朱偉峰 陳露 譚凱 王高杰 蔡承志

摘要：為預測并鑒定豬丹毒絲菌甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）分子線性B細胞表位，首先通過多序列比分析已經(jīng)全基因組測序的10株菌株的GAPDH一級結(jié)構(gòu)保守性;然后使用在線軟件Bepipred-2.0預測豬丹毒絲菌GAPDH線性B細胞表位，接下來通過人工化學合方式合成GAPDH表位對應的多肽;最后使用間接ELISA法檢測這些多肽與豬丹毒絲菌GAPDH高免血清之間的反應。研究發(fā)現(xiàn)已經(jīng)完成全基因組測序的10株菌株的GAPDH一級結(jié)構(gòu)高度保守。通過軟件預測，找到了豬丹毒絲菌GAPDH的3個潛在的表位。ELISA檢測結(jié)果表明74VLSERDPKNLPWKELGV90和 178HAYTNDQNTLDGPHAKGDLRRGRAAAQSIIPNSTGA213 與GAPDH高免血清反應明顯，是豬丹毒絲菌GAPDH的表位。成功預測并鑒定到2個豬丹毒絲菌的抗原表位，這些表位將為以后基于豬丹毒絲菌GAPDH表位的診斷、疫苗設(shè)計及致病機制研究提供技術(shù)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：豬丹毒絲菌;甘油醛-3-磷酸脫氫酶;保護性抗原;表位預測;表位鑒定

中圖分類號：S858.28?? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）22-0171-04

收稿日期：2021-04-01

基金項目：江蘇省自然科學基金青年基金（編號：BK20190270）;江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號：CX（19）3016]。

作者簡介：朱偉峰 （1984—），男，河北石家莊人，博士，助理研究員，主要從事新型疫苗設(shè)計與動物疫病防控基礎(chǔ)研究。E-mail：zhuweifeng8@126.com。

豬丹毒絲菌（Erysipelothrix rhusiopathiae，又稱紅斑丹毒絲菌、豬丹毒桿菌）是造成豬丹毒的病原[1]。豬丹毒是世界范圍內(nèi)危害養(yǎng)豬業(yè)的主要細菌性疫病之一，在我國豬丹毒和豬肺疫、豬瘟曾并稱為豬場三大疫病。近年來豬丹毒的危害雖然有所降低，但其臨床分離或檢出率依然位居前列，依然是豬場主要細菌性疫病[2-3]。豬丹毒絲菌同樣可以造成人類感染發(fā)?。惖ざ荆且环N人獸共患病病原菌[4]。

目前豬丹毒的免疫保護機制和致病機制依然不完全清楚[4]。我們的前期工作針對豬丹毒絲菌甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）分子的免疫保護作用和致病作用開展了研究。結(jié)果顯示，豬丹毒絲菌的GAPDH分子既可以作為抗原發(fā)揮免疫保護作用，也可以作為毒力因子發(fā)揮黏附作用[5-6]。

抗原表位是抗原引發(fā)免疫保護的物質(zhì)基礎(chǔ)[7-8]。部分抗原表位既是抗體發(fā)揮作用的位點也是病原菌對宿主發(fā)揮作用的關(guān)鍵位點（即致病性表位）[9]。因而通過鑒定豬丹毒絲菌GAPDH的B細胞表位有助于進一步理解GAPDH免疫保護效應的本質(zhì)，并為進一步研究GAPDH的致病作用提供條件。伴隨生物信息學的發(fā)展，不斷有學者試圖開發(fā)能夠預測抗原表位的軟件，近年來在線軟件Bepipred-2.0對于線性B細胞表位已經(jīng)有了比較好的預測效果[10]。本研究的目的是預測豬丹毒絲菌GAPDH分子的線性B細胞表位，并進一步鑒定預測結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 基因序列來源

本研究用于序列分析的豬丹毒絲菌GAPDH氨基酸序列均來自已經(jīng)完成基因組測序的豬丹毒絲菌，基因組數(shù)據(jù)：SE38 （NZ_CP011861.1）、G4T10 （NZ_CP011860.1）、SY1027 （NC_021354.1）、ZJ （NZ_CP041995.1）、ML10 1 （NZ_CP029804.1）、WH13013 （NZ_CP017116.1）、GXBY-1 （NZ_CP014861.1）、Fujisawa （NC_015601.1）、NCTC8163 （NZ_LR134439.1）、KC-Sb-R1 （NZ_CP033601.1）。所有序列自美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫NCBI-GenBank公共數(shù)據(jù)庫中獲得。

1.2 生物材料及主要試劑

鼠源豬丹毒絲菌GAPDH高免血清在前期試驗[5-6]中已經(jīng)制備并保存。ELISA板購自美國Costar公司，HRP鼠二抗購自Biosharp公司，TMB單組分顯色液購自湖州英創(chuàng)生物科技有限公司。

1.3 不同菌株GAPDH氨基酸序列的比較

使用在線軟件Clustal Omega（http：//www.clustal.org/omega/）完成多序列比對，比較“1.1”節(jié)中不同豬丹毒絲菌GAPDH氨基酸序之間的相似性。

1.4 豬丹毒絲菌GAPDH表位預測

使用在線軟件Bepipred-2.0（http：//www.detaibio.com/tools/epitope-prediction-vr.html）分析豬丹毒絲菌GAPDH分子上各個氨基酸殘基構(gòu)成表位的能力。以軟件默認的0.5為閾值，高于此閾值且有較長連續(xù)序列的一段多肽被預測為GAPDH分子的線性B細胞表位。

1.5 表位多肽的化學合成

針對Bepipred-2.0所預測到的線性B細胞表位，通過南京金斯瑞生物科技股份有限公司化學合成對應序列的線性多肽。合成過程簡述如下：使用固相肽合成法（SPPS）合成多肽，即依次向樹脂中添加氨基酸以構(gòu)建肽鏈;當合成完成后，首先去除保護N-端的Fmoc基團，然后去除保護側(cè)鏈的保護基團，最后將多肽從樹脂上切割下來。粗肽液樣品溶解后，注入高效液相色譜（HPLC）儀，對色譜中出現(xiàn)的每個部分進行分子量和純度測試，以確認目標多肽含量。如果預測到的抗原表位長度均超過25個氨基酸殘基，常規(guī)合成難度較大，則合成能夠覆蓋對應表位的重疊多肽以完成后續(xù)試驗。

1.6 表位與GAPDH高免血清的反應

使用間接ELISA法[11]鑒定多肽與血清的反應性，簡要敘述如下：以多肽包被ELISA板（10 μg/孔，對照組不包被任何抗原），37 ℃孵育 2 h。以PBST洗滌5次以后，使用5%的脫脂乳于37 ℃下封閉1 h。孵育1 ∶200稀釋的豬丹毒絲菌SE38株GAPDH高免血清，37 ℃下1 h。以PBST洗滌5次后，孵育偶聯(lián)HRP的羊抗鼠二抗，37 ℃下孵育 30 min。經(jīng)過5次洗滌后加入100 μL TMB單組分顯色液，反應10 min后加入50 μL終止液（2 mol/L 硫酸）。最后在酶標儀上讀取450 nm處的吸光度值。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計學檢驗

數(shù)據(jù)均使用平均值±標準差（x±s）來表示。用t檢驗檢測統(tǒng)計學差異，差異顯著判定標準為 P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株GAPDH氨基酸序列的相似性

通過多序列比較發(fā)現(xiàn)豬丹毒絲菌SE38、G4T10、SY1027、ZJ、ML10 1、WH13013、GXBY-1、Fujisawa、NCTC8163、KC-Sb-R1的GAPDH氨基酸序列完全相同（Identity=100%，故未展示多序列比對結(jié)果），顯示出GAPDH具有高度保守的特點。

2.2 GAPDH線性B細胞表位預測結(jié)果

選擇豬丹毒絲菌SE38株的GAPDH序列進行預測分析，所預測的豬丹毒絲菌GAPDH線性B細胞表位的分布狀況見圖1。有多段連續(xù)序列高于軟件默認的閾值0.5，選擇最長的3個片段（分別記為ERepitope1、ERepitope2、ERepitope3，表1、圖2）作為預測到的線性B細胞表位進行后續(xù)研究。

2.3 表位對應多肽與GAPDH高免血清的反應

以人工化學合成方式成功獲取了所預測表位對應的多肽[分別標記為ERG-1、ERG-2（A～D）、ERG-3]（表1）。

ELISA檢測結(jié)果見圖3。豬丹毒絲菌GAPDH的2個表位ERepitope1和ERepitope2對應的合成多肽[ERG-1、ERG-2（A-D）]均能夠與豬丹毒絲菌GAPDH高免血清發(fā)生明顯的反應（P<0.05），但是ERepitope3對應的合成多肽（ERG-3）不能與豬丹毒絲菌GAPDH高免血清發(fā)生反應（P>0.05）。該結(jié)果證實所預測到的ERepitope1和ERepitope2是豬丹毒絲菌GAPDH的抗原表位，但ERepitope3則不是豬丹毒絲菌GAPDH的抗原表位。

3 討論

BepiPred-2.0是通過隨機森林算法學習來自于抗體-抗原復合物結(jié)構(gòu)的表位數(shù)據(jù)進而建立起的一種表位預測工具，它對于線性B細胞表位的預測能力尤為突出[10]。所以本研究選擇了該軟件預測豬丹毒絲菌GAPDH的表位。依照軟件使用方法，預測分值高于0.5且長度較長的多肽構(gòu)成表位的可能性較大，所以本研究選擇了長度最長的3段片段來作為預測到的表位進行研究。通過合成多肽與GAPDH高免血清的反應進一步確認了其中2個是表位。研究結(jié)果證實BepiPred-2.0具有較好的表位預測能力。從圖1可知，軟件對于豬丹毒絲菌GAPDH分子所預測到的線性表位數(shù)量遠不止3個，因而在以后的研究中可以對所預測出的表位中的剩余部分進行進一步研究。

通過ELISA驗證，本研究最終確認ERepitope1和ERepitope2分別是豬丹毒絲菌GAPDH的線性B細胞表位。這2個表位的序列及其在GAPDH分子上的位置與之前研究所鑒定到的GAPDH表位[12-13]都不同，是新的表位。已有文獻報道顯示，GAPDH表位在抗原提呈、調(diào)理吞噬等方面發(fā)揮作用，本研究所鑒定到的表位可能也具有類似的免疫學效應，以后應進一步研究，并在疫苗設(shè)計中加以利用。

研究結(jié)果顯示，GAPDH具有高度保守的特點（本研究所比較的10個菌株的GAPDH一級結(jié)構(gòu)完全相同）。最近已經(jīng)有研究顯示細菌保守蛋白的表位可以用于建立特異性的診斷方法[11]，因而將來還可以以本研究所鑒定到的表位（ERepitope1或ERepitope2）為基礎(chǔ)建立豬丹毒絲菌感染的特異性診斷方法。

筆者前期的研究表明GAPDH是豬丹毒絲菌的黏附因子，某些氨基酸位點可能發(fā)揮關(guān)鍵作用[6，14]。其他學者的研究則表明有的抗原表位同時也是病原和宿主相互作用的關(guān)鍵位點[15-17]，因而本研究所鑒定到的表位可能為研究豬丹毒絲菌與宿主相互作用提供新的線索。

本研究成功預測并鑒定到2個豬丹毒絲菌的抗原表位，這些表位將為以后的豬丹毒絲菌GAPDH免疫保護機制、致病機制研究提供新的線索，并為基于GAPDH抗原表位的疫苗設(shè)計和診斷試劑開發(fā)提供技術(shù)基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1]甘孟侯，楊漢春.中國豬病學[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005：251-257.

[2]Zhu W F，Wu C，Kang C，et al. Development of a duplex PCR for rapid detection and differentiation of Erysipelothrix rhusiopathiae vaccine strains and wild type strains[J]. Veterinary Microbiology，2017，199：108-110.

[3]李敬濤，吳 超，王 雅，等. 湖北部分地區(qū)紅斑丹毒絲菌分離株耐藥性分析[J]. 養(yǎng)殖與飼料，2015（2）：10-13.

[4]Wang Q N，Chang B J，Riley T V.Erysipelothrix rhusiopathiae[J]. Veterinary Microbiology，2010，140（3/4）：405-417.

[5]Zhu W F，Wu C，Kang C，et al. Evaluation of the protective efficacy of four newly identified surface proteins of Erysipelothrix rhusiopathiae[J]. Vaccine，2018，36（52）：8079-8083.

[6]Zhu W F，Zhang Q A，Li J T，et al. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Acts as an adhesin in Erysipelothrix rhusiopathiae adhesion to porcine endothelial cells and as a receptor in recruitment of host fibronectin and plasminogen[J]. Veterinary Research，2017，48（1）：16.

[7]崔治中.獸醫(yī)免疫學[M]. 2版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2015：34-47.

[8]楊漢春.動物免疫學[M]. 2版.北京：中國農(nóng)業(yè)大學出版社，2003：9-31.

[9]金明蘭，南文龍，韓 松，等. 抗原表位及多表位疫苗研究進展[C]//中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會第七屆全國會員代表大會暨第十三次學術(shù)研討會論文集.南寧，2009：276-279.

[10]Jespersen M C，Peters B，Nielsen M，et al. BepiPred-2.0：improving sequence-based B-cell epitope prediction using conformational epitopes[J]. Nucleic Acids Research，2017，45（W1）：W24-W29.

[11]Pyclik M，Górska S，Brzozowska E，et al. Epitope mapping of Streptococcus agalactiae elongation factor tu protein recognized by human sera[J]. Frontiers in Microbiology，2018，9：125.

[12]Alvarez-Dominguez C，Salcines-Cuevas D，Teran-Navarro H，et al. Epitopes for multivalent vaccines against Listeria，Mycobacterium and Streptococcus spp.：a novel role for glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase[J]. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology，2020，10：573348.

[13]王夢瑤.金黃色葡萄球菌GapC蛋白B細胞表位的鑒定與分析[D]. 大慶：黑龍江八一農(nóng)墾大學，2018：1-72.

[14]Zhu W，Wang Y，Cai C，et al. Erysipelothrix rhusiopathiae recruits host plasminogen via the major protective antigen SpaA[J]. FEMS Microbiology Letters，2017，364（5）：fnx036.

[15]Song Y H，Wang F，F(xiàn)an Z Y，et al. Identification of novel rabbit hemorrhagic disease virus B-cell epitopes and their interaction with host histo-blood group antigens[J]. Journal of General Virology，2016，97（2）：356-365.

[16]Rajam G，Phillips D J，White E，et al. A functional epitope of the pneumococcal surface adhesin A activates nasopharyngeal cells and increases bacterial internalization[J]. Microbial Pathogenesis，2008，44（3）：186-196.

[17]Poon A Y，Vance D J，Rong Y H，et al. A supercluster of neutralizing epitopes at the interface of ricins enzymatic （RTA） and binding （RTB） subunits[J]. Toxins，2017，9（12）：378.