的非共生萌發(fā)是生產(chǎn)蘭花雜交花苗的重要方式，具有廣闊的研究前景，同時(shí)也是一個(gè)技術(shù)難點(diǎn)。Bernared[1]早在1909 年，將卡特蘭（Cattleya）與雷麗蘭（Laelia）的雜交種子接種到培養(yǎng)基中，成功進(jìn)行了非共生萌發(fā)，開創(chuàng)了非共生萌發(fā)的先例。種子非共生萌發(fā)的試驗(yàn)體系也在不斷的試驗(yàn)研究中逐漸形成。試驗(yàn)中通常取蒴果進(jìn)行消毒，在無菌條件下剖開蒴果，取出種子播種到培養(yǎng)瓶中。不同時(shí)期的蒴果萌發(fā)率不同。有試驗(yàn)表明，春蘭種子作為外植體時(shí)，授粉后8～9 個(gè)月的種子萌發(fā)率較高，而墨蘭的種子在3～5 個(gè)月時(shí)容易萌發(fā)[2-3]。預(yù)處理也可以提高種子的萌發(fā)率，研究者對種子進(jìn)行1min 的超聲波處理，種子萌發(fā)率達(dá)到20%；用蝸牛酶處理2～3min，種子萌發(fā)率可達(dá)70%以上[4]。

1.2 葉片

葉片也可作為組織培養(yǎng)的材料，其取材對母株的傷害不大，受季節(jié)影響較小。一般選取試管苗幼嫩的葉片，其更容易誘導(dǎo)原球莖，而成熟植株的葉片誘導(dǎo)成功的研究較少，多發(fā)生褐化死亡。楊美純等[5]研究發(fā)現(xiàn)，葉片正面向上放置時(shí)，誘導(dǎo)率更高，且對葉片進(jìn)行切割，更利于切割邊緣誘導(dǎo)出原球莖，切塊應(yīng)大于0.5cm×0.5cm，否則容易褐化死亡。

1.3 花梗

花梗常作為外植體材料，在多種蘭科植物中皆有運(yùn)用，如蝴蝶蘭、大花蕙蘭、文心蘭等，國蘭以花梗作為外植體的研究較少，多集中在種子、莖。通過對石斛蘭的研究發(fā)現(xiàn)，用帶有節(jié)間的花梗進(jìn)行誘導(dǎo)，會出現(xiàn)大部分死亡，從而使誘導(dǎo)效率較低[6]?；ü５娜〔氖艿郊竟?jié)影響，通常不同時(shí)期的花梗誘導(dǎo)率也不同。有試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，開花后的花梗比開花前幼嫩的花梗更容易誘導(dǎo)出芽[7]。具體的原理還有待探究。

1.4 莖尖

莖尖是最早用于蘭花組織培養(yǎng)的外植體，早在1960 年，Morel[8]采用大花蕙蘭的莖尖，誘導(dǎo)分化出了植株。但莖尖的切取會對母株造成較大傷害，而且在莖尖的培養(yǎng)中，容易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象[9]。莖尖多選用幼嫩的部分作為材料，其細(xì)胞分裂旺盛，是組織培養(yǎng)的重要材料。同時(shí)莖尖的大小、部位也是重要影響因素，一般認(rèn)為帶有1～2 葉原基的莖圓錐成活率高，中間部位的側(cè)芽成活率高。莖尖的誘導(dǎo)率也與接種方式有關(guān)。在對文心蘭的研究中發(fā)現(xiàn)，莖尖豎直接種誘導(dǎo)率更高[10]。

1.5 其他外植體

根尖也能用于組織培養(yǎng)，洋蘭中有成功的案例，但國蘭的報(bào)道較少?；ńz也可作為外植體，其不易染菌，材料易得，一般選取未綻放的花蕾進(jìn)行消毒處理。邢桂梅等[11]成功用君子蘭的花絲誘導(dǎo)出愈傷組織，并發(fā)現(xiàn)活性炭對花絲愈傷組織的誘導(dǎo)和分化有抑制作用。

2 消毒方式

消毒是否徹底將直接影響試驗(yàn)的成功率，通常用到的消毒試劑有酒精、升汞、次氯酸鈉、過氧化氫等。升汞為劇毒物質(zhì)，次氯酸鈉具有氧化性且無毒，可代替升汞，但升汞的消毒效果優(yōu)于次氯酸鈉。高壯壯等[12]將蝴蝶蘭花梗用2%過氧化氫消毒10min，再用10%次氯酸鈉消毒15min，達(dá)到的效果與0.1%升汞消毒效果無明顯差異，以此方式代替升汞消毒具有重要意義。在消毒過程中，消毒劑的濃度、消毒的時(shí)間以及外植體的保存時(shí)間等，都會直接影響外植體的消毒效果。一般用75%的酒精消毒30～45s，0.1%的升汞消毒5～8min，10%的次氯酸鈉消毒20min[13]。有試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，外植體現(xiàn)取現(xiàn)用時(shí)污染率最小，隨著時(shí)間增加，污染率增加，當(dāng)保存時(shí)間超過7d 時(shí)，污染率最大，達(dá)到100%[14]。不同的外植體的消毒方式有所差異。種子一般選用蒴果進(jìn)行消毒處理，若選用種子直接進(jìn)行消毒，則不可用75%酒精消毒，可選用2%次氯酸鈉溶液消毒6min[15]?；ü?、莖等消毒完畢后，需將其與消毒劑接觸部分切除，所以消毒前外植體要切取足夠的體積。

3 防止褐化的方法

褐化是在組織培養(yǎng)過程中，外植體中的酚類物質(zhì)被氧化成了褐色的醌類物質(zhì)，抑制了其他酶的活性，從而導(dǎo)致外植體發(fā)生褐變死亡的現(xiàn)象。褐化與多種因素有關(guān)，如外植體的選擇、取材時(shí)間、大小、生理狀態(tài)，培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件以及試驗(yàn)預(yù)處理等。研究發(fā)現(xiàn)，蝴蝶蘭帶腋芽的花梗要比不帶腋芽的褐化程度低，花梗的褐化程度低于花萼[16-17]。一般認(rèn)為處于生長旺盛期的外植體，其褐化程度更小。與PVP 相比，活性炭是非專一吸附劑，不僅會吸附酚類物質(zhì)，還會吸附其它植物組織生長所需要的物質(zhì)，因此會影響外植體生長和誘導(dǎo)，而PVP 也因不同外植體產(chǎn)生的酚類物質(zhì)有所差異，而效果不同。通過對蝴蝶蘭的研究表明，在含有1%Vc溶液培養(yǎng)皿中，切取莖尖，再將莖尖接種到含有0.2%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）的培養(yǎng)基中，可以減少褐化發(fā)生[7]。研究發(fā)現(xiàn)，活性炭抑制褐化效果較Vc 高[18]。熱激處理也可以減小褐化程度。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，40℃熱激9min，并結(jié)合0.1%水楊酸處理，能有效抑制蝴蝶蘭的褐化[19]。在初期培養(yǎng)中，進(jìn)行一段時(shí)間的暗培養(yǎng)，能降低褐化率，但時(shí)間過長會影響生長。在對春蘭褐化的防控中，發(fā)現(xiàn)暗培養(yǎng)10d 的褐化率最低，暗培養(yǎng)20、30d的褐化率迅速升高[17]。當(dāng)外植體發(fā)生褐化后，可切除褐化部分，將健康部分轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)基中，以防止褐化。

4 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

在國內(nèi)學(xué)者的研究中，蘭花組織培養(yǎng)所采用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基一般為MS 和VW，其中VW 培養(yǎng)基一般用于培養(yǎng)氣生蘭花。例如，有試驗(yàn)證明，最適宜蝴蝶蘭花梗生長的培養(yǎng)基配方為MS 培養(yǎng)基，而適宜蝴蝶蘭根培養(yǎng)的培養(yǎng)基為1/2 MS 培養(yǎng)基[20]。在君子蘭的培養(yǎng)過程中，誘導(dǎo)生根多用1/2 MS 培養(yǎng)基，誘導(dǎo)四倍體形成和愈傷組織形成多用MS 培養(yǎng)基[21]。在墨蘭以胚誘導(dǎo)原球莖的形成過程中，1/2 MS 的效果最好，在花芽和莖尖誘導(dǎo)原球莖形成的過程中，以MS 培養(yǎng)基培養(yǎng)效果最佳[3]。還有學(xué)者通過正交試驗(yàn)得出MS 對墨蘭根狀莖分化率的影響顯著，當(dāng)MS 含量由小到大逐漸增加時(shí)，對墨蘭根狀莖分化率的影響效果為先減小后增大[22]。

5 植物生長調(diào)節(jié)劑

植物生長調(diào)節(jié)劑可影響和有效調(diào)控植物的生長和發(fā)育，一般由人工合成的或從微生物中提取，其生理和生物學(xué)效應(yīng)與植物激素相似，在蘭花的組織培養(yǎng)中有著重要作用。在蘭花組織培養(yǎng)中，常用的植物生長調(diào)節(jié)劑有6-BA、NAA、2，4-D、IAA，不同種類、不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑對蘭花的生長和誘導(dǎo)會起到不同的作用。有試驗(yàn)表明：6-BA 對蝴蝶蘭花梗腋芽的萌發(fā)具有明顯的促進(jìn)作用，且在一定濃度范圍內(nèi)，隨著6-BA 濃度的升高，花梗側(cè)芽分化率逐漸提高[23]。而在胚誘導(dǎo)原球莖試驗(yàn)中，6-BA 的濃度低于0.5mg/L 時(shí)對胚萌發(fā)無明顯影響，高于0.5mg/L 時(shí)起抑制作用；NAA 濃度在低于0.5mg/L 時(shí)隨著濃度的增加對胚萌發(fā)的促進(jìn)作用逐步增強(qiáng)，超過這個(gè)濃度也會起抑制作用[3]。在墨蘭種子無菌萌發(fā)的正交試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，R（NAA）＞R（6-BA）＞R（MS），即NAA 對墨蘭種子發(fā)芽率的影響效果最大，6-BA 次之，MS 最小[22]。也有試驗(yàn)表明，2，4-D 在愈傷組織的形成及分化方面有積極作用，NAA 在擬原球莖分化方面也有重要的作用[24]。在關(guān)于文心蘭的有關(guān)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加TDZ 有利于誘導(dǎo)花梗芽轉(zhuǎn)化為營養(yǎng)芽[25]。

6 天然植物成分

在蘭花的組織培養(yǎng)中還可選擇性地添加一些天然植物組織成分，如香蕉泥、馬鈴薯勻漿、椰乳等，對蘭花的生長也能起到促進(jìn)作用。有試驗(yàn)表明：在培養(yǎng)基中添加10%香蕉汁液較適合大花蕙蘭組培苗的誘導(dǎo)生根[26]。在大花蕙蘭原球莖增殖及芽苗分化試驗(yàn)中，香蕉泥促進(jìn)效果最好[9]。在蝴蝶蘭組織培養(yǎng)體系的研究中發(fā)現(xiàn)，添加土豆泥或香蕉泥的培養(yǎng)基分化、生長狀況均較好，分化率都可達(dá)到90%以上[23]。

7 展望與討論

植物組織培養(yǎng)技術(shù)是目前發(fā)展較為成熟的現(xiàn)代生物技術(shù)之一，也是重要的基礎(chǔ)研究手段之一。蘭科植物生長周期長，在自然環(huán)境中繁殖慢，運(yùn)用組織培養(yǎng)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)蘭科植物的快速繁殖，以滿足市場所需。此外，在蘭花組織培養(yǎng)過程中，產(chǎn)生的次生代謝物有藥用價(jià)值。如君子蘭中含有的抗病毒和抗癌的物質(zhì)，這些物質(zhì)無法在體外合成，次生代謝產(chǎn)物的研究也是組織培養(yǎng)的重要方向。種子的無菌萌發(fā)也有重要意義，是雜交品種培育的唯一方式，為蘭花優(yōu)良性狀的選擇提供了技術(shù)基礎(chǔ)。蘭花的組織培養(yǎng)加快了蘭花的工業(yè)化生產(chǎn)，為基因轉(zhuǎn)化提供了材料，為保護(hù)珍稀品種奠定基礎(chǔ)。但蘭花組織培養(yǎng)在實(shí)際的操作中仍存在不少難題，如組織培養(yǎng)過程中褐化、次生代謝物的污染、染菌等問題，都會給蘭花組織的生長以及誘導(dǎo)分化造成不利影響，因此，蘭花組織培養(yǎng)體系與流程仍需進(jìn)一步探索與完善。目前生物科學(xué)發(fā)展較為迅速，可結(jié)合生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等，在蘭花的組織培養(yǎng)方面進(jìn)行更為深入的研究?？傊m花組織培養(yǎng)技術(shù)有廣闊的發(fā)展前景及較高的實(shí)用價(jià)值。