李琳 李建東 高志康 徐浩 崔艷峰

HCC 是人類最具侵襲性的惡性腫瘤,因?yàn)槠滢D(zhuǎn)移和復(fù)發(fā),被列為癌癥相關(guān)死亡的最常見(jiàn)原因之一［1,2］。HCC 是一種與慢性炎癥相關(guān)的腫瘤。在HCC 的炎癥微環(huán)境中,入侵的炎癥細(xì)胞主要是腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages,TAMs)［3］。研究表明,巨噬細(xì)胞的去除可以抑制腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移［4-6］。在腫瘤微環(huán)境下,研究巨噬細(xì)胞在HCC 發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制［7］,將為靶向治療HCC 提供新的策略。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNAs)在癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移和轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)過(guò)程中扮演著重要角色［8］,在HCC 的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。GAS5(LncRNA growth arrest-special transcript 5)是GAS 家族的一員。以往的研究表明GAS5 對(duì)腫瘤的發(fā)生具有抑制作用［9］。但是GAS5 在巨噬細(xì)胞中的作用仍未可知。10 號(hào)染色體上缺失的PTEN是一種重要的腫瘤抑制因子。有研究表明,GAS5 通過(guò)與miR-32-5p、miR-103 或miR-222-3p 的靶結(jié)合,促進(jìn)PTEN 的表達(dá)［10-13］。GAS5 通過(guò)直接抑制miR-21 的表達(dá),進(jìn)而下調(diào)與腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲密切相關(guān)的基因［14］,即人程序性細(xì)胞死亡因子和PTEN的表達(dá)下調(diào),最終抑制腫瘤細(xì)胞的遷移與侵襲。因此,本研究通過(guò)ELISA 和qRT-PCR 技術(shù),分析GAS5 和PTEN 在TAMs 中的調(diào)控機(jī)制,探討其在HCC 發(fā)生發(fā)展中的變化,為揭示HCC 的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 單核巨噬細(xì)胞(THP-1)獲自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。所有引物均購(gòu)自Takara 公司。用于檢測(cè)的人肝癌組織及相應(yīng)癌旁肝組織取自徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科手術(shù)切除標(biāo)本。所有患者術(shù)前未接受過(guò)放療或生物治療等干預(yù)措施。取材后放入-80℃冰箱低溫保存。

1.2 培養(yǎng)單核巨噬細(xì)胞 THP-1 在RPMI-1640 培養(yǎng)基(Sangon Biotech)中培養(yǎng),該培養(yǎng)基含10%胎牛血清(FBS,Sangon Biotech)和1%青霉素/鏈霉素。細(xì)胞在37℃和5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)。

1.3 巨噬細(xì)胞的極化 取1.2 分離培養(yǎng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的THP-1,按2×104/孔接種于24 孔板共培小室上室中,用不同的處理方法誘導(dǎo)分化成不同類型的巨噬細(xì)胞。50 mg/ml 的巨噬細(xì)胞集落刺激因子(MCSF)作用24 h后誘導(dǎo)THP-1分化為M0巨噬細(xì)胞；100 ng/ml 脂多糖(LPS)和γ-干擾素(IFN-γ)處理24 h,誘導(dǎo)THP-1 向M1 型巨噬細(xì)胞分化。對(duì)于M2 型巨噬細(xì)胞,THP-1 與白細(xì)胞介素-4(IL-4)(20 mg/ml)共孵育24 h。THP-1 在含50% HepG2 細(xì)胞上清液和10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d,誘導(dǎo)分化為T(mén)AMs。

1.4 ELISA 吸取不同類型的巨噬細(xì)胞上清液,3000 r/min 離 心10 min,采 用ELISA 檢 測(cè)IL-1β、TNF-α、IL-10、IL-12 表達(dá)。操作步驟按ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 qRT-PCR 采用qRT-PCR 檢測(cè)GAS5 和PTEN的表達(dá)。使用RNA simple 總RNA 試劑盒(Tiangen)提取培養(yǎng)細(xì)胞中總RNA。RNA 的純度使用Nano Drop 2000 分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific)進(jìn)行檢測(cè)。用瓊脂糖凝膠電泳法測(cè)定RNA 的含量。利用Prime Script TM RT Reagent Kit(Takara) 將RNA轉(zhuǎn)化為互補(bǔ)DNA。采用SYBR Green PCR Mix 試劑盒(Takara),在ABI7300 序列檢測(cè)系統(tǒng)(應(yīng)用生物系統(tǒng))上按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行qRT-PCR。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用t檢驗(yàn)。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四種巨噬細(xì)胞上清液中IL-1β、TNF-α、IL-12、IL-10 的表達(dá)變化 檢測(cè)四種巨噬細(xì)胞上清液,結(jié)果顯示,相較于M0,M1 中IL-1β、TNF-α、IL-12表達(dá)上調(diào),IL-10 表達(dá)下降；M2 和TAMs 中IL-10 表達(dá)上調(diào),IL-1β、TNF-α、IL-12 表達(dá)下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 四種巨噬細(xì)胞上清液中IL-1β、TNF-α、IL-10、IL-12 的表達(dá)變化

2.2 GAS5 和PTEN mRNA 在四種巨噬細(xì)胞中的表達(dá)變化 qRT-PCR 檢測(cè)四種巨噬細(xì)胞中GAS5 和PTEN mRNA 的表達(dá)。結(jié)果顯示,相較于M0,GAS5 和PTEN mRNA 在M1 中表達(dá)均有不同程度的上調(diào),GAS5 和PTEN mRNA 在M2、TAMs 中表達(dá)下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 GAS5 和PTEN mRNA 在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)變化

2.3 GAS5 和PTEN mRNA 在肝癌組織與正常癌旁組織中表達(dá)的變化 收集HCC 患者腫瘤組織和正常癌旁組織,qRT-PCR 檢測(cè)GAS5 和PTEN mRNA 的表達(dá)。結(jié)果顯示,與正常癌旁組織相比,肝癌組織的GAS5 和PTEN 表達(dá)明顯上調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 GAS5 和PTEN mRNA 在肝癌組織與正常癌旁組織中表達(dá)的變化

3 討論

HCC 在我國(guó)發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì),雖然肝癌的基礎(chǔ)和臨床研究不斷取得進(jìn)展,但大多數(shù)患者就診時(shí)已是腫瘤晚期,無(wú)法獲得較好的治療效果。因此,尋找診斷和判斷預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物已經(jīng)成為提高HCC 診療水平和降低患者復(fù)發(fā)率的重要方法。

研究發(fā)現(xiàn),腫瘤的誘發(fā)常以慢性炎癥為背景,并伴隨免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞等)通過(guò)釋放各種細(xì)胞因子直接或間接殺傷靶細(xì)胞來(lái)發(fā)揮促腫瘤或抗腫瘤作用［15,16］。巨噬細(xì)胞是高度可塑的細(xì)胞,可以在表型上極化為兩個(gè)主要細(xì)胞群：M1 型巨噬細(xì)胞主要表現(xiàn)為殺傷腫瘤,促進(jìn)炎性反應(yīng)的活性；而M2 型巨噬細(xì)胞主要表現(xiàn)為抗炎癥,促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)侵襲活性［17,18］。腫瘤周圍的TAMs 往往表現(xiàn)為M2 型,TAMs 通過(guò)表達(dá)細(xì)胞因子和趨化因子抑制腫瘤免疫,從而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展［19,20］。本研究發(fā)現(xiàn),TNF-α 和IL-12 在M1 型中高度表達(dá),IL-10 在M2 和TAMs 明顯上調(diào)。M0 型為非極化巨噬細(xì)胞,各種細(xì)胞因子的表達(dá)不會(huì)像極化巨噬細(xì)胞有明顯的偏置。M1 型高表達(dá)IL-1β、TNF-α、IL-12,低表達(dá)IL-10,表現(xiàn)出明顯的促炎活性；M2 型高表達(dá)IL-10,低表達(dá)IL-12 和TNF-α,賦予了強(qiáng)大的抗炎特性。TAMs 表現(xiàn)出M2 樣表型。

近年來(lái),眾多研究表明長(zhǎng)鏈非編碼RNA GAS5 在HCC 中起到重要的調(diào)控作用。有研究發(fā)現(xiàn),GAS5 通過(guò)miR-182/ANGPTL1 軸抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［21］。GAS5通過(guò)海綿細(xì)胞miR-135b 促進(jìn)RECK 的表達(dá),從而抑制肝癌細(xì)胞的侵襲［22］。Corylin 通過(guò)抑制GAS5 介導(dǎo)的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化來(lái)抑制HCC 的進(jìn)展。通過(guò)在Starbase等生物信息學(xué)網(wǎng)站的檢索表明,miR-21 是lncRNA GAS5 的結(jié)合分子之一,而PTEN 基因是miR-21 的下游抑制靶點(diǎn)之一。Khalid 等［23］的研究證實(shí)了PTEN 與肝癌相關(guān),PTEN 可作為病毒誘導(dǎo)肝癌的潛在預(yù)后標(biāo)志物,HRD1 通過(guò)抑制PTEN 的表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖。因此,推測(cè)lncRNA-GAS5 的抗肝癌細(xì)胞侵襲作用可能是通過(guò)抑制miR-21/PTEN 軸而實(shí)現(xiàn)的。

本研究發(fā)現(xiàn)GAS5 在M1 型巨噬細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),在M2 巨噬細(xì)胞和TAMs 中表達(dá)下調(diào),提示GAS5 在TAMs 中被抑制。癌組織中GAS5 和PTEN 較癌旁組織表達(dá)明顯增高,說(shuō)明GAS5 和PTEN 參與HCC 的發(fā)生。由此推測(cè)：肝臟發(fā)生癌變過(guò)程中肝癌細(xì)胞與肝癌浸潤(rùn)的單核/巨噬細(xì)胞相互作用,巨噬細(xì)胞由腫瘤初期的M1 型進(jìn)展為后期的M2 型和TAMs,TAMs 募集通過(guò)分泌細(xì)胞因子促進(jìn)有絲分裂及血管生成的表達(dá)增多,加速肝癌的進(jìn)程。TAMs 的密度與肝癌患者的生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān),本研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織的GAS5 和PTEN 表達(dá)增加,說(shuō)明GAS5 可能參與PTEN 在肝癌細(xì)胞的過(guò)表達(dá),PTEN 作為具有蛋白磷酸酶和脂質(zhì)磷脂酶活性的抑癌基因,其表達(dá)增加用于抵御肝癌細(xì)胞的惡性增長(zhǎng),穩(wěn)定和增強(qiáng)肝癌細(xì)胞間粘附,抑制肝癌細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。因此,推測(cè)GAS5 在HCC 進(jìn)展過(guò)程中與TAMs 的極化和PTEN 有關(guān),GAS5 可能是肝癌治療的一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。

有研究發(fā)現(xiàn),PTEN 可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制劑p21 等的表達(dá),在抑制細(xì)胞的遷移、鋪展和局部粘附及抑制腫瘤新生血管形成等諸多機(jī)制發(fā)揮抑瘤作用［24］。PTEN 多途徑抑制腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移,影響患者的預(yù)后。那么,GAS5 和PTEN 在不同極化巨噬細(xì)胞中對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲有怎樣的調(diào)控作用,仍需進(jìn)一步探討。