基因工程技術(shù)在基因治療中的應(yīng)用進(jìn)展

劉婷婷 綜述 張殿寶 審校

1.營(yíng)口經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)中心醫(yī)院(營(yíng)口市第六人民醫(yī)院)，遼寧 營(yíng)口 115007；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽 110122

基因治療是指將外源正?；?qū)塍w內(nèi)，糾正基因缺陷引起的疾病以達(dá)到治療目的。1972年，費(fèi)里德曼提出基因療法用于治療人類遺傳性疾病的設(shè)想[1]。然而，1990年，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院首次開展基因治療的臨床研究?；蛑委熥畛跤糜趩位蜻z傳性疾病的治療，隨著技術(shù)發(fā)展，擴(kuò)展到癌癥、慢性疾病、神經(jīng)退行性疾病和代謝紊亂性疾病的治療[2]。理想的載體是基因治療的關(guān)鍵，病毒載體感染細(xì)胞效率較高，能夠整合宿主細(xì)胞基因組，是基因治療常用的遞送系統(tǒng)。經(jīng)過半個(gè)世紀(jì)的發(fā)展，結(jié)合了基因工程技術(shù)的基因治療策略得到了優(yōu)化。與細(xì)胞免疫技術(shù)結(jié)合，增強(qiáng)T細(xì)胞抗腫瘤的能力；與基因編輯技術(shù)結(jié)合，精準(zhǔn)修復(fù)缺陷基因，治療疾病[3]。本文將根據(jù)基因治療所涉及的基因工程技術(shù)為主線，闡述基因治療在臨床及臨床試驗(yàn)中的研究進(jìn)展。

1 病毒載體技術(shù)

病毒載體是最早應(yīng)用于基因治療研究的工具。病毒載體介導(dǎo)的基因?qū)敕椒ㄓ袃煞N：體外轉(zhuǎn)移和活體直接轉(zhuǎn)移。病毒載體分為整合型和非整合型。整合型病毒載體通過體外轉(zhuǎn)移用于體外基因治療，而非整合型病毒載體通過活體直接轉(zhuǎn)移用于體內(nèi)基因治療。目前，應(yīng)用于基因治療較常見的整合型病毒載體包括γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和慢病毒載體，而非整合型病毒載體為腺相關(guān)病毒載體(adeno-associated virus，AAV)。本文通過病毒載體導(dǎo)入的方法探討其在基因治療中的應(yīng)用。

1.1 體外基因治療 20世紀(jì)末，γ-逆轉(zhuǎn)錄毒載體首先用于造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells，HSCs)的基因?qū)隱4]。1990年，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(food and drug administration，F(xiàn)DA)監(jiān)督了美國(guó)首例人體基因治療試驗(yàn)，該試驗(yàn)利用γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)HSCs治療患有腺苷脫氨酶缺乏性重度聯(lián)合免疫缺陷癥的兒童，2例患兒接受治療后臨床表現(xiàn)良好，生長(zhǎng)發(fā)育正常[5]。2000年，法國(guó)內(nèi)克爾醫(yī)院研究人員利用γ-逆轉(zhuǎn)錄毒感染HSCs治療X-連鎖重癥聯(lián)合免疫缺陷癥患者。10 例患者中有9 例治療成功，然而有4 例患者經(jīng)過31～68 個(gè)月的治療后發(fā)展成T 細(xì)胞白血病，原因是外源基因在基因組中的隨機(jī)插入激活了癌基因的表達(dá)[6]。γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體插入突變的安全性問題給基因治療帶來了巨大的挑戰(zhàn)。

在基因治療中，慢病毒載體比γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體更有優(yōu)勢(shì)。慢病毒介導(dǎo)外源基因整合入5'-非編碼區(qū)，降低致癌風(fēng)險(xiǎn)；慢病毒可以感染非分裂細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率高，并且可以攜帶更大、更復(fù)雜的外源基因片段。因此，慢病毒載體目前是大多數(shù)HSCs 編輯的首選工具。慢病毒載體靶向HSCs在遺傳性神經(jīng)疾病、β地中海貧血等疾病的治療中顯現(xiàn)了較好的效果[7]。X-連鎖腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良癥是一種嚴(yán)重的男孩大腦脫髓鞘疾病，該疾病是由于腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良蛋白(一種由ABCD1基因編碼的三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)缺乏引起。X-連鎖腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良癥患者經(jīng)過骨髓清除治療后，輸注慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的HSCs，14～16個(gè)月后2例患者的進(jìn)行性腦脫髓鞘停止，表明慢病毒載體靶向HSCs可為腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良提供臨床療效[8]。此外，β地中海貧血是世界上最常見的單基因疾病，其發(fā)病機(jī)制是基因突變?cè)斐搔?珠蛋白合成減少，最終導(dǎo)致溶血性貧血。首個(gè)成功的β地中海貧血基因治療試驗(yàn)是利用編碼β-珠蛋白的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)自體HSCs，經(jīng)治療后患者不依賴輸血長(zhǎng)達(dá)33 個(gè)月，且有穩(wěn)定的血紅蛋白生成[9]。目前，β地中海貧血基因療法Zynteglo已在歐洲上市。如何優(yōu)化載體的設(shè)計(jì)和生產(chǎn)工藝，提高載體有效轉(zhuǎn)導(dǎo)、靶向遞送和受控基因表達(dá)仍面臨挑戰(zhàn)。

1.2 體內(nèi)基因治療 AAV 是一類天然復(fù)制缺陷的非致病、無包膜的細(xì)小病毒。AAV 具有低免疫原性、低致病性、宿主范圍廣泛以及穩(wěn)定表達(dá)等優(yōu)勢(shì)，是最有潛力的基因治療載體之一，并已廣泛地應(yīng)用于臨床研究。2004年，中國(guó)最先將基因治療藥物Gendicine引入市場(chǎng)。Gendicine 通過AAV 攜帶p53 基因治療頭頸部鱗癌，可是該藥物的治療效果存在爭(zhēng)議。2012年，歐洲藥品管理局(European medicines agency，EMA)批準(zhǔn)了首款基因治療藥物Glybera，其利用AAV 載體攜帶LPL 基因治療脂蛋白脂肪酶缺乏引起的嚴(yán)重肌肉萎縮疾病[10]。2017年，F(xiàn)DA 批準(zhǔn)了基因治療產(chǎn)品Luxturna，其通過AAV2 攜帶視網(wǎng)膜變性等位基因65 治療罕見遺傳性視網(wǎng)膜病變?cè)斐傻囊暳适11]。2019年，F(xiàn)DA 批準(zhǔn)基因治療產(chǎn)品Zolgensma，其通過AAV9 裝載運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生存蛋白，治療2 歲以下脊髓性肌萎縮癥兒童(NCT03955679)。最近，有報(bào)道顯示AAV 遞送基因編輯系統(tǒng)可有效改善杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥[12]。AAV 相關(guān)的基因療法NAN-101 的Ⅰ期臨床試驗(yàn)也正在進(jìn)行中，可用于治療充血性心衰(NCT04179643)。

2 基因編輯技術(shù)

基因編輯是利用基因編輯工具酶精準(zhǔn)修改基因組的技術(shù)。與傳統(tǒng)的病毒載體介導(dǎo)外源基因技術(shù)相比，基因編輯可以介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的基因添加、基因消融、基因糾正等，精確修復(fù)突變基因，使基因治療更加精準(zhǔn)和高效[13]。同源重組技術(shù)是最早的基因編輯技術(shù)，但外源DNA 與目的DNA 自然重組的概率很低。因此，基于核酸酶的基因編輯技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，該技術(shù)不僅減少了外源基因隨機(jī)插入，而且提高了對(duì)基因組特定片段進(jìn)行精確修飾的幾率。目前，已知的四種基因編輯技術(shù)包括鋅指核酸酶(zinc-finger nucleases，ZFNs)、轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALENs)、規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)(regarding the clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)和單堿基編輯(base editing，BE)技術(shù)。

2.1 ZNFs 技術(shù) ZFNs 是一種自定義的人工核酸酶，它可以在特定的序列上產(chǎn)生雙鏈斷裂，從而實(shí)現(xiàn)有效的靶向遺傳修飾。目前，已有臨床試驗(yàn)證明ZFNs 可用于治療艾滋病、血友病和宮頸癌前病變等(NCT01044654、NCT02695160 和NCT02800369)。但是，ZFNs 特異性有限、易脫靶，而且蛋白設(shè)計(jì)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，限制了該技術(shù)的大規(guī)模應(yīng)用。

2.2 TALENs 技術(shù) 2009年，轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)蛋白和FokI 酶區(qū)域結(jié)合構(gòu)建了新一代的基因編輯技術(shù)TALENs。與ZFNs 相比，TALENs 的優(yōu)勢(shì)是設(shè)計(jì)更容易、細(xì)胞毒性較低，劣勢(shì)是載體的構(gòu)建耗時(shí)耗力。TALENs 聯(lián)合嵌合抗原受體修飾的T 細(xì)胞(chimeric antigen receptor modified T cells，CAR-T)治療多發(fā)性骨髓瘤的臨床試驗(yàn)正在招募中(NCT04142619)。

2.3 CRISPR 技 術(shù) ZFNs 和TALENs 的 應(yīng) 用 存在一定局限性。至2013年以來，研究者將注意力轉(zhuǎn)移到CRISPR/Cas9 應(yīng)用。根據(jù)Cas 蛋白的不同，CRISPR/Cas 系統(tǒng)被劃分為Ⅰ到Ⅵ型。廣泛應(yīng)用于基因編輯的CRISPR/Cas9 是Ⅱ型CRISPR 系統(tǒng)[14]。CRISPR/Cas9 與ZFNs 和TALENs 相比特異性較高。然而，Cas9 核酸酶非特異切割概率較高，導(dǎo)致其脫靶效應(yīng)相應(yīng)提升。最近，四川大學(xué)團(tuán)隊(duì)首次利用CRISPR/Cas9 修飾T 細(xì)胞治療肺癌患者[15]。同時(shí)，CRISPR/Cas9 技術(shù)已經(jīng)成為基因編輯CAR-T 的一種簡(jiǎn)單而有效的方法。麻省總醫(yī)院和哈佛大學(xué)團(tuán)隊(duì)利用CRISPR/Cas9和CAR-T技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用于膠質(zhì)瘤的研究。該團(tuán)隊(duì)的前期結(jié)果提示靶向表皮生長(zhǎng)因子Ⅷ(epidermal growth factor receptor Ⅲ，EGFRV Ⅲ)的CAR-T 可定位于顱內(nèi)腫瘤，并且可有效抑制EGFRVⅢ表達(dá)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[16]。然而，EGFRVⅢ表達(dá)的異質(zhì)性和腫瘤微環(huán)境的抑制性影響其臨床療效。該團(tuán)隊(duì)利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)內(nèi)源性T細(xì)胞受體、β-2微球蛋白進(jìn)行基因破壞，降低了啟動(dòng)移植物抗宿主病和細(xì)胞排斥的可能性；利用CRISPR/Cas9 技術(shù)破壞程序性細(xì)胞死亡配體1 基因的表達(dá)，改善腫瘤微環(huán)境的抑制性。在膠質(zhì)瘤臨床模型中，三基因編輯的EGFRVIII CAR-T 可增加抗腫瘤效應(yīng)[17]。2018年10月，F(xiàn)DA 接受了CRISPR/Cas9 技術(shù)編輯的基因療法CXT-001遞交的研究性新藥申請(qǐng)，CXT-001是基于基因編輯的自體干細(xì)胞療法，用于治療鐮狀細(xì)胞貧血癥。最近，全球?qū)崿F(xiàn)了首例CRISPR/Cas9 基因療法的體內(nèi)治療，CRISPR/Cas9 在研藥物AGN-151587 通過視網(wǎng)膜下注射給藥治療視力障礙性疾病，這一里程碑事件推動(dòng)基因編輯技術(shù)在基因治療中的快速發(fā)展。

2.4 BE 技術(shù) BE 是不需要供體DNA 模板或DNA 雙鏈斷裂即可進(jìn)行單堿基轉(zhuǎn)換的基因編輯技術(shù)。BE不依賴于非同源末端連接或同源定向修復(fù)，而是在基因組上引入精確且高度可預(yù)測(cè)的核苷酸，以便改善ZFNs、TALENs 和CRISPR/Cas9 技術(shù)的隨機(jī)插入和缺失引起的移碼突變問題。第三代堿基編輯器BE3將C：G 堿基對(duì)轉(zhuǎn)換為A：T 堿基對(duì)，與其他編輯器相比，編輯效率更高，隨機(jī)插入和缺失的頻率更低。

3 CAR-T技術(shù)及其在腫瘤中的應(yīng)用

近年來，腫瘤成為基因治療炙手可熱的研究領(lǐng)域，CAR-T療法是當(dāng)下腫瘤治療最具前景的發(fā)展方向之一。具有里程碑意義的是：2017年，F(xiàn)DA 批準(zhǔn)的兩款CAR-T 療法Kymriah 和Yescarta，分別用于治療急性淋巴細(xì)胞白血病和B細(xì)胞淋巴瘤，兩者都在臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤效果。然而，CAR-T針對(duì)實(shí)體瘤的臨床效果卻差強(qiáng)人意。實(shí)體瘤的微環(huán)境、特異性靶點(diǎn)的缺乏、免疫抑制、難以歸巢到腫瘤組織等因素限制了CAR-T 在實(shí)體瘤的發(fā)展[18]。如何找到特異性的靶點(diǎn)以及通過結(jié)構(gòu)優(yōu)化，提高對(duì)腫瘤的殺傷效率，降低CAR-T 對(duì)正常組織的損害是CAR-T 面臨的巨大挑戰(zhàn)?？茖W(xué)家們一直致力于CAR-T 的改造和研究，通過安裝自殺基因、多靶點(diǎn)CAR-T聯(lián)合、CAR-T聯(lián)合其他治療等手段，在肝癌、腎癌、直腸癌、胰腺癌等惡性腫瘤中取得了突破性進(jìn)展[19]。

3.1 肝癌 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院構(gòu)建了肝細(xì)胞癌的雙靶點(diǎn)CAR-T。雙重靶點(diǎn)為磷脂酰肌醇蛋白糖3(glypican-3，GPC3)和去唾液酸糖蛋白受體1 (asialoglycoprotein receptor 1，ASGR1)，分別是肝癌標(biāo)記物和肝組織蛋白質(zhì)。雙靶向CAR-T 針對(duì)體外共同攜帶兩種抗原的腫瘤細(xì)胞在細(xì)胞因子分泌、增殖和抗凋亡等方面明顯優(yōu)于單靶向的CAR-T[20]。為了提高應(yīng)答效率，該團(tuán)隊(duì)分析了GPC3-CAR-T聯(lián)合索拉非尼在肝癌模型中的作用。研究結(jié)果表明，索拉非尼可通過促進(jìn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的分泌和細(xì)胞凋亡機(jī)制增加GPC3-CAR-T的抗腫瘤效應(yīng)[21]。

3.2 胰腺癌 賓西法尼亞大學(xué)團(tuán)隊(duì)Ⅰ期臨床試驗(yàn)報(bào)道，靶向間皮素的CAR-T輸注6例胰腺導(dǎo)管癌患者后，有3例患者腫瘤代謝活性降低，且有1例患者肝轉(zhuǎn)移灶完全消失[22]。此外，來自英國(guó)和美國(guó)的團(tuán)隊(duì)開創(chuàng)性地構(gòu)建了具有開關(guān)功能的靶向人類表皮生長(zhǎng)因子受體2 的CAR-T，利用Ⅳ期胰腺癌患者來源的異種移植模型模擬胰腺癌侵襲性的特征，包括嚴(yán)重的肝轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移。經(jīng)體內(nèi)注射后，傳統(tǒng)和新型的CAR-T均顯示出顯著的治療效果，已經(jīng)擴(kuò)散到肝臟和肺部的癌細(xì)胞也完全消失，但具有開關(guān)作用的CAR-T可提供臨床轉(zhuǎn)化的潛在安全性[23]。

3.3 直腸癌 四川大學(xué)團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞黏附分子(Epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)可作為CAR-T 治療結(jié)直腸癌新靶點(diǎn)。研究顯示通過慢病毒遞送EpCAM CAR-T 至小鼠異種移植模型，以EpCAM 依賴性方式誘導(dǎo)靶細(xì)胞產(chǎn)生溶解性細(xì)胞毒性，并分泌細(xì)胞毒性細(xì)胞因子。 此外，EpCAM-CAR-T 過繼轉(zhuǎn)移顯著延遲了異種移植模型中腫瘤的生長(zhǎng)和形成，且安全性評(píng)價(jià)提示CAR-T 在小鼠體內(nèi)無全身毒性[24]。

3.4 腎癌 徐州醫(yī)科大學(xué)團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了人腎細(xì)胞癌特異性抗原碳酐酶Ⅸ(Carbonic AnhydraseⅨ，CAⅨ)的第二代CAR-T，CAIX-CAR-T在體外對(duì)腎癌細(xì)胞具有特異性的殺傷作用，聯(lián)合CAIX-CAR-T和舒尼替尼在轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌模型中表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤效應(yīng)[25]。在癌癥免疫治療學(xué)會(huì)2019年會(huì)上，公布兩款CAR-T 細(xì) 胞 療 法：CCT301-38(AXL)和CCT301-59(ROR2)，用于治療Ⅳ期轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌。7 例轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌患者進(jìn)行CAR-T 細(xì)胞治療后，6 例患者病情穩(wěn)定(NCT03393936)。

4 展望

經(jīng)過半個(gè)世紀(jì)的發(fā)展，基因治療作為前沿的醫(yī)學(xué)技術(shù)，有望成為疾病治療的新手段。但基因治療仍面臨著很多挑戰(zhàn)。臨床級(jí)病毒載體的制備是基因治療產(chǎn)品臨床轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。然而，病毒載體生產(chǎn)工藝復(fù)雜、成本較高，造成基因治療產(chǎn)品價(jià)格昂貴，超出了大部分家庭的支付能力，多款基因治療產(chǎn)品已黯然退市。如何降低開發(fā)成本，簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝是基因治療產(chǎn)品亟需解決的問題。CAR-T 細(xì)胞治療已經(jīng)在血液腫瘤治療中取得重大突破，在實(shí)體瘤的研究中也有顯著進(jìn)展，可是實(shí)體瘤相關(guān)腫瘤標(biāo)志物的異質(zhì)性限制了CAR-T的臨床治療效果。此外，CAR-T引起的細(xì)胞因子釋放綜合征也是需要攻克的難題?；蚓庉嬍腔蛑委熥钋把氐募夹g(shù)，但如何解決其脫靶效應(yīng)，擴(kuò)大基因編輯后的遞送工具選擇范圍是科學(xué)家仍要努力研究的方向。