陰道微生物在宮頸疾病發(fā)生發(fā)展中的作用

秦麗，朱莉，王瑞雅，任志帥，郭玉琪

(鄭州大學(xué)人民醫(yī)院/河南省人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科，河南 鄭州 450003)

宮頸疾病是指宮頸組織區(qū)域發(fā)生的各種病變，主要包括宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasias，CIN)和宮頸癌等。CIN被視為癌前病變，分3級。宮頸癌是全球女性第四大常見癌癥，發(fā)病率和死亡率均排名第四[1]，在發(fā)展中國家形勢更為嚴(yán)峻。宮頸癌是少有的病因較為明確的腫瘤性疾病，持續(xù)的高危型人乳頭狀瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染是絕大部分宮頸癌及癌前病變發(fā)生的必要非充分條件。HPV感染是全世界最常見的性傳播感染，絕大多數(shù)女性在一生中都曾感染HPV，其中大多在1～2 a內(nèi)自然清除，少數(shù)人會出現(xiàn)宮頸病變乃至發(fā)展為宮頸癌[2]。陰道微生態(tài)環(huán)境對HPV的感染及致病有重要影響，其中陰道微生物群落結(jié)構(gòu)在宮頸疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，許多研究表明，相對于以乳桿菌(Lactobacillus)為主導(dǎo)的群落，以細(xì)菌性陰道病相關(guān)細(xì)菌(bacterial vaginosis-associated bacteria，BVAB)為主導(dǎo)的群落結(jié)構(gòu)更可能與宮頸疾病的發(fā)生發(fā)展呈正相關(guān)，本文將對這些研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 陰道微生物群組概述

1.1 陰道微生物群組的定義和發(fā)展陰道微生物群組是指特定時(shí)間內(nèi)定植于女性陰道中的所有微生物的總和，包括細(xì)菌、真菌、病毒、支原體及衣原體等，這些微生物的所有基因序列的集合稱為陰道微生物組，其中包括與宿主同源的基因序列部分。隨著對人體微生物的深入研究，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)人體微生物群組與宿主之間通過共進(jìn)化、共發(fā)育、共代謝、互調(diào)控等方式進(jìn)行的相互作用[3-6]。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，新一代分子測序技術(shù)的使用越來越普遍，研究微生物組成主要通過基于16S、18S rRNA或其他標(biāo)志基因或基因組區(qū)域進(jìn)行分析，對生物樣品擴(kuò)增、測序，最后根據(jù)序列劃分為不同門類。2010年Ravel等[7]通過對396名來自4個(gè)民族的北美育齡期婦女的陰道微生物組學(xué)分析，首次將正常健康女性生殖道微生物組成分為5類主要的菌群結(jié)構(gòu)類型(community state types，CST)，其中CST Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ的核心優(yōu)勢菌群分別為卷曲乳桿菌(L.crispatus)、格氏乳桿菌(L.gasseri)、惰性乳桿菌(L.iners)和詹氏乳桿菌(L.jensenii)，存在于73%的女性中，而CST Ⅳ則主要由非乳桿菌屬細(xì)菌組成，大部分為專性厭氧菌，包括奇異菌屬(Atopobium)、加德納菌(Gardnerella)、普氏菌(Prevotella)等。隨后的研究將CST Ⅳ進(jìn)一步細(xì)分為Ⅳ-A和Ⅳ-B子組[4,8]。

1.2 陰道微生物與生殖健康對于人體其他部位，微生物群組多樣性通常是有益的，例如腸道微生物，然而對于女性生殖道來說，較為單一的以乳桿菌為主導(dǎo)的菌群結(jié)構(gòu)似乎被認(rèn)為更為健康。研究發(fā)現(xiàn)，乳桿菌可通過多方面機(jī)制保護(hù)女性陰道健康，主要有：(1)通過代謝產(chǎn)物間接發(fā)揮作用，乳桿菌可產(chǎn)酸降低pH，分泌生物活性化合物等；(2)乳桿菌自身的生物學(xué)特性可直接發(fā)揮作用，包括競爭營養(yǎng)和組織黏附[9-12]。乳桿菌可使陰道管腔內(nèi)的碳水化合物轉(zhuǎn)化為乳酸，在酸性環(huán)境下，乳桿菌可以通過上皮細(xì)胞表面的糖蛋白(纖連蛋白)較牢固地黏附于陰道上皮，這會在一定程度上抑制其他病原體的定植。此外，乳桿菌還可通過產(chǎn)生過氧化氫和細(xì)菌素等物質(zhì)抵抗其他細(xì)菌[9-13]。近年來許多研究報(bào)道了乳桿菌具有增強(qiáng)宿主固有免疫和適應(yīng)性免疫、直接抑制病毒和細(xì)菌、增強(qiáng)腸道上皮細(xì)胞屏障功能等作用。Abramov等[14]使用宮頸陰道上皮模型評估了卷曲乳桿菌2029及其S層蛋白2抵抗生殖道病原體的作用及機(jī)制，證明其抑制MALP-2誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞中白介素-8的產(chǎn)生并增加抗炎細(xì)胞因子白介素-6的產(chǎn)生，維持女性生殖道穩(wěn)態(tài)[15]。然而并不是所有乳桿菌都有益健康，某些類型的乳桿菌是有害的，缺乏有益健康的乳桿菌或者陰道內(nèi)存在有害菌株的女性遭受性傳播感染的風(fēng)險(xiǎn)更高[16-17]。準(zhǔn)確識別有利于生殖道健康的微生物群組是預(yù)防和治療女性生殖道疾病中的一項(xiàng)重要任務(wù)。

1.3 陰道微生物與宿主的相互作用女性青春期和更年期陰道微生物組成容易發(fā)生巨大變化，從而一定程度上影響女性的生殖健康。某些女性陰道微生物群的組成有著高度動(dòng)態(tài)變化的特征，而另一些女性則相對穩(wěn)定，這可能是某些女性對部分生殖道疾病更易感的重要原因。有研究表明，CST I最趨于穩(wěn)定，而CST Ⅳ容易發(fā)生變化，以卷曲乳桿菌為優(yōu)勢菌的陰道微生物群組更有可能先轉(zhuǎn)變?yōu)槎栊匀闂U菌為主或混合性乳桿菌的陰道微生物群組，而不是直接向完全的菌群失調(diào)轉(zhuǎn)變[4,18-19]。陰道微生物之間相互作用并受到宿主機(jī)體的調(diào)控，同時(shí)也反過來調(diào)節(jié)宿主局部免疫功能，某些微生物與宿主基因組相互作用，維持相對獨(dú)立的生態(tài)環(huán)境[20]。當(dāng)外來病原體入侵，陰道微生態(tài)失衡時(shí)，陰道微生物群組也發(fā)生相應(yīng)的變化。

2 HPV與宮頸疾病

幾乎所有宮頸疾病都與HPV有關(guān)，HPV屬于空泡病毒A屬，是無包膜小型雙鏈環(huán)狀 DNA病毒，主要侵犯人體皮膚和黏膜的基底上皮細(xì)胞，最易侵犯的是鱗狀上皮細(xì)胞基底層以及鱗柱交界處的上皮細(xì)胞和化生細(xì)胞。HPV感染的主要途徑是性傳播，此外是垂直傳播和密切接觸傳播。HPV通過性行為等產(chǎn)生的微小創(chuàng)口感染人體，進(jìn)入細(xì)胞并開始轉(zhuǎn)錄，經(jīng)過一段時(shí)間的潛伏后，病毒基因與宿主基因整合，HPV E6、E7可結(jié)合抑癌蛋白p53、pRB，誘導(dǎo)細(xì)胞不斷增殖、分化，并產(chǎn)生病毒顆粒，感染其他細(xì)胞。在此期間宮頸陰道部的局部免疫功能未能及時(shí)清除HPV，普遍認(rèn)為高危型HPV通過E6、E7等癌相關(guān)基因下調(diào)了先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，逃避了免疫監(jiān)視，導(dǎo)致不典型增生乃至CIN，HPV以及其他協(xié)同促進(jìn)因素如局部免疫功能障礙、菌群失調(diào)、性激素的使用、吸煙等的持續(xù)作用，最終導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生。在病毒和宿主的博弈中，炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)等均可使宿主DNA受損，從而利于病毒基因成功整合[21-23]。

3 陰道微生物群組與HPV感染

陰道炎癥被視為HPV感染的影響因素。喬嶠[24]通過橫斷面研究以及縱向觀察研究發(fā)現(xiàn)支原體感染是阻礙高危型HPV自然清除的主要影響因素。一項(xiàng)系統(tǒng)性評價(jià)表明細(xì)菌性陰道病(bacterial vaginosis，BV)、衣原體和解脲支原體與HPV感染增加有關(guān)，假絲酵母菌與HPV感染減少有關(guān)，BV與CIN的發(fā)生有關(guān)[25]。然而，其中的因果關(guān)系存在可逆性解釋，同時(shí)一些報(bào)道的研究方法及結(jié)果仍有爭議。近年來，分子生物學(xué)技術(shù)的高速發(fā)展使廣大學(xué)者得以從基因組學(xué)層面研究陰道菌群結(jié)構(gòu)的整體差異與BV、HPV等病原體的易感性是否存在關(guān)聯(lián)。一般認(rèn)為，CST Ⅰ和豐度較高的卷曲乳桿菌可能對抵抗HPV感染具有一定作用。在韓國雙胞胎中進(jìn)行的一項(xiàng)使用高通量測序技術(shù)檢測陰道微生物群組和HPV感染情況的縱向研究顯示，梭菌，特別是纖毛菌屬(Sneathia)，可作為HPV感染的微生物標(biāo)志[26]。最新的一項(xiàng)系統(tǒng)評價(jià)顯示，與卷曲乳桿菌相比，微生物群組以非乳桿菌屬或惰性乳桿菌屬為主的患者受HPV感染的風(fēng)險(xiǎn)高3～5倍，受高危型HPV感染和發(fā)生CIN/宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)高2～3倍[27]。一項(xiàng)在北美女性中進(jìn)行的微生物組學(xué)研究顯示，陰道菌群為CST Ⅲ或CST-Ⅳ且存在高比例奇異菌屬、普氏菌、加德納菌的女性，最有可能存在HPV持續(xù)陽性，且感染清除的速度最慢[28]。一項(xiàng)隨訪1 a的研究顯示，HPV陽性婦女的宮頸微生物豐富度低于HPV陰性婦女，且絕經(jīng)后組較絕經(jīng)前組差異更大，德氏乳桿菌與持續(xù)性HPV感染呈負(fù)相關(guān)，而屬于普氏菌屬等9個(gè)類群的陰道微生物與HPV的持續(xù)感染呈正相關(guān)[29]。另一項(xiàng)采用焦磷酸測序法檢測陰道CST的研究顯示，CST Ⅳ-BV為HPV持續(xù)感染的危險(xiǎn)因素，奇異菌屬和來自加德納菌的唾液酸酶基因可作為HPV持續(xù)感染的微生物標(biāo)志[30]?？傊?，基于測序分析技術(shù)的研究提示陰道微生物群組切實(shí)影響HPV的感染和清除。

4 陰道CST與宮頸疾病

HPV持續(xù)感染期間，陰道微生物群組會繼續(xù)影響宮頸疾病的發(fā)生發(fā)展。相當(dāng)多縱向研究顯示，過渡狀態(tài)的菌群結(jié)構(gòu)(如CST Ⅲ和CST Ⅳ-B)可能導(dǎo)致促炎狀態(tài)，從而引起宮頸陰道組織損傷并促進(jìn)E6/E7表達(dá)，使宿主基因組呈不穩(wěn)定狀態(tài)且易與病毒整合，之后進(jìn)展為高級別鱗狀上皮內(nèi)病變。許多特定微生物屬種與CIN有關(guān)，如卷曲乳桿菌缺乏程度的加重與CIN嚴(yán)重程度的升高有關(guān)，纖毛菌屬的富集與癌前病變和浸潤性宮頸癌有關(guān)[31]。最近的一項(xiàng)前瞻性縱向研究[32]分析了陰道微生物群組與CIN2自然進(jìn)程之間的關(guān)系，評估陰道微生物群組結(jié)構(gòu)是否可用于預(yù)測疾病結(jié)局。研究人員收集了87例確診為CIN2病變且未治療的16～26歲女性的陰道樣本，進(jìn)行細(xì)菌DNA測序，調(diào)查這些患者24個(gè)月內(nèi)CIN2消退率。結(jié)果顯示：陰道主導(dǎo)菌群為乳桿菌的患者，12個(gè)月時(shí)CIN2更可能消退，而乳桿菌的減少和特定厭氧菌群的存在則與CIN2的持續(xù)存在及消退緩慢有關(guān)，具有CST Ⅳ菌群結(jié)構(gòu)的女性病情消退較具有CST Ⅰ或Ⅲ菌群結(jié)構(gòu)的女性慢。這些提示以乳桿菌為主導(dǎo)的陰道微生物群組在宮頸疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著保護(hù)作用，而其他類型菌群則可能促進(jìn)了宮頸疾病的發(fā)展。

5 BVAB與宮頸疾病

BVAB是指可引起B(yǎng)V癥狀的一系列微生物，主要包括加德納菌、奇異菌屬及普氏菌等。微生物組學(xué)分析提示，BVAB是導(dǎo)致HPV感染后轉(zhuǎn)歸惡化和宮頸疾病進(jìn)展的主要微生物因素，其主要通過影響細(xì)胞代謝、免疫反應(yīng)、分泌細(xì)菌毒素等機(jī)制發(fā)揮作用。采用代謝組學(xué)等生物信息分析技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，HPV陽性女性比陰性女性具有更高的生物胺和磷脂水平[33]，而生物胺的產(chǎn)生被認(rèn)為與BVAB有關(guān)[34]。BVAB可產(chǎn)生較多的短鏈脂肪酸，具有促炎作用，也有研究指出BV能提高宿主細(xì)胞活性氧水平，增加DNA氧化損傷，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[20,35]。多項(xiàng)研究表明，BV和BVAB會影響陰道免疫環(huán)境，包括細(xì)胞因子/趨化因子，抗微生物蛋白和免疫細(xì)胞群[36]。一般情況下，宿主的炎癥反應(yīng)可抵御包括HPV在內(nèi)的性傳播感染，但長期處于炎癥狀態(tài)對宮頸細(xì)胞有害，可導(dǎo)致DNA損傷及潛在的癌變。以BVAB為主的CST Ⅳ更容易引發(fā)炎癥反應(yīng)，這可能與其破壞陰道屏障作用有關(guān)[35-36]。此外，研究發(fā)現(xiàn)加德納菌屬分泌毒素和惰性乳桿菌分泌毒素分別在pH升高和降低時(shí)發(fā)揮作用并相互調(diào)節(jié)[37]。Shishpal等[38]首次從陰道加德納菌ATCC 14019中分離出膜囊泡并進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，證實(shí)了陰道溶細(xì)胞素的存在，膜囊泡可誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞毒性，提高上皮細(xì)胞中促炎性細(xì)胞因子白介素-8水平，促進(jìn)紅細(xì)胞溶解，表明膜囊泡可能參與細(xì)胞毒性蛋白和其他毒力因子向宿主細(xì)胞的傳遞，有助于增強(qiáng)與BV發(fā)病有關(guān)的細(xì)胞損傷。BV相關(guān)的細(xì)胞損傷則為HPV侵入細(xì)胞、持續(xù)感染提供了土壤。

6 乳桿菌與宮頸疾病

盡管以乳桿菌為主的益生菌的抗癌活性很早就被發(fā)現(xiàn)，但其中的機(jī)制并未被詳細(xì)闡明。Motevaseli等[39]通過用卷曲乳桿菌和格氏乳桿菌處理正常細(xì)胞和HeLa宮頸癌細(xì)胞系，比較正常細(xì)胞與宮頸癌細(xì)胞對陰道乳桿菌常見成分的增殖和凋亡反應(yīng)，結(jié)果顯示陰道乳桿菌對宮頸癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用，而對正常細(xì)胞沒有作用，并且這種細(xì)胞毒性與pH和乳酸無關(guān)。另一項(xiàng)體外研究評估雙歧桿菌SPM1005-A對SiHa宮頸癌細(xì)胞系的細(xì)胞毒作用，其將雙歧桿菌SPM1005-A、HPV 16以及宮頸癌細(xì)胞混合后共同孵育，通過實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測E6和E7癌基因表達(dá)情況，通過免疫印跡法檢測蛋白質(zhì)水平，結(jié)果顯示雙歧桿菌SPM1005-A通過抑制E6和E7癌基因表達(dá)而發(fā)揮抗病毒活性[40]，提示雙歧桿菌SPM1005-A可能具有預(yù)防HPV相關(guān)宮頸癌的潛在價(jià)值。乳桿菌還可能通過分泌細(xì)胞因子的方式作用于病毒和細(xì)胞。Jacouton等[41]通過HPV誘導(dǎo)的小鼠同種異體移植模型驗(yàn)證了干酪乳桿菌BL23菌株通過TH17細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用，并構(gòu)建了可產(chǎn)生并有效分泌具有生物活性的白介素-17A的重組乳酸乳球菌，進(jìn)一步驗(yàn)證TH17細(xì)胞對乳桿菌抗腫瘤特性的重要性。

7 益生菌及益生元的應(yīng)用

基于乳桿菌保護(hù)宮頸的積極作用，益生菌在宮頸疾病防治領(lǐng)域的應(yīng)用日益受到重視。目前，益生菌類膳食補(bǔ)充劑基本均含有乳桿菌，通過口服補(bǔ)充發(fā)酵乳桿菌和鼠李糖乳桿菌有助于陰道微生態(tài)環(huán)境恢復(fù)正常。一項(xiàng)臨床病例對照研究顯示，相對于益生菌短期使用者，長期使用者清除HPV和逆轉(zhuǎn)宮頸細(xì)胞學(xué)異常的概率更高[42]。Kawana[43]研發(fā)了一種基于乳桿菌的治療性HPV疫苗(表達(dá)HPV E7的干酪乳桿菌)，可誘導(dǎo)腸道黏膜的抗HPV細(xì)胞免疫，靜脈注射HPV 16或18 E6/E7 siRNA聚合微團(tuán)，分別抑制了SiHa或HeLa細(xì)胞形成的皮下腫瘤的生長?？诜闂U菌/乳鐵蛋白復(fù)合物使益生菌定植于陰道，可有效改善陰道感染癥狀[44]。Verdenelli等[45]評估了不同乳桿菌菌株對HeLa細(xì)胞的黏附作用、對念珠菌的抗菌作用，以便篩選益生菌菌種，便于臨床特異性應(yīng)用。大部分研究肯定了益生菌的使用對于重建女性陰道微生態(tài)環(huán)境、清除HPV和逆轉(zhuǎn)宮頸疾病進(jìn)程方面的積極作用，也有部分研究認(rèn)為療效尚不確切，但長期觀察未發(fā)現(xiàn)不利作用。除益生菌外，益生元也用于增強(qiáng)人體中有益細(xì)菌的產(chǎn)生，益生元是不易消化的碳水化合物，如低聚半乳糖、低聚果糖等，具有調(diào)節(jié)微生物組成的作用，有助于詹氏乳桿菌、卷曲乳桿菌和陰道乳桿菌等的生長。

8 總結(jié)與展望

女性生殖道健康與陰道微生物環(huán)境密切相關(guān)，隨著高通量測序等分子技術(shù)的廣泛應(yīng)用，微生物代謝組學(xué)、宏基因組學(xué)蓬勃發(fā)展，提高了微生物群組研究的效率和準(zhǔn)確性。新近的大量研究證實(shí)了陰道微生物群組參與宮頸疾病的發(fā)生和發(fā)展，通過影響陰道微環(huán)境，參與生殖道感染，影響HPV的感染和疾病轉(zhuǎn)歸，甚至導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生。不同陰道CST類型的女性暴露于HPV時(shí)結(jié)局不同，以卷曲乳桿菌為主導(dǎo)的CST類型更能避免宮頸疾病的發(fā)生及進(jìn)展。為預(yù)防或更早地發(fā)現(xiàn)宮頸疾病，微生物和代謝物聯(lián)合檢測是未來的研究方向。微生物參與腫瘤的診斷與治療越來越成為共識，需要進(jìn)一步研究微生物與傳統(tǒng)治療方法的聯(lián)合治療方案，最大程度地發(fā)揮人體微生物的作用。生殖道益生菌的開發(fā)和應(yīng)用應(yīng)受到鼓勵(lì)，利用好生物工程技術(shù)研制出有效便捷的針對宮頸疾病的治療性疫苗和生物性治療制劑，也有利于宮頸疾病的防治和緩解全球抗生素耐藥的嚴(yán)峻形勢。