木薯MeLHCB4基因的克隆及表達分析

丁凱旋，鄭婉茹，李琳琳，潘月云，張銀東，耿夢婷，陳銀華

摘? 要：本研究采用RT-PCR技術(shù)克隆了木薯葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因MeLHCB4編碼區(qū)序列。通過生物信息學(xué)對其基因結(jié)構(gòu)、基因編碼蛋白的理化性質(zhì)等進行分析，并對不同物種的LHCB4氨基酸序列進行比對和構(gòu)建進化樹。結(jié)果表明，木薯MeLHCB4基因的CDs序列全長858 bp，編碼285個氨基酸，蛋白理論相對分子質(zhì)量約為30.9 kDa，理論等電點為5.47，該蛋白屬于穩(wěn)定的親水性蛋白，預(yù)測該蛋白可能定位于細胞核或細胞質(zhì)中。實時熒光定量PCR檢測該基因的表達模式發(fā)現(xiàn)，MeLHCB4基因主要在木薯葉片和莖中表達，受到茉莉酸甲酯（JA）、水楊酸（SA）和乙烯前體（ACC）等激素的誘導(dǎo)表達，推測其可能參與了JA、SA、ACC信號途徑。細菌性枯萎病病原菌侵染木薯葉片12 h后，MeLHCB4的表達量顯著提高，表明MeLHCB4參與了木薯對病原菌的響應(yīng)過程。

關(guān)鍵詞：木薯;葉綠素結(jié)合蛋白;MeLHCB4;基因克隆;基因表達

中圖分類號：S533? ? ? 文獻標(biāo)識碼：A

Cloning and Expression Analysis of MeLHCB4 from Cassava

DING Kaixuan1，2， ZHENG Wanru1，2， LI Linlin1，2， PAN Yueyun1，2， ZHANG Yindong1，2， GENG Mengting1，2*， CHEN Yinhua1，2

1. College of Tropical Crops， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Hainan Key Laboratory for Sustainable Utilization of Tropical Bioresources， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract： In this study， the MeLHCB4 coding region of cassava chlorophyll a-binding b binding protein gene was cloned by the RT-PCR technique. The structure of the gene and the physical and chemical properties of the protein encoded by the gene were analyzed by bioinformatics， and the LHCB4 amino acid sequences of different species were compared and the evolutionary tree was constructed. The results showed that the CDs sequence of cassava MeLHCB4 was 858 BP， encoding 285 amino acids， the theoretical molecular weight of the protein was about 30.9 kDa， and the theoretical isoelectric point was 5.47. The protein was a stable hydrophilic protein， and it was predicted that the protein might be located in the nucleus and cytoplasm. The expression pattern of MeLHCB4 was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. It was found that MeLHCB4 was mainly expressed in the leaves and stems of cassava， and was induced by hormones such as JA， SA and ACC， which was speculated to be involved in JA， SA， ACC signal pathway. After 12 hours of Xanthomonas axonopodis pv. manihotis infecting cassava leaves， the expression of MeLHCB4 increased significantly， indicating that MeLHCB4 was involved in the response process of cassava to pathogens.

Keywords： Manihot esculenta; chlorophyll binding protein; MeLHCB4; gene cloning; gene expression

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.10.009

捕光色素蛋白復(fù)合體主要由色素分子和其結(jié)合的葉綠素a/b結(jié)合蛋白組成[1-2]。植物中存在2類捕光復(fù)合體[3]，即LHCⅠ和LHCⅡ，分別位于光系統(tǒng)Ⅰ（PSI）和光系統(tǒng)Ⅱ（PSII）[4]。LHCII由Lhcb基因家族編碼，主要具有捕獲及傳遞光能、調(diào)節(jié)不同光系統(tǒng)中光能分配、光保護及過剩能量耗散及維持葉綠體中類囊體膜結(jié)構(gòu)的功能[5]。根據(jù)目前的研究結(jié)果，Lhcb基因家族包含Lhcb1～Lhcb8等8個亞家族[1]。在被子植物中，Lhcb亞家族包含Lhcb1～Lhcb7等7個亞類;在雙子葉植物中，Lhcb4還進化出一個新的亞類，即Lhcb8[6]。Lhcb基因家族成員除了參與光合作用，還廣泛參與植物的抗逆響應(yīng)[7-8]。

木薯（Manihot esculenta Crantz）是大戟科（Euphorbiaceae）多年生灌木狀植物，是世界三大薯類之一[9]。木薯作為熱帶和亞熱帶地區(qū)重要的糧食作物，同時也是一種可再生能源作物，其產(chǎn)品廣泛的分布在各行各業(yè)[10]。在生產(chǎn)上，細菌性枯萎病病害嚴重制約了木薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[11]。促分裂原激活蛋白激酶MeMAPK8是木薯免疫反應(yīng)PTI途徑的MAPK級聯(lián)通路的關(guān)鍵蛋白。本實驗室前期利用酵母雙雜交技術(shù)篩選獲得MeMAPK8的互作蛋白MeLHCB4，本研究利用RT-PCR技術(shù)克隆獲得MeLHCB4基因的編碼區(qū)并進行生物信息學(xué)分析，利用實時熒光定量PCR分析MeLHCB4在不同組織及響應(yīng)細菌性枯萎病病原菌侵染和植物激素信號通路的表達特征，以期為MeLHCB4的功能研究與利用提供參考依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

本研究采用的木薯品種為‘華南8號（SC8），由海南大學(xué)儋州校區(qū)木薯種質(zhì)資源圃提供。選取生長45 d左右木薯SC8幼苗為試驗材料，用于基因克隆、組織器官表達、激素和木薯細菌性枯萎病菌誘導(dǎo)表達分析，每個材料設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。

木薯幼苗不同處理試驗方法如下：（1）水楊酸（SA）、茉莉酸甲酯（JA）和乙烯前體（ACC）處理：分別使用2 mmol/L的SA、100 μmol/L的JA和2 mmol/L的ACC溶液噴施于木薯葉片，直至葉片滴水。于處理后0、0.5、1、2、4、6 h取木薯葉片。（2）XamHN11病原菌接種：XamHN11濃度調(diào)整為1×108 CFU/mL（OD600約為0.1），幼嫩葉片用2 mm無菌注射器注射接種，10 mmol/L MgSO4作為陰性對照。于接種后0、1、6、12、24 h取木薯葉片。

1.2? 方法

1.2.1? 木薯RNA提取和cDNA第一鏈合成? 取100 mg木薯新鮮葉片于液氮中充分研磨成細粉，轉(zhuǎn)移至RNase-FreeEp管中，加入1 mL TRIzol? Reagent試劑，立即渦旋振蕩混勻。室溫放置5 min。每1 mL TRIzol試劑添加0.2 mL氯仿，搖管15 s，室溫孵育2～3 min。4 ℃，12 000 ×g離心15 min。將上層水相轉(zhuǎn)移至新的無RNase的離心管。加入與水等體積的異丙醇，室溫孵育10 min，4 ℃，12 000 ×g離心10 min。棄上清，加入1 mL用DEPC水配制的75%乙醇洗滌總RNA沉淀。4 ℃，5000 ×g離心10 min，棄上清。室溫干燥5～10 min后用DEPC水溶解總RNA，保存于?80 ℃。采用Thermo Fisher Scientific公司cDNA第一鏈合成試劑盒RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（貨號：K1622），合成cDNA第一鏈。具體操作根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書。獲得的cDNA保存于?20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2? 目的基因克隆? 根據(jù)phytozome數(shù)據(jù)庫中獲得的MeLHCB4基因的序列信息，采用Premier 5.0軟件設(shè)計基因擴增引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物。上游引物序列：ATGGCTGCCTCCACAGCT，下游引物序列：TTAAGATGTCAAGTTATCAATAATGG。使用A9高保真酶和MeLHCB4基因擴增引物，以木薯總RNA反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增，克隆木薯MeLHCB4基因編碼區(qū)序列。PCR擴增體系如下：2×A9酶Mix 25 μL，10 mmol/L上下游引物各1 μL，木薯cDNA 2 μL，去離子水補足至50 μL。反應(yīng)程序設(shè)置如下：95 ℃預(yù)變性3 min;30個循環(huán)包括95 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s;最后72 ℃再延伸5 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測、凝膠回收試劑盒切膠回收，并克隆到pEASY-Blunt（TransGen，貨號：CB101）載體中，轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌Trans5α感受態(tài)細胞，菌落PCR檢測挑選可能的陽性克隆，雙酶切鑒定并送華大基因測序驗證。

1.2.3? MeLHCB4基因的生物信息學(xué)分析? 運用MEGA 5.0對木薯、擬南芥、巴西橡膠樹、麻瘋樹、蓖麻、番木瓜、苦瓜、甜瓜、可可樹、甜櫻桃等物種的LHCB4蛋白序列進行同源比對，鄰位相連算法構(gòu)建進化樹。采用GSDS（Gene Structure Display Server）對MeLHCB4基因結(jié)構(gòu)進行分析，分析MeLHCB4基因序列的內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)。利用在線預(yù)測軟件LocTree3對MeLHCB4基因的亞細胞定位進行生物信息學(xué)預(yù)測。MeLHCB4蛋白的生理生化性質(zhì)由在線網(wǎng)站ExPAsy站點工具Protparam（http：//web.expasy.org/ protparam/）分析。

1.2.4? MeLHCB4基因的表達模式分析? 提取木薯根、莖、葉、以及激素處理和木薯細菌性枯萎病菌接種不同時間的木薯總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用于MeLHCB4基因的表達模式分析。采用SYBR Premix Ex TaqTM II（TaKaRa公司）的熒光定量PCR試劑盒進行分析。熒光定量PCR反應(yīng)體系為10 μL：正、反向引物（10 mmol/L）各0.8 μL，模板cDNA 2.0 μL以及ddH2O 6.4 μL。熒光定量PCR引物，上游引物序列：AAGCAA GC CTACCTCAGACC，下游引物序列：CTGTATGG CTGGAACGGTGT。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性30 s;40個循環(huán)包括95 ℃變性5 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30s，最后72 ℃延伸5 min。每個樣品至少進行3次生物學(xué)重復(fù)。Ubq10基因作為參照基因，F(xiàn)：CACCTTGCATCTCGTTCTC，R：TCCGTCCTCTAGCTGCTTC。采用2?ΔΔCT法計算基因表達值。

2? 結(jié)果與分析

2.1? MeLHCB4基因的克隆

提取木薯SC8葉片RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用RT-PCR方法，以cDNA為模板，利用特異性引物擴增得到1條約800 bp的目的片段（圖1）。電泳條帶單一清亮，且大小與預(yù)期一致。將該電泳條帶切膠回收、TA克隆到中間載體pEASY- Blunt后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)、篩選陽性克隆測序分析。結(jié)果表明，擴增得到的序列全長858 bp，編碼285個氨基酸。將該基因命名為MeLHCB4

M：DL2000 DNA maker;1：MeLHCB4的擴增產(chǎn)物。

M： DL2000 DNA maker; 1： PCR product of MeLHCB4.

（GenBank登錄號：XP_021621616.1;Phytozome編號：Manes.08G091700.1）。

2.2? MeLHCB4蛋白的理化特性分析

木薯MeLHCB4蛋白進行理化性質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白分子式為C1400H2159N367O411S5，理論相對分子質(zhì)量（Mw）約為30.9 kDa，理論等電點（pI）約為5.47。蛋白組成中丙氨酸Ala（10.9%）、亮氨酸Leu（10.9%）、甘氨酸Gly（9.5%）含量相對較高，占全部組份30%以上。圖2所示，MeLHCB4蛋白的親水性平均系數(shù)為?0.109，脂溶指數(shù)84.98，蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為31.36，表明MeLHCB4蛋白為穩(wěn)定的親水性蛋白。通過LocTree3預(yù)測該蛋白可能定位于細胞核或細胞質(zhì)中。

負值表示親水性，正值表示疏水性。

Negative values： Hydrophilic; Positive values： Hydrophobicity.

2.3? MeLHCB4序列分析與多序列比對

多序列同源性比對結(jié)果表明（圖3），木薯MeLHCB4（XP_021621616.1）與多種植物L(fēng)HCB4蛋白均具有84%以上的同源性，與同屬大戟科的麻瘋樹JcLHCB4蛋白同源性高達94.39%。

MeLHCB4氨基酸序列分析表明（圖3），第60～257氨基酸序列為捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白保守域;第25～27、44～46、49～51、259～261氨基酸序列為潛在的蛋白激酶C磷酸化位點;第282～ 285氨基酸序列為潛在的N-糖基化位點;第35～ 40、66～71氨基酸為可能的N-肉豆蔻?；稽c;第101～104、108～111、160～163、217～220、278～281氨基酸為可能的酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點。

2.4? MeLHCB4系統(tǒng)進化分析

運用MEGA5.0的鄰接法（Neighbor-joining，

下劃線表示典型的捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白功能域;*表示蛋白激酶C磷酸化位點;▼表示N-肉豆蔻?；稽c;◇表示N-糖基化位點;▲表示酪蛋白激酶II磷酸化位點;McLHCB4：苦瓜，XP_022151483.1;CmLHCB4：甜瓜，XP_008449241.1;QsLHCB4：

栓皮櫟，XP_023894409.1;PaLHCB4：甜櫻桃，XP_021830340.1;JcLHCB4：麻瘋樹，XP_012087873.1;HbLHCB4：

巴西橡膠樹，XP_021652391.1;RcLHCB4：蓖麻，XP_002528105.1;CpLHCB4：番木瓜，XP_021888643.1;TcLHCB4：

可可樹，XP_007026729.1;AtLHCB4：擬南芥，OAP04488.1。

The underline represents typical chlorophyll a/b binding domain; * represents the phosphorylation site of protein kinase C; ▼ represents the N-myristoylation site; ◇ represents the N-glycosylation site; ▲ represents the casein kinase II phosphorylation site. McLHCB4： Momordica charantia， XP_022151483.1; CmLHCB4： Cucumis melo， XP_008449241.1; QsLHCB4： Quercus suber， XP_023894409.1; PaLHCB4： Prunus avium， XP_021830340.1; JcLHCB4： Jatropha curcas， XP_012087873.1; HbLHCB4： Hevea brasiliensis， XP_021652391.1; RcLHCB4： Ricinus communis， XP_002528105.1; CpLHCB4： Carica papaya， XP_021888643.1; TcLHCB4： Theobroma cacao， XP_007026729.1; AtLHCB4： Arabidopsis thaliana， OAP04488.1.

NJ）1000次自檢舉（Boot straping）構(gòu)建木薯MeLHCB4與其他10個植物L(fēng)HCB4的系統(tǒng)進化樹。結(jié)果表明（圖4），MeLHCB4蛋白與同屬于大戟科的幾種植物的LHCB4蛋白親緣關(guān)系很近，如麻瘋樹、巴西橡膠樹、蓖麻。表明LHCB4蛋白在大戟科植物中的進化上相對保守。

2.5? MeLHCB4基因的表達模式分析

MeLHCB4基因在木薯的根、莖、葉中的表達分析發(fā)現(xiàn)（圖5A），該基因在所有檢測部位中均表達，在葉片中表達量最高，其次為莖，在根中的表達量最低，僅為莖的1/5。表明MeLHCB4基因主要在莖葉中表達，具有組織特異性。采用木薯細菌性枯萎病菌XamHN11接種木薯SC8幼苗葉片，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖5B），接種后12 h，MeLHCB4基因的表達量極顯著提高，表明該基因可能參與了木薯對病原菌侵染初期的應(yīng)答途徑。

采用JA、SA、ACC等植物激素處理木薯葉片發(fā)現(xiàn)（圖5C），MeLHCB4基因被誘導(dǎo)表達

MeLHCB4：木薯;JcLHCB4：麻瘋樹;HbLHCB4：橡膠樹;RcLHCB4：蓖麻;QsLHCB4：栓皮櫟;TcLHCB4：可可樹;McLHCB4：苦瓜;CmLHCB4：甜瓜;CpLHCB4：番木瓜;PaLHCB4：甜櫻桃;AtLHCB4：擬南芥。

MeLHCB4： Manihot esculenta; JcLHCB4： Jatropha curcas; HbLHCB4： Hevea brasiliensis; RcLHCB4： Ricinus communis; QsLHCB4： Quercus suber; TcLHCB4： Theobroma cacao; McLHCB4： Momordica charantia; CmLHCB4： Cucumis melo; CpLHCB4： Carica papaya; PaLHCB4： Prunus avium; AtLHCB4： Arabidopsis thaliana.

100 μmol/L的JA處理0.5～4 h時，MeLHCB4基因的表達量沒有明顯變化，但是處理6 h后表達量急劇升高，為對照的60倍;2 mmol/L的SA處理后，MeLHCB4基因的表達快速被激活，處理后0.5 h表達量即升高3倍，而隨著時間的延長，表達量回到正常水平;2 mmol/L的ACC處理后0.5 h和1 h，MeLHCB4基因的表達量極顯著提高，隨著處理時間的延長表達量降低，但表達量仍顯著高于對照。這些結(jié)果表明MeLHCB4可能參與了JA、SA、ACC信號途徑。

3? 討論

LHCB蛋白作為光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）中的色素結(jié)合蛋白在植物光合作用中發(fā)揮重要作用。1975年LHCII最早被發(fā)現(xiàn)，LHCB蛋白由一個基因家族編碼，該家族成員最早于1981年在豌豆中被克隆，之后水稻、小麥、擬南芥等植物的Lhcb基因被陸續(xù)報道[1， 12-13]。研究表明LHCB蛋白不但參與了光合作用，還廣泛參與了植物對生物和非生物脅迫的響應(yīng)[14]。Liu等[15]通過研究水稻LHCB5，在通常情況下，會與PsbS（Photosystem Ⅱ subunitS，電子轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白）互作參與葉綠體電子傳遞過程。當(dāng)水稻受到稻瘟病菌入侵時，LHCB5 的第24位蘇氨酸發(fā)生磷酸化，LHCB5會加速向葉綠體積累，撇開PsbS獨自作用，導(dǎo)致葉綠體正常的電子傳遞受阻并大量積累，導(dǎo)致活性氧的迸發(fā)，調(diào)控了葉綠體內(nèi)的抗病相關(guān)基因表達，從而提高了

A：MeLHCB4基因在不同組織器官中的表達模式;B：木薯細菌性枯萎病菌XamHN11侵染下MeLHCB4基因的表達模式;C：不同激素處理下MeLHCB4基因表達模式分析;*表示差異顯著（P<0.05）;**表示差異極顯著（P<0.01）。

A： Expression pattern of MeLHCB4 in different tissues; B： Expression analysis of MeLHCB4 under the treatment of cassava bacterial

blight pathogen XamHN11; C： Expression analysis of MeLHCB4 under different treatment of hormone solutions;

* means significant difference （P<0.05）; ** mean extremely significant difference （P<0.01）.

水稻對稻瘟病菌的抗性。此研究表明LHCB蛋白的磷酸化是其調(diào)控植物抗病性的關(guān)鍵步驟。

本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，木薯PTI途徑的MAPK級聯(lián)通路中的促分裂原激活蛋白激酶MeMAPK8參與木薯對細菌性枯萎病病菌侵染的響應(yīng)。采用酵母雙雜交技術(shù)篩選獲得MeMAPK8的互作蛋白MeLHCB4。因此，本研究利用RT-PCR技術(shù)從木薯的葉片中克隆獲得MeLHCB4基因全長。該基因全長858 bp，編碼285個氨基酸，MeLHCB4蛋白分子式為C1400H2159N367O411S5，等電點約為5.47，MeLHCB4含有2個外顯子和1個內(nèi)含子。預(yù)測該蛋白可能定位于細胞核和細胞質(zhì)中，與同屬大戟科的麻瘋樹JcLHCB4蛋白同源性高達94.39%。表達分析顯示，木薯MeLHCB4基因在莖葉中的表達量明顯高于根，且在葉片中表達量約為莖中表達量的2倍，該基因在葉片中的表達最高，與鄒智等[16]研究表明的橡膠樹葉片中HbLhcb2表達量最高結(jié)果一致。MeLHCB4基因的表達具有組織特異性，可能在木薯葉片生長或免疫防御的過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，當(dāng)受到植物激素的誘導(dǎo)，MeLHCB4基因的表達都有不同程度的上調(diào)，與鄧永勝[17]研究表明SA能在短時間內(nèi)誘導(dǎo)番茄LeLhcb2基因的表達上調(diào)，且隨著處理時間的延長，基因的表達水平逐漸降低的結(jié)果一致。MeLHCB4基因的表達響應(yīng)植物激素JA、SA、ACC的誘導(dǎo)，表明該基因可能參與了相關(guān)激素的信號途徑與逆境脅迫的應(yīng)答。為了探究木薯MeLHCB4基因能否響應(yīng)病原菌的入侵，用木薯細菌性枯萎病菌XamHN11處理木薯SC8幼苗，結(jié)果表明基因表達顯著提高。筆者推測MeLHCB4與MeMAPK8參與了木薯對病原菌侵染初期的應(yīng)答途徑，在木薯抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及免疫中發(fā)揮重要作用。在下一步的研究工作中，將利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對MeLHCB4基因功能開展驗證。

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責(zé)任編輯：黃東杰